Name: A seguito in tempo reale limpatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Scopri il monitoraggio in tempo reale delle infezioni da Streptococcus pneumoniae utilizzando batteri bioluminescenti in un modello murino di polmonite acuta. Questo metodo permette di valutare la virulenza batterica e i fattori di fitness in vivo.

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La ricerca in laboratorio è stata sostenuta da sovvenzioni da parte del Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) e il Ministero federale dell&#39;Istruzione e della Ricerca (BMBF) Genomica Infezione Medical (FKZ 0315828A) a SH.

Gli esperimenti di infezione animale qui descritte devono essere eseguite in stretta conformità con la (ad esempio diritto europeo della Sanità della Federazione di animali da laboratorio Science Associations (FELASA)) locale e internazionale, linee guida e regolamenti per l&#39;uso di animali vertebrati. Gli esperimenti devono essere approvati dal consiglio etico locale e Istituzionale Comitato Animal Care. Tutti gli esperimenti con S. pneumoniae in laboratorio o le infezioni animali sono condotti in una classe II biosicurezza Cabinet. 1. Preparazione della infettiva stock di Bioluminescent Pneumocococi <ol><li> Preparare culture magazzino pneumococco in Todd-Hewitt brodo supplementato con 1% (w / v) di estratto di lievito e una concentrazione finale di glicerolo al 20% per la manutenzione a 80 ° C. </li><li> Piatto una piccola quantità di cultura magazzino pneumococcica surgelati su una piastra di agar sangue ed incubare i batteri per 10 ore a 37 ° C in 5% di CO 2. Tegli piastra di agar sangue contiene antibiotici appropriati come kanamicina (150 mcg / ml) per l&#39;inserimento della cassetta trasposone luxABCDE gene nel genoma. </li><li> Sub-coltivare una nuova colonia su una nuova piastra di agar sangue per un massimo di 10 ore. </li><li> Inoculare THY mezzo supplementato con 10% (v / v) inattivato con il calore (30 min a 56 ° C) di siero bovino fetale (FBS) con pneumococchi e iniziare la coltura ad una OD 600 di 0.05-0.07. </li><li> Incubare pneumococchi senza agitazione a 37 ° C e 5% di CO 2 fino alla cultura raggiunge un OD 600 di 0,35-0,40. La crescita avrà tra 3-4 ore. </li><li> Harvest pneumococchi per centrifugazione a 3.750 xg per 10 min e risospendere pneumococchi bioluminescente in tampone fosfato pH 7,4 (PBS) supplementato con 0,5% FBS. </li><li> Regolare l&#39;inoculo alla concentrazione desiderata in PBS/10% FBS. La dose infezione dipende dal ceppo pneumococcica utilizzato e il background genetico del microfonoe. Per infettare outbred CD-1 topi intranasale con S. pneumoniae D39 lux la dose di infezione deve essere regolato a 1 x 10 7 CFU in una sospensione di 20 microlitri integrate con 90 unità ialuronidasi. Non scuotere o vortice pneumococchi, dal momento che questo si innescherà autolisi. </li><li> Verificare la concentrazione di inoculo mediante placcatura 10 diluizioni seriali piega su agar sangue e la conta delle colonie dopo la crescita notte a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Verifica bioluminescenza dell&#39;inoculo pneumococcico misurando la bioluminescenza utilizzando un sistema di imaging ottico. </li></ol> 2. Intranasale e infezione intraperitoneale di topi con Bioluminescent pneumococchi <ol><li> Utilizzare topi femmina outbred in età di 7-10 settimane per la polmonite acuta e il modello di sepsi. Il peso di questi topi dovrebbe essere tra 20-30 g. </li><li> Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Preparare una miscela di 1,0 mgketamina e 0,1 mg xilazina in 100 microlitri sterile allo 0,9% (w / v) di cloruro di sodio per topi con un peso corporeo di 20 g. Questo è coerente con una dose di 50 mg / kg di peso corporeo per chetamina e 5 mg / kg di peso corporeo per xilazina. Per essere precisi, pesare i topi prima che l&#39;iniezione di anestetici. </li><li> Iniettare la miscela nella cavità intraperitoneale e posizionare gli animali nella gabbia fino a quando i anestetici agiscono e gli animali sono narcotizzata. La respirazione di topi sarà molto lento e regolare. I topi devono essere completamente narcotizzato, in modo che l&#39;inoculazione intranasale e l&#39;inalazione della sospensione batterica non comporteranno starnuti e, quindi, la perdita di inoculo. Questo può essere valutata pizzicando il mouse alla fine della loro coda, un mouse completamente narcotizzata mancherà di risposta. </li><li> Prendere delicatamente un topo narcotizzato e tenere premuto il mouse tra le dita e il pollice con il naso in posizione verticale (Figura 1). </li><li> Utilizzare una pipetta con lunghe punte strette (Gel LoaderTips) e rilasciare pneumococchi bioluminescente in più piccole gocce sulle narici (10 ml / narice) del mouse 26-29. Il mouse involontariamente inalare i batteri. Tenete il mouse 1-2 minuti in posizione verticale e osservare se il mouse starnutisce o mantiene l&#39;inoculo. </li><li> Infect 7-10 settimane di età topi CD-1 intranasale con una dose infezione di 1 x 10 7 o 7,5 x 10 7 pneumococchi del ceppo D39 e TIGR4, rispettivamente, per controllare l&#39;infezione in tempo reale. Il limite di rivelazione del sistema senza alcun assorbimento da parte del tessuto ospite è di circa 1 x 10 6 batteri bioluminescenti. </li><li> Infettare topi per via intraperitoneale (IP) per valutare e bioimmagini virulenza di pneumococchi in un modello di infezione del mouse sepsi. Usare 5 x 10 3 CFU in 100 ml di ceppo D39 e 1 x 10 4 di tensione TIGR4. I topi non sono anestetizzati utilizzando la via IP. </li><li> Seminare topi di controllo con PBS. <img alt="Figura 1" fo:content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 1. Infezione intranasale di topi CD-1 con S. pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . </li></ol> 3. Visualizzazione pneumococcico Diffusione in Lung and Blood uso del sistema di imaging Immagine diffusione di pneumococchi dopo l&#39;infezione intranasale di sesso femminile outbred topi CD1 in tempo reale utilizzando un sistema di imaging in vivo in. <ol><li> Accendere il sistema di imaging e avviare il software di analisi di immagine situata sul computer preconfigurated. </li><li> Il sistema di imaging inizializza automaticamente e la camera CCD è termoelettricamente raffreddata a 90 ° C prima di essere attivi. </li><li> Le impostazioni e binning dipendono dal numero di topi misuratasimultaneamente e sulla forza del segnale bioluminescente. Il campo di vista (FOV) per monitorare la bioluminescenza degli animali è variabile e l&#39;ingrandimento varia tra un FOV di 22,5 cm a misurare cinque topi, e un FOV di 3,9 cm a misurare un singolo mouse o parti dell&#39;animale come il torace o la testa. </li><li> Utilizzare regolarmente un tempo di esposizione di 1 min, un medio grado di binning, ed un FOV di 22,5 centimetri (serie D). In primo luogo, selezionare la modalità di imaging luminescenti e quindi impostare i parametri di imaging. </li><li> L&#39;emissione del segnale può dipendere dal ceppo batterico e ceppo di topi utilizzato, e il pigmento del mouse. Radere il petto di topi quando si utilizza ad esempio topi C57BL / 6, che può essere vantaggioso quando l&#39;imaging lo sviluppo di polmonite in questi topi. </li><li> Immagine topi infettati a intervalli di tempo prescelti. Misurare la bioluminescenza di topi nel modello polmonite acuta a intervalli di tempo di massimo 8-12 ore. Controllare anche il benessere dei topi infetti observing il loro aspetto, il comportamento e la determinazione della perdita di peso. </li><li> Anestetizzare topi nella camera narcotico del sistema anestesia dell&#39;apparecchiatura di imaging prima delle misurazioni nella camera. Inizia inalazione di una miscela di isoflurano e ossigeno e attendere i topi respirare lentamente e regolarmente. </li><li> Posizionare animali anestetizzati nella camera di imaging del sistema e tenere i topi in posizione supina. La telecamera CCD sulla parte superiore della camera di immagine sarà quindi il tratto respiratorio murino. </li><li> Posizionare gli animali con il loro naso in per tubi per consentire l&#39;inalazione di anestetici. </li><li> Isoflurano entrata nella camera di imaging mediante un tubo del gas è permesso di mantenere l&#39;anestesia. </li><li> Per attivare la fotocamera CCD sulla parte superiore della camera e per iniziare imaging ottico bioluminescente, premere &quot;Acquisizione&quot; nel software di imaging. Subito una fotografia dei topi nella camera chiusa appare sullo schermo. Dopo un minuto di<html> Misurazione una sovrapposizione dei dati bioluminescenza e la foto è mostrato. </li><li> Interrompere l&#39;anestesia dopo la sovrapposizione di immagini appare nella finestra del software e mettere i topi nelle loro gabbie. </li><li> I topi sono monitorati per il recupero. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Anestesia e monitoraggio dei topi infettati con pneumococchi bioluminescenti usando l&#39;anestesia IVIS e il sistema IVIS Spectrum, rispettivamente. A) Il sistema Spectrum IVIS imaging. B) Il sistema di anestesia IVIS con la camera di incubazione. C) I topi anestetizzati nella camera di incubazione . D) Mouse si trova all&#39;interno della camera di IVIS Spectrum Imaging con il loro naso inalare l&#39;anestetico._blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. </li></ol> 4. Quantificazione e valutazione della bioluminescenza di topi infettati con Bioluminescent S. pneumoniae <ol><li> Determinare le intensità bioluminescenza dei topi o di una regione selezionata dei topi quantificando l&#39;emissione di fotoni totale (fotoni / sec) utilizzando il software di analisi di immagine. </li><li> Utilizzare i valori della emissione di fotoni che sono forniti in un foglio dati Excel per preparare un grafico. Poiché la variazione di dati è spesso elevato nei topi raggruppati, generare un grafico casella basette per visualizzare le differenze di topi infettati con i diversi ceppi di pneumococco. </li><li> Fornire i fotoni per topi o in alternativa i risultati come la media di radianza (fotoni / sec / cm 2 / sr) di un&#39;area selezionata. </li><li> I dati di misura di ROI (regione di interesse) in modalità di fotoni possono essere quantitativamente confronto tra i diversi sistemi di imaging in vivo con diversi venutoimpostazioni ra, in quanto le misure in unità di radianza tengono automaticamente conto delle impostazioni della fotocamera (ad esempio il tempo di integrazione, binning, f / stop, e il campo di vista). </li></ol>

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<li>Voss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choline-binding+protein+PspC+of+Streptococcus+pneumoniae+interacts+with+the+C-terminal+heparin-binding+domain+of+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li>
<li>Cartwright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+disease+in+western+Europe%3A+burden+of+disease%2C+antibiotic+resistance+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management.</a> Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).</li>
<li>vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Brehm,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Tutti gli esperimenti condotti su animali devono essere approvati dalle autorità locali e di etica commissioni. In esperimenti di infezione in vivo la carica batterica nelle varie nicchie che ospitano animali infetti deve essere determinato in vari momenti dopo l&#39;infezione. In queste condizioni sperimentali, gli animali devono essere sacrificati prima che l&#39;isolamento dei batteri dal sangue, rinofaringe, il lavaggio bronchoalvelar o organi come i polmoni, milza e cervello. Per calcolare il numero ...

Infezioni del tratto respiratorio causate da virus o batteri rimangono uno dei problemi acquisite in comunità o cliniche più comuni in tutto il mondo provocando circa un terzo di tutte le morti in tutto il mondo. Le specie batteriche chiave sono Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae 2. Tuttavia, queste specie batteriche sono normalmente costituenti comuni delle naturali flora del tratto respiratorio. Così carrozza batterica è anche di certo rischio di malattia invasiva e seconda dello stato immunitario o predisposizioni degli individui. La colonizzazione asintomatica è attivato per infezioni invasive. Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale della polmonite acquisita in comunità (CAP) e una delle più comuni cause di batteriemia negli esseri umani. Negli individui sani S. pneumoniae (pneumococco) sono spesso colonizzatori asintomatici e innocuo del tratto respiratorio superiore, dove si trovano a confrontarsi con i batteri non patogenidella flora residente, ma anche con agenti patogeni come Haemophilus spp. o Staphylococcus aureus e la prima linea di difesa del sistema immunitario umano. Tariffe di spedizione sono più alti nei bambini (37%) e persino più alto in centri diurni affollati (58%), 3-5. La popolazione più giovane e gli anziani, ricevendo il pneumococco via di trasmissione per aerosol da vettori e secrezioni naso-faringei 6, appartengono ai gruppi ad alto rischio e la vaccinazione utilizzando uno dei vaccini pneumococcico coniugato (PCV10 o PCV13 nei bambini e 23-valente polisaccaridico PPSV23 negli adulti) è raccomandato negli Stati Uniti (US) e molti paesi europei 4. Il PPSV23 copre sierotipi responsabili di ~ 90% delle malattie pneumococciche batteriemia negli Stati Uniti e in Europa, prevenzione delle malattie pneumococciche così efficiente invasive (IPD) negli adulti, mentre i PCVs coprono i sierotipi più frequenti nei bambini. Di conseguenza, IPD a causa di tipi di vaccino (VT) sono ridusierotipi non vaccinali CED ma che mostrano un alto potenziale di virulenza e di resistenza agli antibiotici sono emerse 4,7-12. Il rinofaringe come il serbatoio è il punto di partenza per pneumococchi a diffondersi i seni o le orecchie di mezza avvio infezioni locali nocivi. Più importante, pneumococchi diffondere direttamente attraverso le vie respiratorie di bronchi e del polmone con conseguente pericolo di vita CAP 4,13. Infezioni polmonari sono spesso accompagnate con il tessuto e distruzione barriera, permettendo così al patogeno di diffondersi nel sangue e causando IPD. L&#39;incidenza di PAC e IPD sono più elevati nei soggetti immunocompromessi o agli estremi di 4,13 anni. Le circostanze responsabili per la conversione da un commensale con un patogeno con elevata virulenza sono ancora in discussione. Tuttavia, oltre a cambiamenti nella suscettibilità dell&#39;ospite e adattamento evolutivo accompagnato con maggiore virulenza e l&#39;aumento delle resistenze agli antibiotici sono stati suggeriti per avere un impatto cruciale sul pneinfezioni umococcal 14-16. L&#39;agente patogeno è dotato di una molteplicità di adesine che mediano contatto intimo alle cellule della mucosa epiteliali. Dopo aver superato il muco delle vie respiratorie, l&#39;adesione pneumococcica alle cellule ospiti è facilitato tramite interazioni dirette di adesine-superficie esposta con recettori cellulari e sfruttando componenti della matrice extracellulare o proteine ​​del siero come colmare le molecole 4,17,18. Agenti patogeni come versatili pneumococchi sono anche dotati di fattori coinvolti in evasione dei meccanismi di difesa dell&#39;ospite immunitario. Inoltre, essi hanno la capacità di adattarsi a diversi ambienti host quali il polmone, del sangue e del liquido cerebrospinale (CSF), rispettivamente, 5,17,19,20. L&#39;impatto dei fattori batterici sulla patogenesi e di accoglienza infiammatoria risposte è studiato in modelli animali sperimentali di polmonite, batteriemia o meningite 21-25. Pur essendo un agente patogeno umano, questi modelli sono noill-istituito per decifrare tropismo tissutale pneumococco, meccanismi di virulenza, o protectivity dei candidati vaccino pneumococcico. Il background genetico dei ceppi inbred topo determina la suscettibilità di pneumococchi. Topi BALB / c intranasale infettate con pneumococchi sono risultati essere resistenti, mentre CBA / Ca e SJL topi erano più suscettibili contro le infezioni pneumococciche 22. Ciò implica che, simili agli esseri umani, il background genetico e dei meccanismi di difesa dell&#39;ospite determinano il risultato dell&#39;infezione. Pertanto, sono necessari ulteriori sforzi per svelare la resistenza loci nel genoma dei topi meno suscettibili alle infezioni da pneumococco. I risultati hanno portato a cambiamenti in vivo protocolli di virulenza in. Invece dei consanguinei topi BALB / c, spesso utilizzate in passato, i altamente sensibili CD-1/MF1 ceppi outbred topi sono oggi spesso utilizzati per studiare l&#39;effetto di virulenza pneumococcica o idoneità perdita-di-funzione di fattori 26-28. Inoltre, la disponibilitàdi pneumococchi bioluminescenti e tecniche di imaging ottico permette la bioluminescenza bioimmagini in tempo reale delle infezioni. In pneumococchi la cassetta genica luxABCDE ottimizzato (plasmide Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) è stata inserita in un sito di integrazione singola del cromosoma da trasposone mutagenesi. Pneumococchi bioluminescenti sono stati impiegati per valutare l&#39;attenuazione dei mutanti di pneumococco con deficit di virulenza o di idoneità fattori e la loro traslocazione da un sito anatomico all&#39;altro 26,28-31. Qui forniamo un protocollo per la bioimmagini di infezioni pneumococciche in una polmonite o modello murino di sepsi. Amplificazione e diffusione di pneumococchi bioluminescente in topi infettati per via intraperitoneale, intranasale o possono essere facilmente monitorati nel tempo utilizzando un sistema di imaging ottico e lo stesso animale a tempi diversi.

<table><tbody><tr><td>Todd Hewitt brodo</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>X936.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>2363.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre di agar sanguigno</td><td>Oxoid, Wesel, Germania</td><td>PB5039A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>T832.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germania</td><td>E6376</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>PAA Laboratories, Coelbe, Germania</td><td>A11-151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Topi CD-1, femmina</td><td>Charles River, Sulzfeld, Germania</td><td>CD1SIFE06W08W</td><td>topi CD-1 femmine, da sei a otto settimane di età</td></tr><tr><td>Ketamin 500 mg, soluzione iniettabile Curamed</td><td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germania</td><td></td><td>.</td></tr><tr><td>Rompun 2%, soluzione iniettabile</td><td>Bayer Animal Health, Monheim, Germania</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BD Plastipak Siringhe da 1 ml</td><td>Becton Dickinson, Heidelberg, Germania</td><td>300015</td><td>siringhe Luer-Lok sterili con ago</td></tr><tr><td>Punte per caricatore di gel</td><td>PeqLab</td><td>81-13790</td><td>M&micro; ltiFlex Tips</td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884-100mg</td><td>Ialuronidasi Tipo IV-S da test bovino</td></tr><tr><td>Ossigeno</td><td>Aria Liquida, D&uuml; sseldorf, Germania</td><td>M1001L50R2A001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter, Unterschlei&szlig; heim, Germania</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy</td><td>Promega, Mannheim, Germania</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi&nbsp;</td><td>Eurofins MWG, Ebersberg, Germania</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Qiaprep Spin Midiprep&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>27104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di purificazione del DNA per PCR</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>28106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image 4.1 software</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germania</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinza per sistema di anestesia a gas XGI-8</td><td>Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germania</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema di imaging a spettro IVIS&nbsp;</td><td>Calibro Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germania</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biofotometro</td><td>Eppendorf AG, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

La polmonite è uno dei principali problemi sanitari in via di sviluppo e paesi industrializzati ed è associata ad una considerevole morbilità e mortalità. Nonostante i progressi nella conoscenza di questa malattia, la disponibilità di unità di terapia intensiva (ICU), e l&#39;uso di agenti antimicrobici potenti e vaccini efficaci, i tassi di mortalità restano elevati 1. Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale della polmonite acquisita in comunità (CAP) e una delle cause più comuni di batteriemia nell&#39;uomo. Questo patogeno è dotato di un armamentario di adesine-superficie a vista e fattori di virulenza che contribuiscono alla polmonite e malattia pneumococcica invasiva (IPD). La valutazione del ruolo in vivo di fattori di forma fisica o di virulenza batterica è della massima importanza per svelare S. meccanismi di patogenicità pneumoniae. Modelli murini di polmonite, batteriemia e meningite vengono utilizzati per determinare l&#39;impatto dei fattori pneumococco a difrenti fasi dell&#39;infezione. Qui si descrive un protocollo per il monitoraggio in tempo reale diffusione pneumococcica nei topi dopo intranasale o infezioni intraperitoneale con batteri bioluminescenti. I risultati mostrano la moltiplicazione e la diffusione di pneumococchi nel tratto respiratorio inferiore e sangue, che può essere visualizzata e valutata utilizzando un sistema di imaging e il software di analisi di accompagnamento.

L&#39;acquisizione e l&#39;assorbimento della metionina è di importanza centrale per pneumococchi per mantenere la forma fisica nella loro nicchia ospitante 32,33. La metionina ABC trasportatore lipoproteina è codificato in D39 dal DOCUP 0151 _ gene (TIGR4: sp_0149) e nominato MetQ 32. Pneumococchi ulteriormente produrre enzimi della biosintesi della metionina (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, mete e MetF). La mancanza di metionina in un mezzo chimicamente defini...

Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale che causa una grave polmonite acquisita in comunità e responsabile per oltre 2 milioni di decessi in tutto il mondo. L&#39;impatto dei fattori batterici implicati in palestra o virulenza può essere monitorato in tempo reale in un mouse polmonite o batteriemia modello acuta con batteri bioluminescenti.

A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire in tempo reale un'infezione da streptococcus pneumoniae in un modello di polmonite o sepsi aurin. Questo viene ottenuto preparando una dose infettiva di streptococcus pneumoniae dopo la coltivazione in mezzo complesso THY. Il secondo passaggio consiste nell'infezione intranasale o intraperitoneale di topi con streptococcus pneumoniae.L'ultimo passaggio consiste nella quantificazione dell'intensità della bioluminescenza nei topi, o in una regione selezionata dei topi, al fine di determinare l'emissione totale di fotoni. In definitiva, le intensità di bioluminescenza in un gruppo di topi mostrano le variazioni dell'infezione nel tempo. Inoltre, viene effettuata l'analisi delle singole immagini di topi bioluminescenti.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la determinazione del carico batterico nel polmone o in diversi tessuti, è che consente di seguire l'infezione in atto utilizzando un solo animale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla ricerca di base, poiché essa può essere applicata anche per valutare l'efficacia di fattori batterici e di agenti anti-infettivi. Questo metodo può fornire informazioni su questo gruppo di promossi Cox nei topi.È possibile applicarlo anche ad altri sistemi, come la determinazione del carico batterico negli organi. In generale, i ricercatori troveranno semplice imparare questo metodo poiché l'utilizzo del sistema di bioimmagine è intuitivo e sono disponibili software per preparare le immagini. Ebbi immediatamente l'idea di applicare questo metodo negli esperimenti di infezione con bios e ossido primitivo quando venni introdotto al sistema di bioimmagine.La dimostrazione di questo metodo è cruciale a causa della manipolazione speciale richiesta per gli animali e poiché passaggi critici come l'inoculazione sono difficili da spiegare. Iniziare preparando una riserva di pneumococchi bioluminescenti infettivi come descritto nel protocollo testuale. Quindi inoculare un tubo contenente 40 millilitri di mezzo THY integrato con FBS con i pneumococchi, e avviare una coltura a un OD 600 di 0,08. Incubare i pneumococchi senza agitazione a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre o quattro ore, fino a quando la coltura raggiunge un OD 600 compreso tra 0,35 e 0,40.Quindi raccogliere i pneumococchi mediante centrifugazione a 3.750 ×g per sei minuti. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet batterico in circa un millilitro di PBS a pH 7,4, integrato con 0,5% di FBS, e regolare l'inoculo alla concentrazione desiderata in una sospensione di 20 microlitri di PBS con 10% di FBS e 90 unità di ialuronidasi.Non agitare né vortexare i pneumococchi, poiché ciò indurrebbe l'autolisi. Successivamente, utilizzare un sistema di imaging ottico per verificare la bioluminescenza del pneumococco oulu. Anestetizzare un topo femmina outbred di sette-dieci settimane mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Verificare la profondità adeguata dell'anestesia pizzicando la coda.Una volta che il topo è completamente anestetizzato, tenerlo tra le dita e il pollice con il muso rivolto verso l'alto. Quindi, utilizzando una pipetta con una punta lunga e stretta, depositare 10 microlitri di pneumococchi bioluminescenti su ciascuna narice. Il topo inala involontariamente i batteri.Tenere il topo in posizione verticale per uno o due minuti per osservare se starnutisce o mantiene l'inoculo. Completare. È necessario assicurare l'inalazione della dose infettiva in modo che il topo inali la dose infettiva selezionata. Pertanto, il topo deve respirare lentamente e regolarmente.Evitare che il topo starnutisca e che parte della dose infettiva vada perduta. Dopo un'inoculazione riuscita, segnare la coda per un successivo riconoscimento e posizionare il topo in una nuova gabbia.Successivamente, per valutare la virulenza in un modello di infezione da sepsi, iniettare 100 microlitri di una ceppo di pneumococco per via intraperitoneale in un topo anestetizzato. Dopo aver segnato la coda, restituire il topo in una gabbia immagine come controllo. Iniettare un altro gruppo di topi con PBS per imaging.La disseminazione dei pneumococchi viene effettuata mediante software di analisi delle immagini. Per prima cosa, impostare la modalità di acquisizione sull'immagine luminiscente, quindi configurare i parametri di acquisizione come segue. Impostare il tempo di esposizione su un minuto.Un grado medio di binning e un campo visivo (FOV) di 22,5 centimetri. Anestetizzare i topi nella camera di anestesia dell'apparecchiatura di imaging con una miscela di iso, fluoro e ossigeno. Quando i topi respirano lentamente, posizionarli nella camera di imaging in posizione supina, con il naso inserito in tubi collegati al sistema di anestesia.Per attivare la telecamera CCD posizionata sulla parte superiore della camera e iniziare l'acquisizione ottica bioluminescente, premere immediatamente il pulsante "acquire" nel software di imaging. Sullo schermo appare una fotografia dei topi all'interno della camera chiusa. Dopo un minuto di misurazione, viene mostrata una sovrapposizione dei dati di bioluminescenza e della fotografia.Ora interrompere l'anestesia circa 20 secondi prima della fine dell'esposizione. Rimettere i topi nella loro gabbia e lasciarli riprendere completamente dall'anestesia prima di reinserire la gabbia nel rack. Continuare a eseguire l'acquisizione di immagini nei topi infetti ogni otto-dieci ore, oltre a monitorarne l'aspetto, il comportamento e il peso.Infine, utilizzare il software di analisi delle immagini per determinare le intensità della bioluminescenza per ogni punto temporale e gruppo di topi, quantificando l'emissione totale di fotoni. Le immagini ottiche bioluminescenti di topi infettati per via intranasale con D 39 lux o con il mutante isogenico D 39 luxe delta MET Q sono mostrate qui. L'acquisizione delle immagini è iniziata 24 ore dopo l'infezione ed è proseguita ogni otto ore fino alla morte o fino a 120 ore dopo l'infezione per ciascun gruppo. Sette topi su 10 hanno sviluppato segni gravi di malattia ed sono morti, mentre gli altri tre topi non hanno mostrato bioluminescenza e sono sopravvissuti.Si noti che la scena di bioluminescenza in due dei topi è in realtà un effetto di spillover dalla bioluminescenza intensa nei topi adiacenti. I topi infettati con successo dal ceppo selvatico bioluminescente D 39 lux hanno sviluppato un'infezione polmonare grave 32 ore dopo l'infezione, che è progredita tra le otto e le 16 ore successive a sepsi. Tutti i topi che hanno sviluppato polmonite e sepsi dopo l'infezione con D 39 lux erano deceduti entro 96 ore dall'infezione.La perdita della funzione della lipoproteina legante la metionina ha compromesso significativamente la virulenza dei pneumococchi. Dopo 32 ore, un solo topo infettato con il mutante mEq mostrava un'infezione polmonare lieve, rispetto alle infezioni riscontrate in tutti i topi D 39 lux suscettibili. Tuttavia, dopo 48 ore, infezioni polmonari gravi sono diventate evidenti nei topi infettati con il mutante.Di conseguenza, questi topi hanno sviluppato sepsi 72 ore dopo l'infezione e sono diventati più abbondanti successivamente alle 72 ore post-infezione, dimostrando che nel modello di infezione da polmonite acuta, la carenza di met Q attenua lo pneumococco. I valori delle intensità della bioluminescenza nei gruppi di topi sono mostrati per i punti temporali indicati. La quantificazione del flusso bioluminescente ha mostrato differenze significative tra i topi infettati con ceppo wild type e quelli infettati con met q a 32 e 40 ore dopo l'infezione.Pertanto, la perdita di funzione di met q attenua lo pneumococco e determina un significativo ritardo nell'infezione invasiva, ma non porta alla comparsa di batteri virulenti una volta acquisita. Questa tecnica può essere utilizzata per monitorare 10 gruppi di quattro topi nell'arco di un'ora, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che l'inalazione sia completa e avvenga effettivamente nei topi. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti anche altri metodi, come la co-infezione nei topi, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio riguardo ad attenuazioni lievi e mutanti batterici, dopo lo sviluppo della tecnica.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle infezioni per esplorare e visualizzare la polmonite o la sepsi pneumococcica nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare i topi e seguire in tempo reale l'infezione pneumococcica utilizzando un sistema di bioimmagine. Non dimenticare che lavorare con batteri patogeni per l'uomo come *Streptococcus pneumoniae* può essere pericoloso e che è necessario adottare precauzioni, come operare sotto una cappa di sicurezza di classe due, durante l'esecuzione di questa procedura.

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