Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare i piani di ghiaccio legati da proteine antigelo marcate in fluorescenza. Ciò si ottiene coltivando singoli cristalli di ghiaccio a cui le proteine antigelo possono legarsi in un secondo momento. Ogni cristallo viene osservato attraverso polarizzatori incrociati per stabilirne la singolarità e l'orientamento.

Successivamente, un cristallo di ghiaccio viene montato su un dito freddo a temperatura controllata e formato in un emisfero. Viene quindi immerso in una soluzione di proteine antigelo marcate in fluorescenza per assorbire la proteina antigelo su specifici piani di legame dell'emisferico in crescita. I risultati del ghiaccio sono ottenuti visualizzando e visualizzando il ghiaccio legato da una proteina antigelo marcata in fluorescenza, utilizzando luce e filtri specifici per lunghezza d'onda in una cella frigorifera buia.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'incisione del ghiaccio, è che le proteine antigelo sono marcate in fluorescenza Per consentire la visualizzazione immediata dei piani di ghiaccio legati alle proteine, iniziare la crescita dei cristalli preparando un bagno di glicole etilenico a temperatura controllata a meno 0,5 gradi Celsius e trovando una padella di metallo pulita che si inserisce e può galleggiare su di essa. I cristalli vengono formati in stampi. Utilizzare stampi cilindrici alti da tre a quattro centimetri tagliati da un tubo di cloruro di polivinile.

Ogni stampo dovrebbe avere una tacca di un millimetro di larghezza e due millimetri di altezza su un lato. Applicare un leggero strato di grasso sottovuoto sul lato dell'anello da cui è stata tagliata la tacca. Sigillare questa superficie dentata unta sulla padella di metallo con la tacca orientata lontano dal centro della padella.

Assicurarsi di non riempire o ostruire le tacche con grasso. Preparare il maggior numero possibile di stampini nella padella. Quindi, aggiungere il Degas filtrato e l'acqua deionizzata al centro della padella all'esterno degli stampi.

Fare attenzione a non introdurre bolle. Quando lo strato d'acqua viene sollevato a cinque millimetri, l'acqua dovrebbe entrare lentamente negli stampi attraverso le tacche. Al termine, posizionare la padella perfettamente a livello nel bagno di glicole etilenico.

Dopo che la padella e l'acqua hanno raggiunto meno 0,5 gradi Celsius, aggiungi un pezzetto di ghiaccio al centro della padella all'esterno degli stampini. Incubare durante la notte per formare uno strato di ghiaccio nei prossimi tre giorni. Rimettere nella vasca da bagno per aggiungere acqua agli stampi.

Depositare 13 millilitri di quattro gradi Celsius, Degas e acqua deionizzata in ogni stampo. Una volta al giorno dopo aver aggiunto l'acqua, ridurre la temperatura del bagno di glicole etilenico. Entro il quarto giorno, gli stampini dovrebbero essere completamente riempiti di ghiaccio.

Recupera gli stampi e prepara una superficie pulita per il ghiaccio. Estrarre ogni stampo dalla padella e spingere fuori il cristallo di ghiaccio. Mettere la superficie pulita con gli stampini in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per un'ora.

Prima della manipolazione. Quando il ghiaccio è pronto, portalo in una cella frigorifera o in una cella frigorifera per determinare se si tratta di un singolo cristallo. Posiziona il ghiaccio tra due polarizzatori incrociati.

Se il ghiaccio è un singolo cristallo, non dovrebbero essere visibili crepe o discontinuità e la direzione della luce non dovrebbe cambiare all'interno del cristallo. Con il polarizzatore ancora in posizione, determinare l'orientamento dell'asse C osservando la luce trasmessa quando il ghiaccio viene ruotato. Per determinare l'orientamento degli AE A, avvolgere strettamente il ghiaccio in un foglio di alluminio.

Orienta un ago perpendicolarmente all'asse del mare e fai un piccolo foro attraverso la lamina e nel ghiaccio. Quindi, metti il ghiaccio nel vuoto da 0,5 millibar per 20 minuti. Una volta recuperato il cristallo, scoprilo nella cella frigorifera.

Osservare l'incisione esagonale sul piano basale. Gli AE A attraversano i vertici della stella a sei punte. Questo cristallo sarà tagliato a metà lungo una linea parallela ai punti opposti della stella.

Per esporre un piano del prisma primario, tenere saldamente il cristallo su un banco. Usa un seghetto per tagliare il cristallo a metà. Raccogli i pezzi per il montaggio con un dito freddo.

Il cristallo di ghiaccio deve essere ulteriormente preparato per il montaggio su un dito freddo, trovare due aste di alluminio con diametri leggermente diversi, ma di dimensioni paragonabili al dito freddo. Alternare l'uso delle aste per fondere una cavità nella parte superiore del fermo del cristallo quando c'è una cavità in cui il dito freddo può entrare. Raffreddare il dito freddo a meno 0,5 gradi Celsius e posizionarlo nella cavità del ghiaccio.

Tieni il cristallo in posizione finché non si congela sul metallo. Quindi, riempi una tazza emisferica con circa il doppio del diametro del cristallo di ghiaccio con acqua deionizzata filtrata raffreddata a quattro gradi Celsius. Immergere il cristallo di ghiaccio freddo legato con le dita nella tazza, rimuovere l'acqua in eccesso in modo che la parte superiore del cristallo di ghiaccio sia approssimativamente a livello del liquido e il ghiaccio non si tocchi.

Le pareti della tazza coprono la tazza con un isolamento e abbassano la temperatura a meno cinque gradi Celsius. Lasciare che il ghiaccio formi una semisfera per circa un'ora. Preparati ad aggiungere la proteina fluorescente.

Quando l'emisfero è pronto. Rimuovere il cristallo di ghiaccio dalla tazza, rimuovere l'acqua dalla tazza. Quindi aggiungere da 25 a 30 millilitri di soluzione proteica marcata in fluorescenza preraffreddata alla concentrazione desiderata.

Mantenendo invariato il volume totale del liquido, immergere il cristallo di ghiaccio nella tazza. Di nuovo. Assicurati che la parte superiore del cristallo sia a livello del liquido e non tocchi le pareti della tazza. Abbassa la temperatura del dito freddo a meno otto gradi Celsius e lascia che la soluzione proteica si congeli nel cristallo per due o tre ore.

Arresta la crescita del ghiaccio quando si sono formati almeno cinque millimetri di ghiaccio dalla soluzione proteica. Con il dito freddo ancora attaccato, rimuovere il cristallo di ghiaccio dalla tazza. Staccare il dito freddo riscaldando il liquido di raffreddamento a poco più di zero gradi Celsius.

Aspetta che il cristallo di ghiaccio si sciolga. Quando il cristallo si scioglie dal dito freddo, posizionalo con il lato piatto rivolto verso il basso su una superficie pulita. Fare attenzione a non toccare il ghiaccio appena formato.

Conservare il cristallo a meno 20 gradi Celsius per almeno 20 minuti Prima di procedere alla visualizzazione del lavoro di fluorescenza in una cella frigorifera che può essere oscurata. Preparare le lampade con filtri di eccitazione specifici per lunghezza d'onda per eccitare l'etichetta fluorescente e i filtri di emissione della fotocamera. Per bloccare la luce non specifica, posizionare il lato piatto del ghiaccio rivolto verso il basso sotto le lampade, oscurare la stanza e osservare i motivi nel ghiaccio illuminato.

Per stimare i piani di ghiaccio che sono legati dalle proteine antigelo, confrontare un'immagine di incisione del ghiaccio tradizionale con quella del corrispondente piano di ghiaccio basato sulla fluorescenza L'analisi di affinità utilizzando trixy mostra entrambe le proteine antigelo di tipo uno prodotte dalla passera di mare invernale pseudo pectus Americana. La tecnica può essere utilizzata per confrontare simultaneamente i modelli di legame del ghiaccio di diverse proteine antigelo. In questo caso, Pacific Blue ha marcato la proteina antigelo di tipo tre NFEA FP otto e la proteina antigelo di tipo uno marcata con trixy.

Questo è il risultato della visualizzazione solo del tipo tre N-F-E-A-F-P otto, qui solo la proteina antigelo di tipo uno è visualizzata in questa immagine. I due vengono visualizzati insieme. Si noti che l'asse C è lo stesso per ogni immagine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare e orientare singoli cristalli di ghiaccio e utilizzare l'analisi di affinità del ghiaccio basata sulla fluorescenza per valutare i modelli di legame del ghiaccio di proteine antigelo marcate in fluorescenza.