Name: Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-15T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Scopri l'analisi dell'affinità dei piani del ghiaccio basata sulla fluorescenza per visualizzare i piani di legame delle proteine antigelo. Questo metodo consente di osservare le interazioni proteina-ghiaccio in cristobiochimica.

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PLD detiene la Canada Research Chair in Ingegneria proteica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research alla PLD. Questo lavoro è stato anche supportato da un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (n. 23310171) e del Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Siamo grati ai dottori Chris Marshall e Mike Kuiper per il lavoro pionieristico che ha portato alla FIPA. Siamo anche grati al Dr. Sakae Tsuda per aver fornito strutture per parte di questo lavoro e al Dr. Laurie Graham per aver istituito i filtri per l'eccitazione della luce fluorescente e le emissioni.

1. Cristalli di ghiaccio singoli in crescita
<ol><li>Prendi una padella metallica pulita (15 cm di diametro, alta 4,5 cm) che si adatta e può galleggiare su un bagno di raffreddamento del glicole etilenico.</li>
	<li>Preparare stampi cilindrici in cloruro di polivinile (PVC), (diametro 4,5 cm, alto 3-4 cm, spessore 4 mm), segando sezioni da un tubo.<ol>
<li>Tagliare una tacca (1 mm di larghezza, 2 mm di altezza) su un lato (Figura 1A).</li>
		<li>Preparare tutti gli stampi che possono adattarsi comodamente alla padella (Figura 1B). Nota: Uno studio ha dimostrato che l'alcol polivinilico (PVA) può influenzare la nucleazione delghiaccio 22. Tuttavia, nel nostro sistema in PVC a stampo aperto non abbiamo riscontrato problemi di formazione di ghiaccio atipici.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicare una pellicola leggera di grasso sottovuoto sull'anello superficiale inferiore di ogni stampo, che è la superficie con la tacca ritagliata. Sigillare questa superficie unta e dentellata su una padella metallica con le tacche orientate lontano dal centro della padella. Fare attenzione a non riempire o ostruire le tacche con grasso.</li>
	<li>Aggiungere acqua filtrata e degassata/deionizzata da 0,22 μm al centro della padella, ma al di fuori degli stampi, e lasciare che l'acqua entri lentamente negli stampi attraverso le tacche. Fare attenzione a non introdurre bolle. Lo strato d'acqua dovrebbe essere profondo circa 5 mm.</li>
	<li>Mettere la padella in un bagno di glicole etilenico a temperatura controllata raffreddato a -0,5 °C. La padella dovrebbe essere perfettamente livellata. Aggiungere pesi di zavorra ai lati della padella, se necessario.</li>
	<li>Dopo che la padella e l'acqua hanno raggiunto -0,5 °C, aggiungere un piccolo pezzo di ghiaccio al centro della padella, al di fuori degli stampi.<ol>
<li>Ciò nucleerà la crescita del ghiaccio nell'acqua superraffredata attraverso la padella e negli stampi. La piccola tacca nella parte inferiore di ogni stampo consente a un solo cristallo di ghiaccio di propagarsi, risultando in un singolo cristallo di ghiaccio in ogni stampo.</li>
		<li>Incubare durante la notte per formare uno strato di ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nei tre giorni successivi aggiungere 13 ml di acqua degassata/deionizzata a 4 °C a ciascuno stampo una volta al giorno e far scendere la temperatura del bagno di glicole etilenico dopo ogni aggiunta a -0,8 °C il primo giorno, a -1,1 °C il secondo giorno e a -1,5 °C il terzo giorno.<ol>
<li>Incubare a quelle temperature durante la notte.</li>
		<li>Entro il quarto giorno, gli stampi dovrebbero essere completamente riempiti di ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre gli stampi dalla padella, spingere i cristalli di ghiaccio fuori dai stampi e conservare su una superficie pulita, come una barca di pesatura, in un congelatore a -20 °C per circa 1 ora prima della manipolazione.</li>
	<li>Piuttosto che preparare molti piccoli cristalli di ghiaccio singoli, un grande cristallo di ghiaccio singolo di diversi litri di volume può essere preparato in un incubatore di temperatura costante come descritto da Knight23. Il grande cristallo di ghiaccio può essere conservato per un anno o più se conservato coperto in un congelatore da -15 a -20 °C. Porzioni di singolo cristallo possono essere tagliate dal blocco di ghiaccio con una sega come richiesto.</li>
</ol>2. Determinare la singolarità e l'orientamento del cristallo di ghiaccio
<ol><li>Determinare se il ghiaccio espulso dallo stampo è un singolo cristallo osservando in una stanza congelatore, tra due polaroid incrociate (Figura 1D).<ol>
<li>Se il cristallo di ghiaccio è singolo, allora non dovrebbero essere viste crepe o discontinuità e la direzione della luce non dovrebbe cambiare all'interno del cristallo di ghiaccio. Nota: se una stanza congelatore non è disponibile, è possibile utilizzare una cella frigorifera in tutti i passaggi richiesti, essendo cauti nel lavorare rapidamente e gestire il ghiaccio con parsimonioso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A causa della birifrangenza del ghiaccio, si può determinare l'orientamento dell'asse callo stesso tempo. Utilizzare le informazioni seguenti per determinare l'orientamento:<ol>
<li>Quando l'asse cè esattamente parallelo alla luce incidente, in teoria, nessuna luce passerà attraverso le polaroid incrociate. Se la luce incidente è leggermente in titolato dal parallelo con l'asse c,uno spettro uniforme di luce multicolore viene trasmesso attraverso il cristallo quando viene ruotato tra le polaroid incrociate. Questa trasmissione uniforme deriva dall'inattività ottica del ghiaccio Ih lungo il suo asse c24. Il piano basale del cristallo di ghiaccio è normale all'asse c.</li>
		<li>Quando l'asse cè più lontano dal parallelo alla luce incidente e il cristallo di ghiaccio viene ruotato tra le polaroid incrociate, la luce trasmessa si alternerà tra lo 0 e il 100% di trasmittanza con ogni 90° di rotazione del cristallo.</li>
		<li>Più comunemente, l'asse csarà normale al piano circolare del cristallo di ghiaccio cilindrico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare l'orientamento delle asce Amettendo il ghiaccio25 che viene fatto avvolgendo saldamente il cristallo di ghiaccio in un foglio di alluminio, frugando un piccolo foro con un ago attraverso il foglio nel ghiaccio sul piano basale (normale all'asse c)e posizionandolo sotto vuoto per 20 minuti.<ol>
<li>Questo trattamento produrrà un'incisione con simmetria esagonale sul piano basale, dove gli assi aattraversano i vertici della stella a sei lati (Figura 2A).</li>
		<li>Se lo si desidera, il cristallo di ghiaccio può essere tagliato con una sega parallela o perpendicolare a un lato dell'esagono per montarlo con un piano prisma primario o secondario perpendicolare al dito freddo, rispettivamente (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Adsorbimento di proteine antigelo etichettate fluorescentmente in un singolo cristallo di ghiaccio
<ol><li>Montare un singolo cristallo di ghiaccio sul dito freddo (Figura 1C) annoiando prima una cavità nella parte superiore del cristallo. Per fare questo, alternare lo scioglimento del ghiaccio con due aste di alluminio di diametro leggermente diverso, ma simili al diametro del dito freddo, per formare la cavità in cui il dito freddo può adattarsi.</li>
	<li>Raffreddare il dito freddo a -0,5 °C, posizionare nella cavità del ghiaccio e tenere il cristallo di ghiaccio in posizione fino a quando non si congela al metallo (Figura 2B). Evitare bolle d'aria quando si attacca il cristallo al dito in quanto ostacolano un efficiente trasferimento di calore dal dito all'asta.</li>
	<li>Riempire una tazza emisferica che è circa il doppio del diametro del cristallo di ghiaccio con acqua o tampone deionizzato filtrato, raffreddato a circa 4 °C. Immergere il cristallo di ghiaccio freddo legato alle dita nella tazza e rimuovere l'acqua in eccesso o il tampone in modo che la parte superiore del cristallo di ghiaccio sia approssimativamente livellata con lo strato liquido e il ghiaccio non tocchi le pareti della tazza.<ol>
<li>Coprire la tazza con isolamento e abbassare la temperatura a -5 °C.</li>
		<li>Attendere circa 1 ora affinché il cristallo di ghiaccio si fori in un emisfero, controllandone lo stato approssimativamente ogni 20 minuti (Figura 2C).</li>
		<li>Il ghiaccio prenderà la forma della tazza emisferica sciogliendo e coltivando il cristallo di ghiaccio, ma non dovrebbe mai crescere troppo per toccare le pareti della tazza. Ci dovrebbe essere almeno uno spazio di 1 cm tra la parete e l'emisfero e il dito freddo non dovrebbe sporgere dal ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la tazza dal cristallo di ghiaccio e aggiungere la soluzione proteica fluorescente ad un volume finale di 25-30 ml e alla concentrazione di analisi desiderata, facendo attenzione a mantenere invariato il volume totale del liquido nella tazza. Una concentrazione tipica di AFP è di 0,1 mg/ml.<ol>
<li>Riemergere il cristallo di ghiaccio nella tazza in modo che la parte superiore del cristallo di ghiaccio sia a livello del liquido e il cristallo di ghiaccio non tocchi le pareti della tazza (Figura 2D).</li>
		<li>Far scendere la temperatura fredda delle dita a -8 °C e lasciare congelare la soluzione proteica nel cristallo di ghiaccio per 2-3 ore, mescolando spesso la soluzione. Il ghiaccio formato dalla soluzione proteica dovrebbe essere di almeno 5 mm prima di fermare la crescita del ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il cristallo di ghiaccio dalla tazza mentre è ancora attaccato al dito freddo. Staccare il ghiaccio da quest'ultimo riscaldando il refrigerante attraverso il dito freddo a poco sopra 0 °C e attendere che il cristallo di ghiaccio si sciolga.</li>
	<li>Posizionare il lato cristallino piatto su una superficie pulita, ad esempio un piatto di pesatura, facendo attenzione a non toccare il ghiaccio appena formato e conservare a -20 °C per almeno 20 minuti prima della consegna.</li>
</ol>4. Visualizzazione di piani di ghiaccio legati alle proteine antigelo
<ol><li>La visualizzazione della fluorescenza viene effettuata in un congelatore oscurato o in una cella frigorifera, posizionando il lato piatto del cristallo di ghiaccio sotto le lampade con filtri di eccitazione specifici della lunghezza d'onda per eccitare l'etichetta fluorescente e i filtri di emissione della fotocamera per bloccare qualsiasi altra luce non specifica. In base al modello, i piani di ghiaccio associati dagli ARP possono essere stimati (Figura 4).</li>
	<li>Se non sono disponibili luci specifiche della lunghezza d'onda, è possibile utilizzare una scatola di luce UV.</li>
	<li>Gli estasi di ghiaccio tradizionali possono anche essere eseguiti semplicemente permettendo all'emisfero di ghiaccio di sublimare a -20 °C per almeno 3 ore, dopo di che la polvere proteica residua può diventare visibile sulla superficie del ghiaccio (Figura 5).</li>
	<li>Il passaggio 2.3 può essere ripetuto per determinare l'orientamento degli assi adell'emisfero di ghiaccio completato.</li>
</ol>

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<li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li>
<li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Sviluppo del metodo di incisione del ghiaccio da parte di Charles Knight per la determinazione di aerei di ghiaccio legati all'AFP studi molto avanzati sul meccanismo di legame del ghiaccio da parte degli ARP. Mentre le strutture degli ARP potevano essere risolte con la cristallografia a raggi X26,27, non c'era un metodo ovvio per dedurre la superficie complementare sul ghiaccio a cui l'AFP si legava. Quando il tipo I AFP dalla passera d'inverno è stato inizialmente caratterizzato, è stato ipotizzato di legars...

La produzione di proteine antigelo (AFP) è un importante meccanismo di sopravvivenza di alcuni organismi che vivono in ambienti carichi di ghiaccio. Fino a poco tempo fa, si pensava che l'unica funzione degli AFP fosse quella di prevenire o rallentare la crescita di cristalli di ghiaccio interni che avrebbero bloccato la circolazione, causato danni ai tessuti e stress osmotico. Gli organismi che non possono tollerare alcun grado di congelamento, come i pesci, esprimono ARP per inibire completamente la crescita dei cristalli dighiaccio 1. Altri, come l'erba, sono tolleranti al congelamento ed afps espliciti per inibire la ricristallizzazione del ghiaccio che riduce la formazione di grandi cristalli di ghiaccio nei lorotessuti 2. La stabilizzazione delle membrane a bassa temperatura è un'altra funzione suggerita per gli AFP3. Recentemente, è stato suggerito un nuovo ruolo per l'AFP di un batterio antartico, Marinomonas primoryensis, dai laghi salmastri ricoperti di ghiaccio4. Questo AFP fa parte di una proteina adessina molto piùgrande 5 che si pensa alleghi il batterio al ghiaccio per un migliore accesso all'ossigeno e ai nutrienti6. Altri microbi sono noti per secernore gli ARP, che potrebbero alterare la struttura del ghiaccio in cui vivono7.
Gli ARP sono stati trovati in alcuni pesci, insetti, piante, alghe, batteri, diatomee e funghi. Hanno sequenze e strutture notevolmente divergenti coerenti con la loro evoluzione da diversi progenitori in varie occasioni; eppure tutti si legano al ghiaccio e inibiscono la sua crescita con il meccanismo di adsorbimento-inibizione8. Gli ARP hanno ciascuno una superficie specifica che funge da sito di legame con il ghiaccio (IBS). Questi sono stati tipicamente identificati dalla mutagenesi site-directed dei residui superficiali9-11. Si ipotizza che l'IBS organizzi molecole d'acqua in uno schema simile al ghiaccio che corrisponde a specifici piani di ghiaccio. Così l'AFP forma il suo ligando prima di legarsiad esso 5, 12. I piani di ghiaccio possono essere definiti dai loro indici di Miller, e diversi ARP possono legarsi a piani diversi. Pertanto, il tipo I AFP dalla passera d'inverno si lega ai piani piramidali 20-2113, tipo III AFP lega sia il prisma primario che i piani piramidali utilizzando una superficie di legame del ghiacciocomposto 11,14, mentre il budworm abete rosso AFP, un AFP iperattivo, si lega contemporaneamente sia ai piani primario che basale15,16. Altri ARP iperattivi, come mpAFP, si legano a più piani di ghiaccio come dimostra la loro copertura completa di singoli emisferi di cristallo di ghiaccio5,17. Si ipotizza che la capacità degli AFP iperattivi di legare il piano basale, così come altri piani, possa tenere conto della loro attività 10 volte superiore rispetto agli AFP moderatamente attivi18. Sebbene l'efficienza degli AFP iperattivi sia ben documentata, la loro capacità di legarsi a più piani di ghiaccio non è ancora compresa.
Il metodo originale per determinare gli aerei di ghiaccio legati all'AFP è stato sviluppato da Charles Knight13,19. In questo metodo, un cristallo di ghiaccio singolo macroscopico è montato su un'asta metallica cava (dito freddo) e formato in un emisfero immergendolo in una tazza emisferica piena di acqua degassata. Quindi, l'emisfero viene immerso in una soluzione diluita di ARP e uno strato di ghiaccio viene coltivato dalla soluzione AFP sull'emisfero cristallino di ghiaccio per diverse ore controllato dalla temperatura del glicole etilenico che circola attraverso il dito freddo. Il cristallo di ghiaccio viene rimosso dalla soluzione, staccato dal dito freddo e posto in una stanza congelatore da -10 a -15 °C. La superficie viene raschiata con una lama affilata per rimuovere il film superficiale congelato della soluzione proteica antigelo e il cristallo di ghiaccio può sublimare per almeno 3 ore. Dopo la sublimazione, i piani di ghiaccio legati dagli ARP possono essere visti come modelli incisi bianchi derivati da proteine residue. L'emisfero di ghiaccio può essere orientato al suo asse ce a-assi, per localizzare i piani basali e prismaci del ghiaccio, e determinare gli indici di Miller delle macchie incise.
Qui descriviamo una modifica del metodo originale per determinare i piani di ghiaccio legati all'AFP, un metodo che definiamo affinità del piano di ghiaccio a base di fluorescenza (FIPA)11. Gli ARP sono etichettati fluorescentmente con un tag chimerico, come la proteina fluorescente verde (GFP)11,16,17,20, o con un colorante fluorescente legato covalentemente all'AFP5,21. Gli AFP etichettati fluorescentmente sono adsorbiti in un singolo cristallo di ghiaccio e ricoperti dalla stessa procedura sperimentale degli esperimenti originali di incisione del ghiaccio. L'estensione del legame AFP con l'emisfero di ghiaccio in crescita può essere monitorata durante l'esperimento utilizzando una lampada ultravioletta (UV). Al termine dell'esperimento, l'emisfero può essere tolto direttamente dal dito freddo e immaginato, senza sublimazione. Tuttavia, se lo si desidera, l'emisfero può essere lasciato sublimare per visualizzare un'incisione di ghiaccio tradizionale. Le modifiche introdotte alla metodologia FIPA accorciano di diverse ore il tradizionale protocollo di incisione del ghiaccio. Inoltre, c'è il potenziale per l'imaging simultaneo di diversi AFP, ognuno con un'etichetta fluorescente diversa, per visualizzare i modelli sovrapposti dei piani di ghiaccio legati all'AFP.

<table><tbody><tr><td>NESLAB RTE Bagni Refrigeranti/Circolatori</td><td>Thermo Scientific</td><td>RTE7</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico, Premiscelato Antigelo/Refrigerante</td><td>Certificato</td><td>29-3037-0</td><td>Antigelo automobilistico comune</td></tr><tr><td>Dito freddo</td><td>non disponibile</td><td>non disponibile</td><td>Realizzato su misura con ottone (9 cm di lunghezza, 1,5 cm di diametro esterno)</td></tr><tr><td>Coppa emisferica</td><td>non disponibile</td><td>non disponibile</td><td>Realizzato su misura con resina (8 cm di diametro esterno, 6 cm di diametro interno)</td></tr><tr><td>Sistema di illuminazione ad alta doppia uscita</td><td>Lightools Research</td><td>LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td><td>Ulteriori e personalizzati filtri di eccitazione possono essere acquistati da Lightools Research</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Canon</td><td>EOS 50D</td><td></td></tr><tr><td>Filtri di emissione</td><td>Lightools Research</td><td>LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td><td>Potrebbe essere necessario un adattatore per ghiera del filtro per montare il filtro sull'obiettivo della fotocamera</td></tr></tbody></table>

determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Le proteine antigelo (ARP) sono espresse in una varietà di organismi duri a freddo per prevenire o rallentare la crescita interna del ghiaccio. Gli ARP si legano a piani specifici di ghiaccio attraverso le loro superfici leganti il ghiaccio. L'analisi FIPA (Ice Plane Affinity) basata sulla fluorescenza è una tecnica modificata utilizzata per determinare i piani di ghiaccio a cui si legano gli ARP. La FIPA si basa sul metodo originale di incisione del ghiaccio per determinare i piani di ghiaccio legati all'AFP. Produce immagini più chiare in un tempo sperimentale ridotto. Nell'analisi FIPA, gli ARP sono etichettati fluorescentmente con un tag chimerico o un colorante covalente, quindi lentamente incorporati in un cristallo di ghiaccio singolo macroscopico, che è stato preformato in un emisfero e orientato a determinare gli assi a e c. L'emisfero di ghiaccio legato all'AFP è stato visualizzato sotto la luce UV per visualizzare i piani legati all'AFP usando filtri per bloccare la luce non specifica. L'etichettatura fluorescente degli AFP consente il monitoraggio in tempo reale dell'adsorbimento AFP nel ghiaccio. È stato riscontrato che le etichette non influenzano i piani a cui si legano gli AFP. L'analisi FIPA introduce anche la possibilità di legare più di un AFP con tag diverso sullo stesso singolo cristallo di ghiaccio per aiutare a differenziare i loro piani di legame. Queste applicazioni della FIPA stanno contribuendo a far progredire la nostra comprensione di come gli AFP si legano al ghiaccio per fermare la sua crescita e perché molti organismi produttori di AFP esprimono più isoforme AFP.

La preparazione e il montaggio del singolo cristallo di ghiaccio sono i due passaggi della procedura FIPA in cui gli errori sono più comunemente commessi. Determinare se il cristallo di ghiaccio preparato è singolo viene eseguito esaminandolo attraverso polaroid incrociate (Figura 1D),come descritto nel passaggio 2.1 della sezione del protocollo. Se per l'analisi FIPA viene utilizzato un cristallo di ghiaccio multicristallino, il risultato sarà il legame discontinuo degli ARP sull'emisfero senza un model...

Le proteine antigelo (AFP) si legano a specifici piani di ghiaccio per prevenire o rallentare la crescita del ghiaccio. L'analisi FIPA (Ice Plane Affinity) basata sulla fluorescenza è una modifica del metodo originale di incisione del ghiaccio per la determinazione dei piani di ghiaccio legati all'AFP. Gli ARP sono etichettati fluorescentmente, incorporati in cristalli di ghiaccio singoli macroscopici e visualizzati sotto la luce UV.

Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare i piani del ghiaccio legati da proteine antifreddo marcate con fluorescenza. Questo risultato si ottiene coltivando cristalli singoli di ghiaccio ai quali le proteine antifreddo possono legarsi in un secondo passaggio. Ogni cristallo viene osservato attraverso polarizzatori incrociati per stabilirne la singolarità e l'orientamento. Successivamente, un cristallo di ghiaccio viene montato su un dito freddo con temperatura controllata e modellato in forma emisferica. Il cristallo viene quindi immerso in una soluzione di proteine antifreddo marcate con un fluorocromo, al fine di assorbire le proteine antifreddo su specifici piani di legame dell'emisfero in crescita. I risultati sul ghiaccio si ottengono visualizzando e acquisendo immagini del ghiaccio legato alle proteine antifreddo marcate con fluorocromo, utilizzando luce e filtri specifici per lunghezza d'onda all'interno di una stanza fredda oscurata.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'incisione del ghiaccio, è che le proteine antifreddo sono marcate con un fluorocromo per consentire la visualizzazione immediata dei piani del ghi

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Quantitativa, high-throughput in tempo reale, e l'etichetta-libero di rilevamento biomolecolare (DNA, proteine, ecc) su...

Biomolecolare Detection impiega il sensore di immagine interferometrica riflettanza (IRIS)

Proteine ​​leganti ghiaccio (IBPs), noto anche come proteine ​​antigelo, inibiscono la crescita di ghiaccio e sono un additivo promettente per l'uso nella crioconservazione dei tessuti. Lo strumento principale utilizzato per indagare IBPs è il osmometro nanolitri. Abbiamo sviluppato una casa progettata fase di raffreddamento montato su un microscopio ottico e controllato utilizzando un custom-built routine di LabVIEW. Il osmometro nanolitri qui descritto manipolato la temperatura del campione...

LabVIEW a comando nanolitri osmometro Novel per le indagini Protein Ice rilegatura

In questo video, descriviamo la tecnica dell'anisotropia a fluorescenza per studiare le interazioni tra la proteina della sindrome di Shwachman-diamond (SBDS) marcata con fluorofori e la 1 GTPasi simile al fattore di allungamento (EFL1). All'incubazione di proteine SBDS con concentrazioni gradualmente crescenti di EFL1, si osserva un costante aumento dell'anisotropia, indicando una riuscita interazione tra le due proteine.

Rilevamento basato sull'anisotropia della fluorescenza delle interazioni proteina-proteina

Questo video descrive l'anisotropia di fluorescenza ad alte prestazioni che aiuta a monitorare l'interazione tra fattori di trascrizione e DNA. Il test monitora le interazioni di una molecola di DNA marcata con fluoroforo con il suo fattore di trascrizione specifico misurando il grado di polarizzazione dovuto alla rotazione molecolare o all'anisotropia del DNA marcato con fluoroforo.

Anisotropia di fluorescenza per determinare l'affinità di legame tra fattore di trascrizione e DNA

La fluorimetria differenziale a scansione è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening di librerie di piccole molecole per interazioni con le proteine. Qui, presentiamo un metodo semplice per estendere queste analisi per fornire una stima della costante di dissociazione tra una piccola molecola e il suo partner proteico.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

interazioni proteina sono al centro della funzione di una cellula. tecniche calorimetriche e spettroscopiche sono comunemente usati per caratterizzare loro. Qui si descrive anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare l'interazione tra la proteina mutata nella sindrome di Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento-simile 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

MicroScale Thermophoresis (MST) è una tecnologia sensibile per caratterizzare le interazioni aptamero-bersaglio. Questo manoscritto descrive un protocollo MST per caratterizzare le interazioni aptamero-piccola molecola.

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Questo documento delinea l'identificazione di proteine ​​di ghiaccio-binding da piante freeze-tolleranti attraverso la valutazione di attività di inibizione ghiaccio ricristallizzazione e successivo isolamento di IBPS native che utilizzano la purificazione ghiaccio affinità.

Identificazione di Plant proteine ​​Ice vincolante attraverso la valutazione di Ice-ricristallizzazione inibizione e isolanti Utilizzando Ice-affinità Purificazione

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Scopri l'analisi dell'affinità dei piani del ghiaccio basata sulla fluorescenza per visualizzare i piani di legame delle proteine antigelo. Questo metodo consente di osservare le interazioni proteina-ghiaccio in cristobiochimica.

Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza (Video) | JoVE Journal

Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

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