Trasferimento di Embrione utero-tubarica e vasectomia nel modello murino

L'obiettivo generale di questa procedura è trasferire gli embrioni preimpianto nell'utero di una ricevente pseudo incinta 2,5 DPC. Ciò si ottiene esponendo prima l'ovaio, l'uct e la prima sezione dell'utero. Successivamente, l'UCT viene perforato con un ago.

Successivamente, una pipetta capillare di vetro viene inserita attraverso il foro che avanza nel lume uterino. Infine, gli embrioni vengono rilasciati nell'utero. In definitiva, il numero di cuccioli nati viene utilizzato per dimostrare la sopravvivenza degli embrioni preimpianto trasferiti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a un metodo 16 come il trasferimento di embrioni uterini è che la parete uterina non viene perforata, evitando il sanguinamento e il flusso di embrioni. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati per la cura e l'uso degli animali dell'area di Beltsville in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali dell'USDA. Dopo aver somministrato anestesia e analgesici a un topo maschio con comprovate prestazioni di accoppiamento e aver confermato che l'animale è adeguatamente sedato, posizionare il topo su un palco caldo e utilizzare un tagliaunghie elettrico per rimuovere il pelo dalla zona ventrale tra due linee trasversali immaginarie poste a 0,5 centimetri e 2,5 centimetri sopra il pene.

Utilizzare il 10% di iodio povidone e il 70% di etanolo per disinfettare l'area rasata. Successivamente, utilizzando una pinza seghettata per medicazione per trattenere la pelle nella linea mediale dell'addome, eseguire un'incisione cutanea longitudinale da 10 a 15 millimetri a circa un centimetro sopra il pene. Quindi utilizzare una pinza seghettata da dissezione per tenere l'alba lineare e le forbici per tagliare il muscolo con i micro.

La pinza seghettata dissecante ha afferrato un cuscinetto di deposizione testicolare su un lato e lo ha tirato per esporre i testicoli, i vasti deens e l'epididimo. Il vasto deens si trova medialmente ai testicoli ed è chiaramente distinguibile tubo libero mentre tiene le forcipi di medicazione della fiamma dei vasti deens fino a quando non diventano rossi e usarli per tagliare e cauterizzare i vasti deens in due punti contemporaneamente, il taglio dovrebbe rimuovere una porzione di circa cinque millimetri e lasciare due estremità cauterizzate chiaramente separate muovono il testicolo, epi, e ampia deferenza verso la cavità addominale e ripetere la procedura sull'altro testicolo. Quindi, con cinque punti di sutura assorbibili zero, eseguire uno o due punti orizzontali sul materasso nel muscolo e utilizzare uno o due tagliaunghie per suturare la pelle.

Dopo aver identificato il maschio, spostatelo in una gabbia posta su un palco caldo e osservatelo fino a quando non si riprende dall'anestesia. Registrare le possibili incidenze che si verificano durante il trasferimento della vasectomia e aggiungere antibiotico all'acqua potabile. Per preparare una manipolazione embrionale, pipetta di vetro, iniziare lucidando le punte dei capillari di vetro.

Per evitare di danneggiare il portapipetta. Ammorbidire una parte centrale del capillare di vetro usando una fiamma fine per riscaldarlo mentre si usano entrambe le mani per ruotare leggermente il capillare. Una volta che la sezione capillare diventa morbida e malleabile, estraila rapidamente dalla fiamma e tira entrambe le estremità per restringere il suo diametro esterno a 130-150 micrometri Dopo che il vetro si è raffreddato, usa una matita a punta di diamante, una pietra abrasiva o una lima per unghie per tagliarlo incidendo leggermente l'estremità stretta e tirando da entrambi i lati.

La rottura deve essere pulita e perpendicolare. Lucidare il puntale fiammando molto rapidamente, lasciando un'apertura da 100 a 130 micrometri, le pipette possono essere conservate per un uso successivo. Dopo aver preparato l'area chirurgica e valutato la corretta anestesia come descritto in precedenza in questo video con l'animale su un palco caldo, utilizzare un tagliacapelli elettrico per rimuovere il pelo dall'area dorsale tra le ginocchia e le costole distali.

Spostare il ricevente su un tavolino caldo sotto lo stereomicroscopio e posizionarlo in posizione prona lateralmente al chirurgo. Coprire l'area con un asciugamano sterile con un foro che espone l'area rasata e illuminare l'area chirurgica. Successivamente, mentre si utilizza una pinza da medicazione per tenere la pelle in un punto situato sul cranio, un terzo della linea tra l'ultima costola e i fianchi e il dorsale un terzo della linea tra la schiena e l'addome.

Usa le forbici per eseguire un'incisione trasversale di un centimetro nella pelle. L'ovaio o il cuscinetto adiposo che circonda l'ovaio sarà visibile attraverso la parete del corpo. Eseguire un'incisione trasversale da 0,3 a 0,5 centimetri nella parete del corpo sopra l'ovaio o il cuscinetto adiposo in un punto in cui l'incisione non taglia i grandi vasi sanguigni.

Caricare la pipetta per la manipolazione degli embrioni con cz BH medium, prelevando una piccola bolla d'aria. Introduzione da cinque a 10 embrioni con una quantità minima di terreno. E infine, prendendo un'altra piccola bolla d'aria e una piccola quantità di terreno.

Usa una pinza seghettata per microsezione per afferrare il cuscinetto adiposo che circonda l'ovaio e tirarlo verso la testa del topo per esporre l'ovaio, l'uct e una piccola parte dell'utero superiore fuori dalla cavità addominale. Tenendo il boccaglio dell'aspiratore in bocca pronto per essere utilizzato con pinze seghettate per microdissezione. Spostare l'UCT ed esporre la giunzione tubarica utero-barica, mantenendo la giunzione tubarica utero-barica accessibile con la mano non dominante.

Prendi una pinza per microdissezione leggermente curva e posizionala appena sotto la giunzione tubarica dell'utero, afferrando l'UCT a circa due millimetri sopra quella porzione. Successivamente, tenendo la giunzione tubarica dell'utero con la leggera pinza di microdissezione curva. Utilizzare un ago calibro 27 per perforare la sezione UCT vicino alla pinza.

Quindi inserire la pipetta per la manipolazione dell'embrione nell'orifizio e avanzare attraverso la giunzione tubarica dell'utero fino all'utero. Avanzando non più di tre millimetri nell'organo per prevenire danni all'endometrio. Soffiare delicatamente per rilasciare gli embrioni nell'utero, assicurandosi che entrambe le bolle d'aria passino attraverso l'utero e senza introdurre altra aria.

Dopo aver rimosso la pipetta, afferrare il cuscinetto addominale per spostare il dotto OV e l'ovaio nella cavità addominale prima di suturare. Il muscolo e la pelle, come mostrato in precedenza in questo video, consentono alla femmina di riprendersi in modo simile alle clip maschili che possono essere rimosse 10 giorni dopo il trasferimento dell'embrione. Per ulteriori dettagli, fare riferimento ai protocolli di testo.

Il trasferimento di embrioni tubarici utero Tails fornisce un mezzo per trasferire gli embrioni nell'utero, evitando alcune delle complicazioni associate al trasferimento di embrioni uterini. In questa tabella, mostriamo i risultati ottenuti dal trasferimento di CD one blast assist sottoposto a diversi tipi di manipolazioni ai destinatari CD one. Seguendo il protocollo descritto, la sopravvivenza a termine o la sopravvivenza a E 15 è simile tra gli embrioni.

Semplicemente coltivati in vitro dallo stadio zigote, embrioni sottoposti a iniezione di IPSC per generare cuccioli chimerici ed embrioni a cui è stata rimossa la zona e sono stati esposti al lentivirus sette ore prima del trasferimento dell'embrione. Pertanto, il trasferimento di embrioni tubarici in utero è una tecnica affidabile per trasferire embrioni particolarmente complicati come quelli privi di zita e incubati con lentivirus Durante il tentativo di questa procedura, è importante essere il più delicati possibile con il ricevente e gli embrioni.