Name: Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: Lottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Impara a sviluppare un saggio di sensibilizzazione cAMP cellulare in un giorno per lo screening ad alto rendimento. Utilizza cellule crioconservate e tecnologia HTRF per identificare vie molecolari e accelerare la scoperta di farmaci.

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Gli autori desiderano ringraziare il signor Richard Zink e Todd Wiernicki per la formazione metodologica e di orientamento dosaggio. Ringraziamo anche Giovanni Paolo Spence un&#39;attenta lettura e proposte editoriali. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, e Eli Lilly and Company attraverso il Research Award Program Lilly (LRAP).

1. Espansione e crioconservazione delle cellule Assay pronti <ol><li> Cultura CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) le cellule su una cella piatto 15 centimetri 2 cultura dei media F12 di Ham integrato con 1.0 mM L-glutammina, 800 mg / mL G418, 300 mg / igromicina ml, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, e siero bovino fetale al 10% (FBS). </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 fino a quando le cellule sono 90-95% confluenti. Lavare le cellule con 10 microlitri tampone fosfato isotonico (PBS), e raccogliere le cellule aggiungendo 3 ml di tampone di dissociazione cellulare per 5 min a 37 ° C. Risospendere le cellule con 12 ml di media cultura e contare le celle utilizzando trypan blu. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzi di congelamento (10% dimetilsolfossido, 90% FBS). Diluire la sospensione cellulare per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata (ad esempio 1-20 x 10 6 cellule / ml). </li><li> Aliquota 1,0 ml di soluzione di cella per ogni esageratamente. Incubare le cryovials in un contenitore cella di congelamento a -80 ° C per una notte. Trasferire le cryovials ad un serbatoio di liquido N 2 per conservazione a lungo termine. </li></ol> 2. Placcatura del saggio Cellule pronte (e Reverse Transfezione Option) <ol><li> Rapidamente scongelare un esageratamente congelata di cellule in un bagno d&#39;acqua a 37 °. Una volta che le cellule vengono scongelate, trasferire le cellule in una provetta da 15 ml contenente 9 ml di Opti-MEM, e mescolare per inversione 3-5x. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in 1 ml Opti-MEM. </li><li> Contare le cellule utilizzando trypan blu per determinare la vitalità cellulare e diluire le cellule vitali, se necessario (ad es. 3 x 10 5 cellule / ml concentrazione) inOpti-MEM. La tavola 10 microlitri / pozzetto di cellule di una coltura tissutale trattata piastra a 384 pozzetti usando una pipetta multicanale. </li><li> Effettuare diluizioni seriali di cAMP in Opti-MEM per generare una curva standard per stimare la produzione di cAMP da parte delle cellule (secondo le manifatture raccomandazioni - vedere la sezione 7). Aggiungere 10 microlitri / pozzetto delle norme cAMP alla piastra Nota:. Un&#39;unica curva standard può essere preparato su una piastra separata o pozzi in bianco su una delle piastre di saggio. </li><li> Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 1 ora. </li></ol> 3. Invertire la trasfezione di siRNA Opzione * Questa sezione è facoltativa e pertinente alla figura 3. <ol><li> Preparare una soluzione di siRNA in DDH RNase-free 2 O (ad esempio 0,4 pmol / ml). Aggiungere 5 microlitri a singoli pozzetti della piastra a 384 pozzetti, e centrifugare la piastra a 100 xg per 15 SEc a temperatura ambiente. </li><li> Diluire Lipofectamine 2000 Opti-MEM di un fattore 0.006 (es aggiungere 6 ml di Lipofectamine 2000 a 1000 ml di Opti-MEM), e mescolare pipettando su e giù. </li><li> Incubare la soluzione Lipofectamine 2000/Opti-MEM per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 5 ml di soluzione diluita Lipofectamine 2000/Opti-MEM a singoli pozzetti della piastra a 384 pozzetti che contiene già siRNA. Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente. </li><li> Incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Saggio Piatto cellule pronte come descritto in precedenza (sezione 2). Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente. </li><li> Ritorno piastra di saggio di incubatore umidificato a 37 ° (CO 5% 2) C per 48-96 ore, come determinato per il gene targeting abbattere (vedi la discussione). </li></ol> 4. Piccolo Screening Molecola <ol><li> Diluire il farmaco di interesse (es. inibitori. Piccole molecole) in Opti-MEM a 6x le concentrazioni finali desiderati. Diluizioni seriali possono essere completate con pipette a mano o una stazione di gestione dei liquidi. </li><li> Aggiungere 2,5 ml / pozzetto di composto di prova o tampone contenente veicolo (ad es DMSO) al lato dei pozzetti usando una pipetta multicanale. </li><li> Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente (incubazione è opzionale). </li></ol> 5. Persistente Agonista Trattamento <ol><li> Preparare una 600 nm (per esempio. 6 volte la concentrazione finale desiderata di 100 nm) soluzione quinpirole in Opti-MEM. </li><li> Aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione quinpirole 600 nM al lato dei pozzetti usando una pipetta multicanale. </li><li> Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 2 h. </li></ol> 6. La stimolazione di cAMP Accumulation <ol><li> Durante l&#39;incubazione 2 ore, prepara le stimulatisulla soluzione Opti-MEM. La soluzione di stimolazione è composto da 40 mM forskolina, 2 mM 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), e 4 mM spiperone (tutte le concentrazioni nel passaggio 6 sono 4x la concentrazione finale desiderata). </li><li> Aggiungere 5 microlitri / pozzetto della soluzione stimolazione al lato dei pozzetti usando una pipetta multicanale. </li><li> Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li></ol> 7. Tempra e stima di cAMP Accumulation <ol><li> Produzione di cAMP da parte delle cellule è misurata utilizzando il kit dinamico 2 cAMP secondo le istruzioni del produttore. In breve, ricostituire anti-cAMP-criptato e cAMP-d2 in acqua distillata. Congelare aliquote a -20 ° C per la conservazione a breve termine. </li><li> Diluire un&#39;aliquota di anti-cAMP-criptato e un&#39;aliquota di cAMP-d2 separatamente nel tampone di lisi secondo le istruzioni del produttore per rendere soluzioni di lavoro. </li><li> Lagg 10 microlitri / pozzetto della soluzione di lavoro anti-cAMP-criptato e 10 microlitri / pozzetto della soluzione di lavoro cAMP-d2 alla piastra a 384 pozzetti usando una pipetta multicanale. </li><li> Centrifugare la piastra a 100 xg per 15 secondi a temperatura ambiente, e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Leggere la piastra in un lettore di piastre a fluorescenza (impostazione scala automatica della sensibilità), utilizzando una eccitazione di 337 nm, e misurare le emissioni a 620 nm e 665 nm per manufatti istruzioni. </li><li> Applicare analisi raziometrica per valutare curva standard cAMP produce per le istruzioni. Utilizzando i valori risultanti, estrapolare l&#39;accumulo di cAMP stima nei pozzetti utilizzando il software di analisi dei dati. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel tentativo di facilitare gli studi di sensibilizzazione eterologa, abbiamo ampiamente modificato il nostro metodo precedente realizzare una struttura snella &quot;mix e leggere&quot; formato che è modificabile a high-throughput screening e il meccanismo di esame azione. Le principali modifiche al nostro protocollo possono essere riassunti come segue: 1) l&#39;uso di cellule crioconservate come reagenti di saggio &quot;pronto&quot;, 2) la miniaturizzazione del dosaggio in 384 pozzetti, e 3) l&#39;utilizzazione della m...

Un ciclasi adattativo (AC) di segnalazione di risposta noto come-eterologo o super-sensibilizzazione è stato scoperto nel laboratorio del premio Nobel, il dottor Marshall Nirenberg. Il Dott. Nirenberg proposto che l&#39;aumento della reattività AC osservata dopo l&#39;attivazione dei recettori oppioidi δ cronica era un meccanismo coinvolto nella tolleranza e dipendenza da oppiacei 1. Oltre ai recettori oppioidi δ cronica, questa risposta neuroadaptive di segnalazione AC si verifica anche dopo l&#39;attivazione persistente di diversi altri Gαi / o recettori accoppiati a 2. In particolare, molti di questi recettori sono associati con dolore, disturbi neuropsichiatrici e neurologici, e comprendono μ / κ oppioidi, D 2/4 dopamina, 5HT 1A, e M 2/4 recettori muscarinici 2. Oltre ai risultati del Dott. Nirenberg, un grande corpo di evidenze esiste collega sensibilizzazione della segnalazione AC all&#39;attivazione cronica dei recettori oppioidi sia <em&gt; in vitro e in vivo 3-7. Sensibilizzazione di AC è stata anche associata con una varietà di malattie che coinvolgono i recettori dopaminergici D 2-come compreso la schizofrenia e il morbo di Parkinson (per una rassegna vedi riferimento 2). Nonostante l&#39;importanza potenziale di sensibilizzazione, il meccanismo preciso (s) associata a persistente / attivazione del recettore Gαi o accoppiato, che porta ad una maggiore reattività AC rimane in gran parte sconosciuta. Questi studi forniscono il razionale per l&#39;esame dei meccanismi di sensibilizzazione della ciclasi come un importante obiettivo neurobiologica. Analogamente, la rilevanza fisiologica di AC segnalazione 8 e l&#39;importanza che le singole isoforme AC tengono in questa risposta adattativa dovrebbero essere riconosciuti 2,9,10. Nel contesto della nostra ricerca, le caratteristiche generali associati sensibilizzazione eterologa delle isoforme ricombinanti di AC paralleli tali caratteristiche described per studiare le isoforme endogeni di AC. In particolare, la ricerca precedente ha scoperto che l&#39;attivazione di Gαi / o proteine ​​e subunità successivo rilascio / riassestamento βγ sono requisiti importanti per il recettore indotta sensibilizzazione di tutte le isoforme AC. Inoltre, diversi studi suggeriscono che la segnalazione di proteine ​​chinasi e subunità Gβγ sono coinvolti nella sensibilizzazione 2,11-13. AC individuali mostrano anche i modelli di sensibilizzazione uniche e distinte 12. Per esempio, l&#39;esposizione persistente di D 2 recettori agonisti è associata con sensibilizzazione di AC1 e AC8 di Ca 2 + / calmodulina stimolazione 14,15, mentre la strettamente correlata AC3 non è sensibilizzata 2. AC2, AC4 e AC7 sono strettamente correlati, però, solo l&#39;attività AC2 PKC-stimolata è robusto sensibilizzato dopo una prolungata esposizione di D 2 recettori agli agonisti 7,14,16,17. Inoltre, AC5 e AC6 mostrano una marcata grado di hetersensibilizzazione ologous a gas e forskolina stimolata cAMP accumulo a seguito di attivazione dei recettori D2 14,18-20, ma sembrano differire nella loro esigenza di Gβγ subunità-AC INTERAZIONI 21. Sebbene la maggior parte degli studi di sensibilizzazione AC hanno utilizzato linee cellulari modello (ad esempio cellule HEK293 che esprimono le singole isoforme di AC), sembra che questi risultati si traducono in modelli cellulari neuronali nativi 4,22. Più recentemente, gli effetti della isoforma AC selettivi piccole molecole inibitrici identificati in cellule HEK293 esprimenti isoforme CA possono anche essere tradotti in studi comportamentali in vivo 23. La mancanza di un meccanismo molecolare identificato per la sensibilizzazione eterologa probabilmente riflette la complessità della risposta adattativa nonché le uniche proprietà regolazione individuale isoforme AC 12. Dipanare tale complessità è ulteriormente complicata dall&#39;utilizzo di ingombrante metodologia tCappello ha limitato ricercatori accademici da impiegare approcci imparziali. Ad esempio, i nostri precedenti studi meccanicistici comportato l&#39;utilizzo di modelli cellulari continuamente coltivate con 24 - e 48-ben formato coltura di tessuti 15. Cellule in coltura erano tipicamente coltivate per 48 ore e quindi sottoposti a trattamento farmacologico con agonisti (2-18 ore) seguito da una serie di lavaggi cellulari e incubazione (Figura 1). Protocolli accumulo di cAMP specifico AC-isoforma erano poi impiegato seguita dalla misurazione di accumulo di cAMP utilizzando un laborioso e richiede tempo [3 H] cAMP metodologia 15,24 vincolante. La durata dall&#39;inizio alla fine di ciascun saggio generalmente richiesto un totale di quattro o cinque giorni da placcatura cella per l&#39;analisi dei dati (Figura 1). L&#39;applicazione di nuove tecnologie e l&#39;automazione ha portato a miglioramenti marcati per gli studi di sensibilizzazione in ambiente industriale e HTS centro. Ad esempio, un gruppo di lavoro con il Centro Nazionale per Chemical Genomics ha riportato una due giorni HTS procedura di analisi per l&#39;identificazione di piccole molecole inibitrici di μ recettori oppioidi sensibilizzazione indotta in formato 1.536-ben 25. Il presente articolo descrive i nostri sforzi per sviluppare un test HTS per studi di sensibilizzazione eterologa utilizzando tecnologie che sono disponibili presso la maggior parte degli istituti di ricerca universitari. Questa strategia è stata realizzata incorporando l&#39;uso di cellule crioconservati da modelli cellulari eterologhi che esprime il recettore dopaminergico D 2 in combinazione con endogeni o singoli ricombinanti isoforme ciclasi (CHO-D 2L o HEK-AC6 / D 2 L). Per migliorare il nostro rendimento, abbiamo ridisegnato la nostra sensibilizzazione test ben 48 (ca.&gt; 20 passi oltre 4-5 giorni) per un periodo di cinque step, test solo giorno in formato 384-bene che era essenzialmente &quot;mix e leggere&quot;. Il nuovo formato utilizza un tempo omogeneo disponibile in commercio fluorescenza risolta (HTRF) test per misurare cAMP accumulation in cellule intatte con un lettore di piastra a più modalità. Il test è robusto e suscettibili di proiezione piccola molecola, e può essere efficacemente applicata a screening per inibitori di sensibilizzazione eterologa. Inoltre, forniamo i dati che permettono l&#39;uso di questo test con trasfezione inversione di siRNA a una vasta libreria di siRNA lo screening mirati o del genoma con solo una piccola modifica per l&#39;impostazione generale.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1-DRD2L celle</td><td>DiscoveRx</td><td>930579C2</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12 media</td><td>VWR</td><td>SH30026fs</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>VWR</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina</td><td>Fisher</td><td>50-230-5556</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>piatti da 15 cm</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di dissociazione cellulare</td><td>Life Technologies</td><td>13150016</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Crioviali</td><td>Fisher</td><td>976171</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 384 pozzetti trattate con TC</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007688</td><td></td></tr><tr><td>Kit HTRF cAMP Dynamic 2</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEB</td><td>http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td></tr><tr><td>Synergy 4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFPTAD</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>Software GraphPad</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Quinpirole</td><td>Sigma</td><td>Q111</td><td></td></tr><tr><td>Spiperone</td><td>Sigma</td><td>S7395</td><td></td></tr><tr><td>Clozapina</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Aloperidolo</td><td>Sigma</td><td>H1512</td><td></td></tr><tr><td>S-(-)Sulpiride</td><td>Sigma</td><td>S112</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 reagente di trasfezione</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Tecnologie</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr>MP<td>senza acqua, DNasi e RNasi</td><td>Biomedicals</td><td>821739</td><td></td></tr><tr><td>Ga<s/sub> siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>personalizzato siRNA</td><td></td></tr><tr><td>Controllo non mirato</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>siGlo Red</td><td>Dharmacon</td><td>D-001630-02</td><td></td></tr></tbody></table>

farmaco-indotta sensibilizzazione della ciclasi: l&#39;ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di sirna e applicazioni di screening

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensibilizzazione di adenilato ciclasi (AC) segnalazione è stata implicata in una varietà di disturbi neuropsichiatrici e neurologici compreso abuso di sostanze e il morbo di Parkinson. L&#39;attivazione acuta di Gαi / recettori o-linked inibisce l&#39;attività AC, mentre l&#39;attivazione persistente di questi recettori provoca sensibilizzazione eterologa di AC e aumento dei livelli di cAMP intracellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che questo miglioramento di reattività AC è osservato sia in vitro che in vivo in seguito all&#39;attivazione cronica di diversi tipi di recettori / O-linked Gαi compresi D 2 della dopamina e recettori oppioidi μ. Sebbene sensibilizzazione eterologa di AC è stata segnalata per la prima di quattro decenni fa, il meccanismo (s) che sono alla base di questo fenomeno restano in gran parte sconosciute. La mancanza di dati meccanicistici presumibilmente riflette la complessità di questa risposta adattativa, suggerendo che gli approcci nonbiased potrebbero aiutare a identificarezione delle vie molecolari coinvolti nella sensibilizzazione eterologa di AC. Studi precedenti hanno implicato chinasi e segnalazione Gbγ come componenti che regolano la sensibilizzazione eterologa di AC sovrapposizione. Per identificare gli obiettivi sovrapposti unico e aggiuntivi connessi con la sensibilizzazione di AC, lo sviluppo e la validazione di una soluzione scalabile test cAMP sensibilizzazione è necessaria per una maggiore produttività. Approcci precedenti per studiare sensibilizzazione sono generalmente ingombranti coinvolge cellulare continua cultura manutenzione nonché una complessa metodologia per misurare l&#39;accumulo di cAMP che coinvolge più fasi di lavaggio. Pertanto, lo sviluppo di un saggio basato su cellule robusto che può essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento (HTS) in un formato ben 384 facilitare studi futuri. Utilizzando due modelli cellulari D 2 del recettore della dopamina (ad esempio. CHO-D 2L e HEK-AC6 / D 2L), abbiamo trasformato il nostro saggio di sensibilizzazione a 48 pozzetti (&gt; 20 gradini 4-5 giorni) per un periodo di cinque-step, unico dosaggio giorno in formato 384-bene. Questo nuovo formato è suscettibile di proiezione piccola molecola, e ci dimostrano che questo motivo test può anche essere facilmente utilizzato per la trasfezione inversione di siRNA in previsione di uno screening della libreria siRNA mirati.

Parte I. Lo sviluppo di una 384 ben eterologa saggio di sensibilizzazione per l&#39;identificazione di piccole molecole inibitrici utilizzando un modello cellulare disponibile in commercio. Per studiare sensibilizzazione eterologa in un modello cellulare, abbiamo fatto una serie di miglioramenti che ci hanno permesso di snellire l&#39;analisi in un formato &quot;mix e leggere&quot;. Varie modifiche chiave sono evidenziati di seguito, e sono descritti in maggior dettaglio nel...

L&#39;attivazione persistente del inibitori G recettori accoppiati alla proteina provoca sensibilizzazione della segnalazione ciclasi ciclasi. Per identificare le vie molecolari essenziali, sono necessari approcci nonbiased, tuttavia, questa strategia richiede lo sviluppo di una base cellulare scalabile saggio cAMP sensibilizzazione. Qui, descriviamo un test di sensibilizzazione per la piccola molecola e lo screening siRNA.

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L&#39;ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un saggio cellulare di sensibilizzazione al ciclico AMP in un singolo giorno, adatto per applicazioni di screening ad alto rendimento, inclusi lo screening di librerie chimiche. Questo viene ottenuto innanzitutto scongelando e seminando cellule precedentemente preparate e conservate in forma criopreservata, pronte per il saggio. Il secondo passaggio consiste nell'aggiungere ai campioni composti in esame o antagonisti, seguito dall'aggiunta del farmaco sensibilizzante dell'adenilato ciclasi.Successivamente viene aggiunto un attivatore dell'adenilato ciclasi in presenza di un inibitore della fosfodiesterasi per stimolare l'accumulo di AMP ciclico. L'ultimo passaggio consiste nell'arrestare la reazione mediante l'utilizzo di reagenti per la rilevazione dell'AMP ciclico con fluorescenza risolta nel tempo omogenea (HTRF) nel buffer di lisi, seguito dalla misurazione della fluorescenza. In definitiva, l'uso di cellule criopreservate e della tecnologia HTRF per l'AMP ciclico consente di eseguire un saggio di sensibilizzazione in un singolo giorno per lo screening di molecole di piccole dimensioni.L'idea di questo approccio è emersa quando abbiamo sviluppato l'interesse a utilizzare lo screening ad alto rendimento per studiare la sensibilizzazione eterologa mediata da recettori di una ciclasi dentale. Due tecniche fondamentali utilizzate in questo caso includono l'uso di cellule criopreservate come reagenti pronti all'uso e il saggio omogeneo con rilevamento temporizzato. Per i kit saggio essenziali per la misurazione del ciclo KMP, le metodologie di base qui impiegate possono contribuire a rispondere a domande chiave nella trasduzione del segnale cellulare e nella scoperta di farmaci mediante saggi cellulari. Per iniziare, coltivare le cellule CHO D due L in una piastra per colture cellulari da 15 centimetri come descritto nel protocollo testuale, incubando le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con 5%CO2 fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza del 90-95%, quindi lavare le cellule con 10 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato o PBS, raccogliere le cellule con tre millilitri di buffer di dissociazione cellulare dopo un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius.Dopo aver risospeso le cellule utilizzando 12 millilitri di mezzo di coltura, contare le cellule mediante esclusione al trian blu; centrifugare la sospensione cellulare a 500 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo di congelamento; dopo aver diluito la sospensione cellulare per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata, aliquotare un millilitro di soluzione cellulare in ogni provetta criogenica. Incubare le provette criogeniche in un contenitore per congelamento cellulare a -80 gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente, trasferire le provette criogeniche in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per preparare le cellule pronte per il saggio, scongelare rapidamente una provetta criogenica congelata di cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Una volta scongelate, trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente nove millilitri di OptiMEM e mescolare capovolgendo il tubo da tre a cinque volte. Dopo la centrifugazione delle cellule a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di OptiMEM.Contare le cellule utilizzando l'esclusione con trian blu per determinare la vitalità cellulare prima di diluire le cellule vitali secondo necessità. E piastrare in modo ottimale 10 microlitri di cellule per pozzetto in una piastra da 384 pozzetti trattata per colture cellulari. Utilizzando una pipetta multicanale.Effettuare diluizioni seriali dell'AMP ciclico e dell'ottimale per generare una curva standard per la stima della produzione di AMP ciclico da parte delle cellule. Aggiungere 10 microlitri per pozzetto degli standard di AMP ciclico nella piastra. Centrifugare la piastra a 100 ×g per 15 secondi a temperatura ambiente e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con 5% CO2 per un'ora.Per un test di screening su piccole molecole, diluire innanzitutto il farmaco di interesse nel mezzo fino a sei volte la concentrazione finale desiderata. La diluizione in serie può essere eseguita utilizzando pipette manuali o una stazione per la movimentazione dei liquidi. Aggiungere 2,5 microlitri per pozzetto del composto in esame o del veicolo contenente il buffer.Applicare la soluzione sul lato dei pozzetti utilizzando una pipetta multicanale e centrifugare la piastra a 100 ×g per 15 secondi. A temperatura ambiente per un trattamento agonista prolungato, preparare una soluzione di Quin parol a 600 nanomolari in OptiMEM, quindi aggiungere 2,5 microlitri per pozzetto della soluzione di Quin parol 600 nanomolare sul lato dei pozzetti. Utilizzando una pipetta multicanale, centrifugare nuovamente la piastra prima di incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con 5% CO2 per due ore. Durante l'incubazione di due ore, preparare la soluzione di stimolazione in optimum come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere cinque microlitri per pozzetto della soluzione di stimolazione lungo il bordo dei pozzetti utilizzando una pipetta multicanale, dopo aver centrifugato la piastra come in precedenza, e averla incubata a temperatura ambiente per un'ora. La produzione di AMP ciclico da parte delle cellule viene misurata utilizzando il kit dinamico per AMP ciclico 2 secondo le istruzioni del produttore: ricostituire brevemente l'anti-AMPc cripto e l'AMPcD2 in acqua distillata; diluire un'aliquote di anti-AMPc cripto e un'aliquote di AMPcD2 separatamente nel buffer di lisi, secondo le istruzioni del produttore, per ottenere le soluzioni di lavoro. Per arrestare l'accumulo di AMPc nella piastra a 384 pozzetti, aggiungere 10 microlitri per pozzetto della soluzione di lavoro anti-AMPc cripto 8 e 10 microlitri per pozzetto della soluzione di lavoro AMPcD2. Utilizzando una pipetta multicanale, centrifugare nuovamente la piastra a 100 ×g per 15 secondi a temperatura ambiente, quindi incubare a temperatura ambiente per un'ora. Leggere le piastre con un lettore a fluorescenza utilizzando un'eccitazione di 337 nanometri e misurare le emissioni a 620 nanometri e 665 nanometri seguendo le istruzioni del produttore. Applicare un'analisi ratiometrica per valutare la curva standard dell'AMP ciclico seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzando i valori ottenuti, estrapolare l'accumulo stimato di AMP ciclico nei pozzetti di prova mediante software di analisi dati.Cellule CHO D due L criopreservate sono state seminate direttamente in piastre per saggi a 384 pozzetti per dimostrare che i saggi di sensibilizzazione possono essere eseguiti in formato 384 pozzetti, riducendo il numero di passaggi da oltre 20 a cinque. Gli studi hanno rivelato che un pretrattamento di due ore con Quin Perol potenzia l'accumulo successivo di AMP ciclico stimolato da quattro in modo dose-dipendente, coerente con una sensibilizzazione eterologa. La seconda serie di esperimenti ha indagato se questo nuovo saggio semplificato potesse essere utilizzato per valutare gli inibitori della sensibilizzazione.I risultati iniziali hanno rivelato che il pretrattamento con aloperidolo o Perone, antagonisti prototipici del D2, ha completamente prevenuto la sensibilizzazione indotta da Quin parolo nell'accumulo di AMP ciclico stimolato da forskolina. Questo metodo è stato quindi utilizzato per valutare l'potenza di una serie di antagonisti del D2, per verificare se questi composti inibiscono la sensibilizzazione in modo simile ai risultati precedenti. Questi studi hanno dimostrato che gli antagonisti del D2 inibiscono la sensibilizzazione indotta dall'agonista in maniera dose-dipendente.L'obiettivo successivo era sviluppare un saggio di sensibilizzazione in piastre da 384 pozzetti che potesse essere utilizzato per condurre screening su librerie di RNAi a trasfezione inversa su larga scala, come descritto nel protocollo testuale. I risultati hanno rivelato che l'esposizione delle cellule all'agonista Quin parole per due ore ha determinato un marcato aumento dell'accumulo di AMP ciclico stimolato da quattro scullin. L'aumento dell'accumulo di AMP ciclico, sia a 100 nanomolari che a 300 nanomolari di quattro scullin, è stato superiore a 15 volte rispetto alle cellule trattate con il veicolo. La trasfezione inversa di GSS irna in cellule esprimenti il recettore D due blocca la sensibilizzazione indotta dall'agonista dell'adenilato ciclasi.Quando l'agonista del recettore D₂ Quin Perol è stato aggiunto in modo ciclico, è stata osservata una stimolazione dell'accumulo di AMP ciclico; l'accumulo è stato misurato mediante H-T-R-F-A, mostrando una sensibilizzazione 15 volte superiore, ridotta del 94%. Una volta acquisita padronanza, l'intero saggio può essere completato in meno di otto ore se eseguito correttamente seguendo questa procedura. Altre molecole di segnalazione, come IP₁ e Phospho ERK, possono essere misurate per esaminare ulteriori vie di segnalazione dei recettori.

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