Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare rapidamente e con precisione le prestazioni di volo in Drosophila. Questo viene ottenuto innanzitutto lasciando cadere i moscerini in un cilindro di volo. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'acquisire con una fotocamera digitale l'immagine della superficie di atterraggio.

L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i dati utilizzando un software di imaging mediante la misurazione dell'altezza di atterraggio di ciascuna mosca. In definitiva, questa procedura consente di identificare mutazioni e condizioni come l'invecchiamento o la neurodegenerazione, che compromettono la capacità di volo, e aiuta a quantificare le prestazioni di volo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il tester di volo originale, è che è più adatta per schermate ad alto rendimento di mutanti e altre condizioni che alterano il volo.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo capito quanto tempo fosse necessario per testare un gran numero di genotipi utilizzando il flight tester originale. Fissare il cilindro di volo a un treppiede utilizzando morsetti a catena. Lasciare circa tre centimetri sotto il cilindro per il piatto di raccolta.

Caricare la capsula con uno strato sottile di olio minerale e farla scivolare sotto il cilindro di volo. Fissare il imbuto a un secondo supporto ad anello. Regolare l'altezza dell'imbuto in modo che la parte inferiore dell'imbuto sia allineata con la sommità del cilindro di volo.

La parte più stretta del imbuto deve essere più stretta rispetto a una provetta per Drosophila. Il diametro del tubo di caduta deve essere leggermente più ampio rispetto a una provetta per Drosophila, in modo che la provetta possa cadere liberamente. Inserire il tubo di caduta nella parte superiore dell'imbuto e fissarlo utilizzando una morsetto a ganascia.

Successivamente, da un foglio di poliacrilammide, ritagliare un pezzo rettangolare della stessa lunghezza del cilindro di volo e con una larghezza leggermente inferiore alla circonferenza interna del cilindro. Applicare uno strato sottile di adesivo tangle trap sul foglio, lasciando libere dalle parti superiore e inferiore una superficie sufficiente per poterlo afferrare. Dopo che l'adesivo sul foglio si è asciugato per un'ora, inserire il foglio all'interno del cilindro di volo con la parte adesiva rivolta verso l'interno.

Successivamente, assemblare il binario della fotocamera utilizzando staffe di sostegno in pino. Assicurarsi che la parte inferiore del binario possa sostenere la fotocamera senza ostruire l'obiettivo. Quindi avvitare i fermi in posizione in modo che non interrompano la visuale della fotocamera sul foglio di plastica.

Raccogliere le provette con le mosche da sottoporre a test, con non più di 20 mosche per provetta. Tamporre delicatamente il fondo della provetta per far cadere le mosche in basso. Svitare il tappo della provetta e inserirla nel tubo di caduta.

Rilasciare la provetta. Quando la provetta urta le pareti del imbuto restringente, i moscerini vengono espulsi nel cilindro di volo. Sollevare il tubo di caduta per rimuovere la provetta vuota e caricare altri moscerini, se desiderato.

Fino a 200 moscerini prelevati da 10 provette possono essere testati e immagini facilmente su un singolo foglio di poliacrilammide. Ora, rimuovere il foglio di plastica e posizionarlo su una superficie bianca piana; può essere utilizzato un cartellone bianco se i piani di lavoro sono di colore scuro. Assemblare il binario della fotocamera sopra il foglio di plastica.

La telecamera deve essere posizionata abbastanza in alto rispetto al foglio da includere sia l'estremità superiore che quella inferiore nel campo visivo. Far scorrere la telecamera lungo il binario tenendo premuto il pulsante di acquisizione per ottenere un'immagine panoramica. Il numero di moscerini che atterrano nell'olio presente nella capsula al di sotto della camera di volo può essere contato manualmente.

Per ogni prova tra le prove, le mosche possono essere rimosse dal foglio e il foglio può essere riutilizzato. Aprire i file delle immagini nel software ImageJ e ritagliare le immagini, se necessario, in modo da includere esclusivamente l'area della superficie di atterraggio. L'area ricoperta dalla trappola incollante.

Convertire le immagini in scala di grigi a otto bit e creare una soglia. Per filtrare lo sfondo bianco. Impostare i parametri per identificare ogni mosca.

Utilizzando il menu "analisi delle particelle", definire i parametri. Utilizzato per identificare una particella mediante l'apparecchiatura dimostrativa. Un'area compresa tra cinque e 90 pixel quadrati e una circolarità compresa tra 0,4 e 1,0 identificherà con precisione tutti i campioni.

Ora, misurare la posizione di ciascuna mosca utilizzando l'elenco generato di coordinate per ogni particella. La coordinata X in pixel può essere convertita in centimetri. Per calcolare l'altezza di atterraggio, importare la tabella in un foglio elettronico ed eseguire l'analisi.

Le prestazioni di volo delle mosche mutant slow poke, che presentano un difetto di volo noto, sono state confrontate con quelle delle mosche di tipo selvatico canton s. Tutte le mosche avevano tre giorni di vita e sono state allevate a temperatura ambiente; le mosche di controllo atterravano in modo costante vicino alla sommità del cilindro. La dispersione dei punti di atterraggio era molto maggiore per i mutanti slow poke.

L'altezza media di atterraggio per i cantoni a 73 centimetri era significativamente maggiore rispetto a quella dei mutanti slow poke a 44 centimetri. Dopo questa procedura, metodi aggiuntivi come l'istologia possono essere utilizzati per rispondere ad altre domande riguardo l'integrità strutturale dei muscoli del volo, dei neuroni motori o delle giunzioni neuromuscolari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sia possibile valutare rapidamente le prestazioni di volo negli oph.