Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo Drosophila

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare rapidamente e accuratamente le prestazioni di volo in Drosophila. Ciò si ottiene facendo prima cadere le mosche in un cilindro di volo. Il secondo passo della procedura consiste nell'acquisire immagini della superficie di atterraggio con una fotocamera digitale.

Il passaggio finale consiste nell'analizzare i dati utilizzando un software di imaging misurando l'altezza di atterraggio di ogni mosca. In definitiva, questa procedura aiuta a identificare mutazioni e condizioni come l'invecchiamento o la neurodegenerazione, che compromettono la capacità di volo e aiuta a quantificare le prestazioni di volo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il tester di volo originale, è che è più appropriata per gli screening ad alto rendimento per mutanti e altre condizioni che compromettono il volo.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto di quanto tempo fosse necessario per testare un gran numero di genotipi utilizzando il tester di volo originale. Fissare il cilindro di volo a un supporto ad anello utilizzando la catena clamps. Lasciare circa tre centimetri sotto il cilindro per il piatto da strada.

Caricare il piatto di guida con un sottile strato di olio minerale e farlo scorrere sotto il cilindro di volo. Fissare l'imbuto a un secondo supporto ad anello. Regolare l'altezza dell'imbuto in modo che la parte inferiore dell'imbuto sia a filo con la parte superiore del cilindro di volo.

La parte più stretta dell'imbuto deve essere più stretta di una fiala di mosca. Il diametro del tubo di caduta deve essere leggermente più largo di una fiala di mosca, in modo che la fiala sia in grado di cadere liberamente. Inserire il tubo di caduta nella parte superiore dell'imbuto e fissarlo con un morsetto ad artiglio.

Successivamente, da un foglio di poliacrilammide, tagliare un pezzo rettangolare della lunghezza del cilindro di volo con una larghezza leggermente inferiore alla circonferenza interna del cilindro di volo. Applicare uno strato sottile di adesivo per trappole per grovigli sul foglio, lasciando abbastanza spazio nella parte superiore e inferiore non rivestito per trattenere il foglio. Dopo che l'adesivo sul foglio si è asciugato per un'ora, far scorrere il foglio nel cilindro di volo con l'adesivo verso l'interno.

Quindi, assemblare il binario della fotocamera utilizzando le staffe di supporto in pino. Assicurarsi che la parte inferiore del binario possa sostenere la fotocamera senza bloccare l'obiettivo. Quindi avvitare i tappi in posizione in modo che non interrompano la visuale della telecamera sul foglio di plastica.

Raccogli le fiale di mosche da testare con non più di 20 mosche per fiala. Picchiettare delicatamente le mosche sul fondo della fiala. Scollegare il flaconcino e inserirlo nel tubo di rilascio.

Rilasciare il flaconcino. Quando la fiala colpisce le pareti dell'imbuto di restringimento, le mosche che vengono espulse nel cilindro di volo. Sollevare il tubo di caduta per rimuovere la fiala vuota e caricare altre mosche se lo si desidera.

È possibile testare e visualizzare facilmente fino a 200 mosche caricate da 10 fiale su un singolo foglio di poliacrilammide. Ora, rimuovi il foglio di plastica e posizionalo su una superficie bianca piatta è possibile utilizzare un pannello per poster bianco se i piani di lavoro sono di colore scuro. Assemblare il binario della telecamera sul foglio di plastica.

La fotocamera deve essere sufficientemente alta rispetto al foglio in modo da avere sia la parte superiore che quella inferiore del foglio nel campo visivo. Fai scorrere la fotocamera lungo la pista tenendo premuto il pulsante di acquisizione per acquisire un'immagine panoramica. Il numero di mosche che atterrano nell'olio nella capsula sotto la camera di volo può essere contato manualmente.

Per ogni prova tra una prova e l'altra, le mosche possono essere rimosse dal foglio e il foglio può essere riutilizzato. Aprire i file immagine nel software immagine J, ritagliare le immagini se necessario per includere solo l'area della superficie di atterraggio. La trappola per aggrovigliamenti rivestita in area.

Converti le immagini in una scala di grigi a otto bit e crea una soglia. Per filtrare lo sfondo bianco. Imposta i parametri per identificare ogni mosca.

Utilizzando il menu analizza particelle, definire i parametri. Utilizzato per identificare una particella utilizzando l'apparato dimostrativo. Un'area da cinque a 90 pixel quadrati e una circolarità da 0,4 a 1,0 identificheranno con precisione tutti i campioni.

Ora, misura la posizione di ogni mosca utilizzando l'elenco generato di coordinate per ogni particella. La coordinata X in pixel può essere convertita in centimetri. Per calcolare l'altezza del pianerottolo, importare la tabella in un foglio di calcolo e procedere con l'analisi.

Le prestazioni di volo delle mosche mutanti slow poke, che hanno un difetto di volo noto, sono state confrontate con le mosche di Canton di tipo selvatico. Tutte le mosche avevano tre giorni, allevate a temperatura ambiente, le mosche atterravano costantemente vicino alla parte superiore del cilindro. La diffusione dell'atterraggio era molto maggiore per i mutanti a poke lento.

L'altezza media di atterraggio per i cantoni, pari a 73 centimetri, era significativamente maggiore di quella dei mutanti a poke lento, pari a 44 centimetri. Dopo questa procedura, è possibile utilizzare metodi aggiuntivi come l'istologia per rispondere a ulteriori domande riguardanti l'integrità strutturale dei muscoli del volo, dei motoneuroni o delle giunzioni neuromuscolari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare rapidamente le prestazioni di volo in oph.