Test

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un semplice test del labirinto a Y per valutare l'olfatto in Drosophila melon Gaster. Questo viene realizzato innanzitutto privando le mosche del cibo per 16-18 ore, in modo da motivarle ad esplorare nuovi ambienti in presenza di stimoli volatili. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'assemblare l'apparato del labirinto a Y contenente le fonti di odore su carta da filtro, come acido acetico in solvente rispetto al solo solvente.

Il terzo passaggio consiste nell'introdurre rapidamente e delicatamente le mosche nel vial di carico. Dopo diverse ore, l'ultimo passaggio prevede la valutazione della posizione delle mosche nel labirinto. In definitiva, i risultati possono mostrare una risposta all'odorante a partire dai dati ottenuti con il labirinto a Y.

Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo deciso di sviluppare un approccio semplice ed economico per testare la risposta olfattiva dei phyla. Un vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre opzioni è che permette alle mosche di prendere una decisione senza subire troppo stress. A dimostrare la procedura sarà Megan Simon, una studentessa di dottorato del mio laboratorio. Per questo protocollo, preparate una linea di mosche ISO-inizzata con fenotipi comportamentali stabili e robusti. Qualsiasi ceppo di questo tipo può essere utilizzato come controllo di riferimento per il test olfattivo; per ogni ceppo genetico da utilizzare nell'esperimento, effettuate un incrocio ripetuto con il ceppo di riferimento per cinque generazioni.

Accoppia femmine della singola ceppa sperimentale con alcuni maschi isogenici per ogni incrocio retrogrado. Per esperimenti olfattivi, alleva la drosophila su un mezzo standard a base di farina di mais con un antibiotico, in condizioni di ciclo luminoso 12:12 e a 25 gradi Celsius.

Gli esperimenti devono sempre essere eseguiti a 25 gradi Celsius e sotto luce nello spettro del rosso estremo, non visibile per Drosophila. È inoltre necessario poter ventilare completamente la stanza tra un esperimento e l'altro prima di eseguire il saggio la mattina successiva. Alla fine della giornata, trasferire cohorti di 10-20 linee sperimentali in provette di vetro con umidità fornita da un panno bagnato.

I moscerini devono essere testati entro 16-18 ore, altrimenti potrebbero morire a causa della disidratazione o della fame il giorno successivo. Assemblare il labirinto a Y. Iniziare collegando il connettore a forma di Y a due provette di vetro mediante connettori in schiuma con estremità di pipetta tagliate, che formano condotti; la loro forma conica rende questi passaggi unidirezionali.

Il terzo ramo della Y è collegato a un tubo di caricamento realizzato con la parte più grande di una punta di pipetta e permette il passaggio dal flaconcino di caricamento al punto di scelta del labirinto. Oltre ciascun tunnel convergente si trova un flaconcino di vetro, uno dei quali deve essere caricato con una sostanza odorosa. Queste consistono in bolle da 40 microlitri assorbite in quadrati di carta assorbente di 28 millimetri.

Quale dei due contiene l'odorante deve alternarsi casualmente per condurre il test per primo. Raffreddare. Mettere brevemente le mosche sul ghiaccio, in modo che rallentino. L'operazione deve essere eseguita sotto luce rossa lontana da lampadine LED e a 25 gradi Celsius, quindi lasciare cadere delicatamente il gruppo di mosche nel vial di carico e caricare il labirinto a Y con le mosche da testare.

Non utilizzare anestesia gassosa. È estremamente importante trasferire le mosche nel vial di carico rapidamente e delicatamente. In effetti, questa è la fase più difficile dell'esperimento perché le mosche devono riprendere conoscenza rapidamente prima della diffusione delle altre nella massa Y.

Si deve permettere alle mosche di esplorare il labirinto per 24 ore, in modo che un numero massimo di mosche si sposti in una delle due provette di vetro. Il numero di mosche presenti nei diversi tubi serve per calcolare l'indice olfattivo. Si devono applicare metodi statistici standard a questo valore ottenuto dal comportamento di fino a 10 mosche.

Se 10 gruppi di moscerini non forniscono risultati coerenti, le prove possono essere eseguite con 20 gruppi di moscerini. Per pulire le componenti del labirinto, immergerle smontate in RBS 35 MD durante la notte. Procedere quindi con risciacqui in acqua corrente e un risciacquo finale in acqua deionizzata prima dell'essiccazione all'aria.

Risposte standard a un odorante. Utilizzando il labirinto a Y si possono osservare attrazione, indifferenza o evitamento. Ad esempio, le mosche Canton evitano fortemente l'acido acetico al 10%, mentre non evitano l'acido fenilacetico al 10%.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che questo saggio d'onda può rappresentare un ambiente artificiale per i moscerini. Seguendo questa procedura come metodo, esperimenti come l'arena di gruppo o saggi interni possono essere eseguiti al fine di confermare le risposte olfattive dei moscerini e le diverse condizioni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come testare semplicemente le risposte olfattive dei filano gaste utilizzando il saggio SW.