Name: Test Drosophila Olfatto con un test Y-maze (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Scopri come testare l'olfatto in Drosophila melanogaster con un saggio a Y-maze semplice ed economico. Questo metodo permette di valutare le risposte comportamentali agli odoranti in modo riproducibile.

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Ringraziamo 4 utenti anonimi per il loro lavoro per migliorare il manoscritto. Ringraziamo il Centre National de la Recherche Scientifique per il suo sostegno finanziario alle MBG e YG, e l&#39;Université de Bourgogne e il Ministero della Ricerca francese MMS. La ricerca in laboratorio YG è finanziato dal Consiglio europeo della ricerca (ERC Starting Grant, GliSFCo-311.403), l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), il Conseil Régional de Bourgogne (Faber), e il CNRS.

1. Prima di iniziare <ol><li> Utilizzare un archivio di riferimento isogenized cuscinetto fenotipi comportamentali stabili e robusti. Non esiste una regola generale per la scelta di questa azione, dal momento che tutti i controlli possibili possono portare sfondo eterogenei alleli. </li><li> Utilizzare questo ceppo di controllo per backcross ogni altra azione necessaria per le fasi successive. Questo passo backcrossing è tipicamente rappresentato da almeno cinque croci successivi di una singola femmina vergine (per permettere possibile crossing-over tra cromosomi omologhi) per 2-3 isogeni maschi di riferimento 5. Questo passo è importante per omogeneizzare il background genetico tra le diverse popolazioni della mosca. </li><li> Mantenere scorte Drosophila su una farina di mais normale (9%), lievito (10%), e agar (1,5%) integrato con antibiotico (0,4% di metile para-idrossi-benzoato) in un ciclo luce / buio di 12 ore a 25 ° C. </li><li> Raggiungere esperimenti chemiosensoriali in una stanza a temperatura controllata (25 ° C) sotto la luce rosso lontano(Per eliminare il contributo dei riferimenti visivi, e di concentrarsi sui segnali chemosensoriali). Rinnovare regolarmente l&#39;aria della camera di ventilare l&#39;area tra ogni esperimento. </li></ol> 2. Risposta olfattiva utilizzando un test Y-maze <ol><li> Morire di fame in linea per 16-18 ore a 25 ° C in tubi di vetro contenenti carta asciugamano bagnato prima del test. </li><li> Partecipa a un connettore a forma di Y a due fiale di vetro e una fiala di plastica più piccolo (carico flaconcino). Utilizzare 1 ml punte di pipetta che passano attraverso i tappi di schiuma per collegare il connettore al tre fiale, e avere un Y-labirinto ermeticamente chiusi. Tagliate le estremità strette di due punte per pipette (~ 2 mm di diametro, per evitare qualsiasi ritorno della mosca una volta che ha preso la sua decisione) per formare due fiale &quot;trappola&quot;, e un grande fine di un puntale per formare il &quot;loading&quot; tubo (Figura 1A). </li><li> Appena prima di collegare i flaconi &quot;trappola&quot; (Figura 1B), mettere un ~ 6 millimetri carta filtro diametroogni flacone. Aggiungere 40 ml di soluzione di odorizzante su una carta da filtro, e 40 ml di solvente corrispondente sulla seconda carta da filtro. </li><li> Introdurre dieci 4-9 linea di un giorno nel flaconcino &quot;loading&quot;. Non utilizzare CO 2 anestesia durante questo trasferimento, poiché ha un forte effetto sul comportamento 10. Piuttosto usare breve raffreddamento sul ghiaccio. Manipolazione corretta di mosche anestetizzati è importante limitare lo stress sugli argomenti più possibile. <ol><li> Eseguire una serie di test Y-maze a 25 ° C sotto luce rosso lontano (utilizzando lampadine a LED per limitare possibile fonte di riscaldamento) per evitare stimoli visivi per quanto possibile. Prestare attenzione ad alternare gli orientamenti delle Y-labirinti (odorizzante contenente tubo sulla sinistra o sulla destra, e il tubo di carico nella parte anteriore o sul retro; la figura 1C). </li><li> Consentire diverse ore per le mosche di entrare nel flaconcino trappola contenente l&#39;odorizzante o il solvente. Conte vola dopo 24 ore di aumentare la participativia fino a più di 80% e fornire il valore di indice olfattivo massimo (Simonnet, comunicazione personale). </li><li> Calcolare l&#39;indice olfattivo risultante utilizzando la seguente formula: (numero nel tubo odore - Codice nel tubo solvente) / numero totale di mosche caricati. </li></ol></li><li> Wash Y-maze set-up come segue: immergere la smontato set-up in RBS 35 MD durante la notte. Sciacquare accuratamente con acqua del rubinetto. Infine sciacquare con acqua deionizzata e lasciare asciugare. </li></ol> 3. Analisi statistica dei dati <ol><li> Eseguire un t-test, un one-way ANOVA o una ANOVA a due vie a seconda dei dati e variabili. </li></ol>

<ol><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li>
<li>Silbering, A. F., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionotropic+and+metabotropic+mechanisms+in+chemoreception%3A+%27chance+or+design%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design.</a> EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).</li>
<li>Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smell+of+love+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The smell of love in Drosophila.</a> Front. Physiol. 4, (2013).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478, 236-240 (2011).</li>
<li>Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+olfactory+behavior+in+Drosophila%3A+a+new+screen+yields+the+ota+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants.</a> Genetics. 123, 315-326 (1989).</li>
<li>Semmelhack, J. L., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Select+Drosophila+glomeruli+mediate+innate+olfactory+attraction+and+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion.</a> Nature. 459, 218-223 (2009).</li>
<li>Budick, S. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-flight+responses+of+Drosophila+melanogaster+to+attractive+odors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).</li>
<li>Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+cAMP+transduction+pathway+modify+olfaction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).</li>
<li>Barron, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetising+Drosophila+for+behavioural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Anaesthetising Drosophila for behavioural studies.</a> Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).</li>
<li>Ai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li>
<li>Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flying+the+fly%3A+long-range+flight+behavior+of+Drosophila+melanogaster+to+attractive+odors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors.</a> J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il nostro protocollo Y-labirinto è basato su un protocollo precedentemente descritto 9. Tuttavia, introduciamo due importanti differenze. In primo luogo, usiamo puntali delle pipette strette per evitare che le mosche di tornare una volta che decidono di entrare nel flaconcino contenente il solvente o il solvente più l&#39;odorizzante. Questi suggerimenti strette sono utili anche per limitare la diffusione odorizzante in Y-labirinto. In secondo luogo, usiamo un carico flacone più piccolo per costringere le mos...

Chemoreception attraverso il gusto e l&#39;olfatto è una modalità sensoriale fondamentale per la sopravvivenza degli animali. Dà segnali vitali necessarie per la rivelazione di un pericolo o fonti di cibo, così come per le interazioni sociali. Essa aiuta anche gli animali di trovare un partner sessuale necessaria per la loro riproduzione. Per più di 20 anni, un&#39;intensa attività di ricerca, comprese Nobel vincitore del premio opera di Richard Axel e Linda Buck nel 2004 &quot;per le loro scoperte di recettori olfattivi e l&#39;organizzazione del sistema olfattivo&quot;, è stata effettuata per rivelare le basi molecolari e cellulari della olfatto 1,2. Uno dei modelli animali preferiti per gli scienziati per analizzare la percezione olfattiva è D. melanogaster. Questo insetto condivide una strategia simile odore di codifica cellulari e molecolari con i mammiferi. La comunità scientifica utilizza diversi paradigmi comportamentali per studiare il ruolo di odoranti in questa mosca della frutta. Questi test includono test multimodali come courtshitest p dove le varie modalità sensoriali, tra cui l&#39;olfatto, sono importanti per suscitare corteggiamento maschile 3. Altri saggi sono stati sviluppati anche per affrontare il ruolo di odoranti più specificamente; questi includono T-labirinti, Y-labirinti, saggi trappola, arene quattro campo e wind-tunnel 4,5,6,7,8. In questo articolo vi presentiamo un semplice modificata test Y-labirinto, che fornisce risposte olfattive robuste con D. melanogaster. Il nostro set-up usi finali suggerimenti in contrasto con un metodo descritto in precedenza 9. Così, la nostra Y-labirinto ha due vantaggi. In primo luogo, evita qualsiasi ritorno nel sistema una volta la mosca ha fatto la sua scelta. In secondo luogo, essa limita lo scambio di odoranti in tutte le aree del Y-labirinto. Quest&#39;ultimo vantaggio è importante poiché Drosophila sono molto sensibili al flusso d&#39;aria che viene spesso utilizzato per evitare la saturazione odorizzante. Per regolare il set-up sperimentale con un flusso d&#39;aria sarebbe tempo e costo consumo. Pertanto, il nostro test Y-labirinto rappresenta un efciente e veloce per testare le prestazioni olfattiva di Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Tubo in polistirene</td><td>VWR europe</td><td>734-2255</td><td>30 x 25 mm&nbsp; labirinto</td></tr> a <tr><td>Y Drosophila Tubo borosilicato</td><td>Digione verre</td><td></td><td>95 X 25 mm labirinto</td></tr><tr><td>a Y Tappo in schiuma</td><td>Dutscher</td><td>999038</td><td> labirinto a Y</td></tr><tr><td>Connettore a forma di Y</td><td>Europrix</td><td>11020605</td><td> labirinto a Y</td></tr><tr><td>100-1.000 &; l. puntali per pipette</td><td>Corning</td><td>4868</td><td>Unire i seguenti puntali per pipette al connettore a forma di Y. Tagliare 2 puntali per pipette a 65 mm dall'estremità larga e collegare l'estremità stretta (con un &sim; 2 mm di apertura) a 2 fiale di test. Queste aperture limiteranno le inversioni a U una volta che le mosche entreranno nei tubi contenenti gli odori. Tagliare 1 punta della pipetta a 35 mm dall'estremità larga e collegarla alla fiala di caricamento. Y-maze</td></tr><tr><td>Far-Red LED Lampadina</td><td>Rubin-Lacaque</td><td>0RB180238</td><td>625-630 nm</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45725</td><td></td></tr><tr><td>Acido fenilacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P16621</td><td></td></tr><tr><td>Lievito</td><td>Sensient Aromi Strasburgo</td><td>1018880464</td><td></td></tr><tr><td>Farina</td> <td>di maiseurogerm</td><td>Farine de ma&iuml; s</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Kalys</td><td>HP-697-25</td><td></td></tr><tr><td>Metil idrossi 4 benzoato</td><td>VWR international</td><td>25605293</td><td></td></tr></tbody></table>

test<em&gt; drosophila</em&gt; olfatto con un test y-maze

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

Rilevare i segnali dall&#39;ambiente è essenziale per gli animali per garantire la loro sopravvivenza. A questo scopo, usano stimoli ambientali come la visione, mechanoreception, l&#39;udito, e chemoperception attraverso il gusto, attraverso il contatto diretto o attraverso l&#39;olfatto, che rappresenta la risposta ad una molecola instabile che agisce a lungo raggio. Molecole chimiche volatili sono segnali molto importanti per la maggior parte degli animali nella rilevazione di pericolo, una fonte di cibo, o per comunicare tra gli individui. Drosophila melanogaster è uno dei modelli biologici più comuni per gli scienziati di esplorare le basi cellulari e molecolari di olfatto. Al fine di evidenziare le capacità olfattive di questo piccolo insetto, descriviamo un protocollo scelta modificato in base al test Y-maze usato classico con i topi. I dati ottenuti con Y-labirinti forniscono informazioni preziose per comprendere meglio come gli animali che fare con il loro ambiente in perenne mutazione. Introduciamo un protocollo passo-passo per studiare laimpatto della odoranti sul fly risposta esplorativo da questo test Y-labirinto.

Figura 1D mostra due risposte di rappresentanza di questo test Y-labirinto. Maschi Canton-S evitare fortemente 10% di acido acetico diluito in acqua distillata, mentre non evitano significativamente il 10% di acido fenilacetico. Questi test sono basati su 10 maschi per replica messi insieme nelle fiale di carico. Questo protocollo volte può portare a un notevole errore standard della media. Se necessario, è possibile ridurre questo inconveniente utilizzando 20 maschi per replicati anziché soltanto 10. M...

Vi presentiamo un test di scelta per rivelare l&#39;influenza di odoranti sul comportamento Drosophila utilizzando un test Y-labirinto.

Test<em&gt; Drosophila</em&gt; Olfatto con un test Y-maze

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un semplice test del labirinto a Y per valutare l'olfatto in Drosophila melon Gaster. Questo viene realizzato innanzitutto privando le mosche del cibo per 16-18 ore, in modo da motivarle ad esplorare nuovi ambienti in presenza di stimoli volatili. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'assemblare l'apparato del labirinto a Y contenente le fonti di odore su carta da filtro, come acido acetico in solvente rispetto al solo solvente.Il terzo passaggio consiste nell'introdurre rapidamente e delicatamente le mosche nel vial di carico. Dopo diverse ore, l'ultimo passaggio prevede la valutazione della posizione delle mosche nel labirinto. In definitiva, i risultati possono mostrare una risposta all'odorante a partire dai dati ottenuti con il labirinto a Y.Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo deciso di sviluppare un approccio semplice ed economico per testare la risposta olfattiva dei phyla. Un vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre opzioni è che permette alle mosche di prendere una decisione senza subire troppo stress. A dimostrare la procedura sarà Megan Simon, una studentessa di dottorato del mio laboratorio. Per questo protocollo, preparate una linea di mosche ISO-inizzata con fenotipi comportamentali stabili e robusti. Qualsiasi ceppo di questo tipo può essere utilizzato come controllo di riferimento per il test olfattivo; per ogni ceppo genetico da utilizzare nell'esperimento, effettuate un incrocio ripetuto con il ceppo di riferimento per cinque generazioni.Accoppia femmine della singola ceppa sperimentale con alcuni maschi isogenici per ogni incrocio retrogrado. Per esperimenti olfattivi, alleva la drosophila su un mezzo standard a base di farina di mais con un antibiotico, in condizioni di ciclo luminoso 12:12 e a 25 gradi Celsius.Gli esperimenti devono sempre essere eseguiti a 25 gradi Celsius e sotto luce nello spettro del rosso estremo, non visibile per Drosophila. È inoltre necessario poter ventilare completamente la stanza tra un esperimento e l'altro prima di eseguire il saggio la mattina successiva. Alla fine della giornata, trasferire cohorti di 10-20 linee sperimentali in provette di vetro con umidità fornita da un panno bagnato.I moscerini devono essere testati entro 16-18 ore, altrimenti potrebbero morire a causa della disidratazione o della fame il giorno successivo. Assemblare il labirinto a Y. Iniziare collegando il connettore a forma di Y a due provette di vetro mediante connettori in schiuma con estremità di pipetta tagliate, che formano condotti; la loro forma conica rende questi passaggi unidirezionali.Il terzo ramo della Y è collegato a un tubo di caricamento realizzato con la parte più grande di una punta di pipetta e permette il passaggio dal flaconcino di caricamento al punto di scelta del labirinto. Oltre ciascun tunnel convergente si trova un flaconcino di vetro, uno dei quali deve essere caricato con una sostanza odorosa. Queste consistono in bolle da 40 microlitri assorbite in quadrati di carta assorbente di 28 millimetri.Quale dei due contiene l'odorante deve alternarsi casualmente per condurre il test per primo. Raffreddare. Mettere brevemente le mosche sul ghiaccio, in modo che rallentino. L'operazione deve essere eseguita sotto luce rossa lontana da lampadine LED e a 25 gradi Celsius, quindi lasciare cadere delicatamente il gruppo di mosche nel vial di carico e caricare il labirinto a Y con le mosche da testare.Non utilizzare anestesia gassosa. È estremamente importante trasferire le mosche nel vial di carico rapidamente e delicatamente. In effetti, questa è la fase più difficile dell'esperimento perché le mosche devono riprendere conoscenza rapidamente prima della diffusione delle altre nella massa Y.Si deve permettere alle mosche di esplorare il labirinto per 24 ore, in modo che un numero massimo di mosche si sposti in una delle due provette di vetro. Il numero di mosche presenti nei diversi tubi serve per calcolare l'indice olfattivo. Si devono applicare metodi statistici standard a questo valore ottenuto dal comportamento di fino a 10 mosche.Se 10 gruppi di moscerini non forniscono risultati coerenti, le prove possono essere eseguite con 20 gruppi di moscerini. Per pulire le componenti del labirinto, immergerle smontate in RBS 35 MD durante la notte. Procedere quindi con risciacqui in acqua corrente e un risciacquo finale in acqua deionizzata prima dell'essiccazione all'aria.Risposte standard a un odorante. Utilizzando il labirinto a Y si possono osservare attrazione, indifferenza o evitamento. Ad esempio, le mosche Canton evitano fortemente l'acido acetico al 10%, mentre non evitano l'acido fenilacetico al 10%.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che questo saggio d'onda può rappresentare un ambiente artificiale per i moscerini. Seguendo questa procedura come metodo, esperimenti come l'arena di gruppo o saggi interni possono essere eseguiti al fine di confermare le risposte olfattive dei moscerini e le diverse condizioni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come testare semplicemente le risposte olfattive dei filano gaste utilizzando il saggio SW.

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In questo articolo il video, si descrive un metodo nuovo che consente la costruzione di gradienti di odorizzante con geometrie stabili e controllabili. Abbiamo brevemente illustrare come questi gradienti possono essere usati per lo screening dei difetti olfattivi (anosmia totale e parziale) e di studiare le caratteristiche più sottili del comportamento chemiotassi.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Test per misurare il comportamento delle funzioni locomotore, apprendimento, memoria e abilità...

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Drosophila melanogaster è un sistema genetico e comportamentale del modello trattabile che è stato utilizzato per comprendere le basi molecolari e cellulari di molti importanti processi biologici per oltre un secolo 1. Drosophila è stata ben sfruttata per acquisire conoscenze in base genetica del comportamento mosca.

Metodi per test Drosophila Comportamento

I moscerini della frutta hanno un sistema olfattivo complesso, possono discriminare centinaia di odori e usano il loro senso dell'olfatto per indirizzare le decisioni comportamentali. Questo video descrive il test dell'olfattometro a quattro vie, un metodo per studiare le risposte comportamentali olfattive nei moscerini. La clip del protocollo in primo piano mostra come gestire le mosche di prova e quali sono i passaggi critici durante l'esecuzione del test.

Saggio dell'olfattometro a quattro vie: un metodo per valutare le risposte degli odori in Drosophila

Questo video descrive un metodo per testare il comportamento esplorativo olfattivo nel moscerino della frutta, chiamato labirinto a Y. La clip del protocollo in primo piano mostra come impostare ed eseguire il test.

drosofila Saggio del labirinto a Y: un metodo per valutare le risposte olfattive nelle mosche

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