Name: Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel Drosophila Antenna (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Scopri l'immunomarcatura whole mount delle antenne di Drosophila per visualizzare i neuroni recettori olfattivi. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi molecolari della diversificazione neuronale nel sistema olfattivo.

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Questo studio è stato supportato da MEXT supportata Programma per la Fondazione per la ricerca strategica presso Università private e JSPS Young Scientist B sovvenzione per HT Vorremmo ringraziare Ohtake Norihito per modificare i video clip.

1. Preparare piastra apple <ol><li> Miscelare 12,5 g di agar, 125 ml 100% disponibile in commercio succo di mela, 12,5 g di glucosio, e 375 ml di H 2 O. Microonde la miscela per 1 a 2 minuti e versare al piatto di coltura cellulare 3 cm. Conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. Croce genetica <ol><li> Utilizzare la seguente incrocio genetico rappresentante: </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x w 1118 3. Dissection e colorazione protocollo <ol><li> Anestetizzare al volo e poi tagliare la testa fly verticale tenendolo con una pinza. </li><li> Posizionare con cura la porzione di antenne che contiene su un piatto di mela. </li><li> Tagliare il terzo segmento dell&#39;antenna utilizzando sottili forbici dissezione. </li><li> Porre 90 ml di soluzione di fissaggio (4% paraformaldeide in 0,1% PBST (PBS con 0,1% Triton X-100)) a mezzo di un piatto di coltura fondo di vetro. </li><li> Trasferire delicatamente la antenn sezionatoae con un ago appuntito direttamente alla soluzione di fissaggio. Se necessario, immergere fisicamente le antenne nella soluzione con ago. </li><li> Incubare per 40 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare le antenne a 0,4% PBST (PBS con 0,4% Triton X-100), 3x 10 minuti ciascuna, mantenendoli nello stesso piatto. Utilizzare punte gialle per rimuovere e aggiungere la soluzione PBST. Utilizzare 90 ml di soluzione di lavaggio ogni volta. NOTA: Non mettere il piatto in uno shaker durante immunoistochimica. Prima di togliere o aggiungere la soluzione nella capsula, portare tutte le antenne al centro del piatto usando l&#39;ago e aggiungere o rimuovere accuratamente la soluzione dal bordo del piatto. </li><li> Bloccare le antenne con 90 ml di siero di cavallo normale 5% a 0,1% PBST per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo aver rimosso la soluzione di saturazione, incubare le antenne con 90μl di anticorpi primari a 0,1% PBST contenente siero di cavallo 5% per 48 ore a 4 ° C in un contenitore umido come descritto in precedenza <sup&gt; 8. </li><li> Lavare le antenne 6x 10 minuti a 0,4% PBST. </li><li> Incubare le antenne con 90 ml di anticorpi secondari a 0,1% PBST contenente siero di cavallo 5% per 48 ore a 4 ° C. Lavare 6x 10 minuti con 0,4% PBST. </li><li> Per montare le antenne, rimuovere PBST dal piatto di coltura, per quanto possibile e gradualmente introdurre due diverse concentrazioni di glicerolo al antenne. Aggiungere prima 40% glicerolo al piatto per 1 a 2 minuti; quindi rimuovere questo e aggiungere 80% di glicerolo. </li><li> Estrarre con cautela le antenne (compresi 80% glicerolo) dal piatto di coltura con punta gialla e metterli su un vetrino. Posizionare delicatamente un coprioggetto sulla parte superiore e sigillare i bordi coprioggetto con smalto. Le antenne sono ora pronti per essere ripreso al microscopio a fluorescenza. </li></ol>

<ol><li>Christensen, T. A., White, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristensen%2C+TA+%22Representation+of+olfactory+information+in+the+brain+In+The+Neurobiology+of+Taste+and+Smell%22">Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell</a>. , New York. 201-232 (2000).</li>
<li>Ache, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+common+strategy+for+transducing+olfactory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a common strategy for transducing olfactory information.</a> Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).</li>
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<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102, 147-159 (2000).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular%2C+anatomical+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La dissezione dell&#39;antenna Drosophila descriviamo è semplice e facile da eseguire in un ambiente di laboratorio. Per garantire una dissezione successo, è indispensabile utilizzare forbici multa taglio. Mentre immunoistochimica l&#39;antenna sezionato, è importante incubare in un contenitore pieno di umidità per evitare l&#39;evaporazione della soluzione di anticorpi. L&#39;antenna sezionato ha la tendenza a galleggiare nella soluzione. Uso 0.1% Triton in PBS durante la fissazione e blocco delle fasi facilit...

Il sistema olfattivo viene utilizzato per distinguere tra una immensa varietà di molecole di odore e successivamente inviare le informazioni risultanti ai centri cerebrali superiori. Questo ingresso permette di controllare con precisione i comportamenti animali fondamentali, come l&#39;alimentazione e l&#39;accoppiamento 1-6. Poichè ogni neurone olfattivo è associato a un insieme specifico di odori, la diversificazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN) s è essenziale per il corretto funzionamento del sistema olfattivo 7. La genetica Drosophila ci permette di eseguire un&#39;unica indagine a livello cellulare coinvolgendo meccanismi molecolari associati con lo sviluppo ORN e funzione fisiologica 8-16. Tutta monte immunoistochimica di Drosophila antenne ci ha permesso di capire più in dettaglio i meccanismi molecolari coinvolti nella diversificazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN) s 7. Qui forniamo una descrizione completa di un metodo semplice per achieve questo.

<table><tbody><tr><td>Microscopio per dissezione Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture con fondo in vetro&nbsp;</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Forbice da dissezione</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr>Studi sullo sviluppo<td>anti-ELAV per ratti</td><td>Banca di ibridomi</td><td>7E8A10</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Topo anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Asino Anti-coniglio IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Asino Anti-ratto IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-165-150</td><td>Diluizione 1:200</td></tr></tbody></table>

tutta monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; drosophila</em&gt; antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Molecole odoranti legano ai loro recettori bersaglio in modo preciso e coordinato. Ogni recettore riconosce un segnale specifico e trasmette queste informazioni al cervello. Come tale, determinando come informazioni olfattive viene trasferito al cervello, modificando sia percezione e comportamento, meriti indagine. È interessante notare, ci sono prove emergenti che i fattori di trasduzione e trascrizionali cellulari sono coinvolti nella diversificazione del neurone recettore olfattivo. Qui forniamo tutta una robusta montare metodo di etichettatura immunologico per eseguire il test in vivo olfattiva organizzazione neurone recettore. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato tutti i neuroni recettori olfattivi con l&#39;anticorpo anti-ELAV, un noto marcatore pan-neurale e Or49a-mCD8 :: GFP, un neurone recettore olfattivo specificamente indicato nella Nba neurone utilizzando un anticorpo anti-GFP.

Garantire che sia la dissezione e la fissazione vengono eseguite rapidamente è un fattore chiave per raggiungere il successo con questo protocollo. Utilizzando forbici sottili e pinze è fondamentale. Dopo immunostaining, antenne fluorescenti marcato sono state esaminate al microscopio confocale. Prendiamo normalmente sezioni 1μm usando una lente 20x. Abbiamo etichettato Nba 7 ORNs utilizzando Or49a-mCD8 :: GFP e contato il numero di Nba ORNs in wild-tipo di antenna. Il reporter mCD8-GFP è localizzato membrana...

Qui descriviamo il processo di immunocolorazione dell'intera montatura delle antenne di Drosophila, che ci permette di comprendere meglio i meccanismi molecolari coinvolti nella diversificazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN).

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare i neuroni recettori olfattivi mediante colorazione di antenne intere. Innanzitutto, anestetizzare la mosca per tagliarne la testa in senso verticale. Successivamente, posizionare la testa della mosca dissezionata su una piastra di mela.Quindi tagliare il terzo segmento dell'antenna e posizionarlo sulla piastra di coltura con fondo in vetro per eseguire l'immunohistochimica. Dopo aver montato le antenne su un vetrino, possiamo visualizzare i diversi tipi di neuroni recettori olfattivi mediante microscopia confocale hi. Stiamo lavorando sul sistema olfattivo.Il sistema olfattivo viene utilizzato per distinguere tra una grande varietà di altre molecole. L'ampia gamma di neuroni olfattivi distinti presenti in questo sistema consente una trasmissione precisa e coordinata delle informazioni dai recettori bersaglio ai neuroni all'interno del cervello. Oggi descriveremo la colorazione in toto dell'antenna per rilevare la diversificazione di questi neuroni recettori olfattivi.Per garantire una colorazione riuscita in montaggio integrale e delle antenne, è fondamentale preparare una soluzione di fissativo fresca immediatamente prim

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Descriviamo una tecnica consolidata per misurare e analizzare i cattivi odori evocati risposte di calcio nel lobo antennale di...

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

Per capire come forme cellulari complessi, come dendriti neuronali, vengono raggiunti durante lo sviluppo, è importante essere in grado di accuratezza dell'organizzazione test microtubuli. Qui si descrive un metodo robusto etichettatura immunoistologiche di esaminare l'organizzazione dei microtubuli dei dendriti arborizzazione dendritica neurone sensoriale, trachea, dei muscoli, e gli...

Etichettatura immunoistologiche di microtubuli in Neuron dendriti sensoriali, trachee, e Muscoli in Drosophila Larva parete del corpo

Questo video dimostra un protocollo dettagliato di immunocolorazione per visualizzare i difetti fenotipici nei corpi dei funghi dei cervelli mutanti di Drosophila. Il protocollo prevede l'utilizzo di anticorpi contro Fas2, una proteina coinvolta nella guida assonale che facilita il corretto sviluppo morfologico e funzionale del corpo del fungo.

Visualizzazione dei neuroni del corpo a fungo nel cervello di Drosophila tramite immunocolorazione

Presentiamo una tecnica per l'etichettatura singoli neuroni nel sistema nervoso centrale...

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Le ciglia dei neuroni sensoriali olfattivi contengono proteine della cascata di trasduzione del segnale, ma un'analisi spaziale dettagliata della loro distribuzione è difficile nelle criosezioni. Descriviamo qui un approccio ottimizzato per la marcatura dell'intera montatura e la visualizzazione en face delle proteine ciliari.

Tutta Monte Etichettatura del Cilia nel Main olfattivo Sistema di Mice

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare come presentare gli odoranti a bassa volatilità per la registrazione singolo-sensillare da parte dei neuroni del recettore olfattivo Drosophila che rispondono ai feromoni cuticolari a catena lunga.

Registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Drosophila</em&gt; Senso Trichoide in risposta a Odoranti di bassa volatilità

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Le cellule visualizzare diverse morfologie e stabilire una serie di interazioni con i loro vicini. Questo protocollo descrive come per rivelare la morfologia delle singole cellule e per indagare l'interazione cellula-cellula utilizzando il sistema di espressione Gal4/UAS ben consolidato.

Applicazione di MultiColor FlpOut tecnica per studiare ad alta risoluzione singola cella morfologie e interazioni delle cellule della Glia in Drosophila

Qui, presentiamo un protocollo per tappa e sezionare lo sviluppo di tessuto olfattivo da specie di Drosophila . Il tessuto dissecato più tardi può essere utilizzato per le analisi molecolari, quali quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) o RNA sequenziamento (RNAseq), così come in vivo analisi quali immunoistochimica o in situ ibridazione.

Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila

Questo protocollo descrive la procedura di dissezione, le condizioni di coltura e l'imaging dal vivo di un sistema di espianto antenna-cervello per lo studio dell'assemblaggio del circuito olfattivo.

Un sistema di espianto per studi di imaging time-lapse dell'assemblaggio di circuiti olfattivi in Drosophila

Questo articolo descrive un protocollo efficiente di dissezione immaginale del disco e colorazione degli anticorpi, economico con i reagenti e facilita la gestione di dischi immaginari in piccole quantità.

Dissezione su piccola scala e colorazione di anticorpi dei dischi immaginari occhio-antenna e alare da Drosophila melanogaster

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