Name: Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel Drosophila Antenna (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Scopri l'immunomarcatura whole mount delle antenne di Drosophila per visualizzare i neuroni recettori olfattivi. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi molecolari della diversificazione neuronale nel sistema olfattivo.

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Questo studio è stato supportato da MEXT supportata Programma per la Fondazione per la ricerca strategica presso Università private e JSPS Young Scientist B sovvenzione per HT Vorremmo ringraziare Ohtake Norihito per modificare i video clip.

1. Preparare piastra apple <ol><li> Miscelare 12,5 g di agar, 125 ml 100% disponibile in commercio succo di mela, 12,5 g di glucosio, e 375 ml di H 2 O. Microonde la miscela per 1 a 2 minuti e versare al piatto di coltura cellulare 3 cm. Conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. Croce genetica <ol><li> Utilizzare la seguente incrocio genetico rappresentante: </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x w 1118 3. Dissection e colorazione protocollo <ol><li> Anestetizzare al volo e poi tagliare la testa fly verticale tenendolo con una pinza. </li><li> Posizionare con cura la porzione di antenne che contiene su un piatto di mela. </li><li> Tagliare il terzo segmento dell&#39;antenna utilizzando sottili forbici dissezione. </li><li> Porre 90 ml di soluzione di fissaggio (4% paraformaldeide in 0,1% PBST (PBS con 0,1% Triton X-100)) a mezzo di un piatto di coltura fondo di vetro. </li><li> Trasferire delicatamente la antenn sezionatoae con un ago appuntito direttamente alla soluzione di fissaggio. Se necessario, immergere fisicamente le antenne nella soluzione con ago. </li><li> Incubare per 40 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare le antenne a 0,4% PBST (PBS con 0,4% Triton X-100), 3x 10 minuti ciascuna, mantenendoli nello stesso piatto. Utilizzare punte gialle per rimuovere e aggiungere la soluzione PBST. Utilizzare 90 ml di soluzione di lavaggio ogni volta. NOTA: Non mettere il piatto in uno shaker durante immunoistochimica. Prima di togliere o aggiungere la soluzione nella capsula, portare tutte le antenne al centro del piatto usando l&#39;ago e aggiungere o rimuovere accuratamente la soluzione dal bordo del piatto. </li><li> Bloccare le antenne con 90 ml di siero di cavallo normale 5% a 0,1% PBST per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo aver rimosso la soluzione di saturazione, incubare le antenne con 90μl di anticorpi primari a 0,1% PBST contenente siero di cavallo 5% per 48 ore a 4 ° C in un contenitore umido come descritto in precedenza <sup&gt; 8. </li><li> Lavare le antenne 6x 10 minuti a 0,4% PBST. </li><li> Incubare le antenne con 90 ml di anticorpi secondari a 0,1% PBST contenente siero di cavallo 5% per 48 ore a 4 ° C. Lavare 6x 10 minuti con 0,4% PBST. </li><li> Per montare le antenne, rimuovere PBST dal piatto di coltura, per quanto possibile e gradualmente introdurre due diverse concentrazioni di glicerolo al antenne. Aggiungere prima 40% glicerolo al piatto per 1 a 2 minuti; quindi rimuovere questo e aggiungere 80% di glicerolo. </li><li> Estrarre con cautela le antenne (compresi 80% glicerolo) dal piatto di coltura con punta gialla e metterli su un vetrino. Posizionare delicatamente un coprioggetto sulla parte superiore e sigillare i bordi coprioggetto con smalto. Le antenne sono ora pronti per essere ripreso al microscopio a fluorescenza. </li></ol>

<ol><li>Christensen, T. A., White, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristensen%2C+TA+%22Representation+of+olfactory+information+in+the+brain+In+The+Neurobiology+of+Taste+and+Smell%22">Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell</a>. , New York. 201-232 (2000).</li>
<li>Ache, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+common+strategy+for+transducing+olfactory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a common strategy for transducing olfactory information.</a> Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).</li>
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<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102, 147-159 (2000).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular%2C+anatomical+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La dissezione dell&#39;antenna Drosophila descriviamo è semplice e facile da eseguire in un ambiente di laboratorio. Per garantire una dissezione successo, è indispensabile utilizzare forbici multa taglio. Mentre immunoistochimica l&#39;antenna sezionato, è importante incubare in un contenitore pieno di umidità per evitare l&#39;evaporazione della soluzione di anticorpi. L&#39;antenna sezionato ha la tendenza a galleggiare nella soluzione. Uso 0.1% Triton in PBS durante la fissazione e blocco delle fasi facilit...

Il sistema olfattivo viene utilizzato per distinguere tra una immensa varietà di molecole di odore e successivamente inviare le informazioni risultanti ai centri cerebrali superiori. Questo ingresso permette di controllare con precisione i comportamenti animali fondamentali, come l&#39;alimentazione e l&#39;accoppiamento 1-6. Poichè ogni neurone olfattivo è associato a un insieme specifico di odori, la diversificazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN) s è essenziale per il corretto funzionamento del sistema olfattivo 7. La genetica Drosophila ci permette di eseguire un&#39;unica indagine a livello cellulare coinvolgendo meccanismi molecolari associati con lo sviluppo ORN e funzione fisiologica 8-16. Tutta monte immunoistochimica di Drosophila antenne ci ha permesso di capire più in dettaglio i meccanismi molecolari coinvolti nella diversificazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN) s 7. Qui forniamo una descrizione completa di un metodo semplice per achieve questo.

<table><tbody><tr><td>Microscopio per dissezione Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture con fondo in vetro&nbsp;</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Forbice da dissezione</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr>Studi sullo sviluppo<td>anti-ELAV per ratti</td><td>Banca di ibridomi</td><td>7E8A10</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Topo anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Asino Anti-coniglio IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Asino Anti-ratto IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-165-150</td><td>Diluizione 1:200</td></tr></tbody></table>

tutta monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; drosophila</em&gt; antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Molecole odoranti legano ai loro recettori bersaglio in modo preciso e coordinato. Ogni recettore riconosce un segnale specifico e trasmette queste informazioni al cervello. Come tale, determinando come informazioni olfattive viene trasferito al cervello, modificando sia percezione e comportamento, meriti indagine. È interessante notare, ci sono prove emergenti che i fattori di trasduzione e trascrizionali cellulari sono coinvolti nella diversificazione del neurone recettore olfattivo. Qui forniamo tutta una robusta montare metodo di etichettatura immunologico per eseguire il test in vivo olfattiva organizzazione neurone recettore. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato tutti i neuroni recettori olfattivi con l&#39;anticorpo anti-ELAV, un noto marcatore pan-neurale e Or49a-mCD8 :: GFP, un neurone recettore olfattivo specificamente indicato nella Nba neurone utilizzando un anticorpo anti-GFP.

Garantire che sia la dissezione e la fissazione vengono eseguite rapidamente è un fattore chiave per raggiungere il successo con questo protocollo. Utilizzando forbici sottili e pinze è fondamentale. Dopo immunostaining, antenne fluorescenti marcato sono state esaminate al microscopio confocale. Prendiamo normalmente sezioni 1μm usando una lente 20x. Abbiamo etichettato Nba 7 ORNs utilizzando Or49a-mCD8 :: GFP e contato il numero di Nba ORNs in wild-tipo di antenna. Il reporter mCD8-GFP è localizzato membrana...

Qui descriviamo il processo di immunocolorazione dell'intera montatura delle antenne di Drosophila, che ci permette di comprendere meglio i meccanismi molecolari coinvolti nella diversificazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN).

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare i neuroni recettori olfattivi mediante colorazione di antenne intere. Innanzitutto, anestetizzare la mosca per tagliarne la testa in senso verticale. Successivamente, posizionare la testa della mosca dissezionata su una piastra di mela.Quindi tagliare il terzo segmento dell'antenna e posizionarlo sulla piastra di coltura con fondo in vetro per eseguire l'immunohistochimica. Dopo aver montato le antenne su un vetrino, possiamo visualizzare i diversi tipi di neuroni recettori olfattivi mediante microscopia confocale hi. Stiamo lavorando sul sistema olfattivo.Il sistema olfattivo viene utilizzato per distinguere tra una grande varietà di altre molecole. L'ampia gamma di neuroni olfattivi distinti presenti in questo sistema consente una trasmissione precisa e coordinata delle informazioni dai recettori bersaglio ai neuroni all'interno del cervello. Oggi descriveremo la colorazione in toto dell'antenna per rilevare la diversificazione di questi neuroni recettori olfattivi.Per garantire una colorazione riuscita in montaggio integrale e delle antenne, è fondamentale preparare una soluzione di fissativo fresca immediatamente prima di iniziare il protocollo. Anestetizzare la mosca e quindi tagliare verticalmente la testa della mosca tenendo il corpo con una pinzetta. Ora, posizionare con attenzione l'antenna dissezionata su una piastra di mela.Tagliare il terzo segmento dell'antenna utilizzando forbici da dissezione fini. Posizionare 90 µL di soluzione fissativa al centro della piastra. Utilizzando un ago appuntito, trasferire delicatamente l'antenna dissezionata direttamente nella soluzione fissativa.Ora lasciare procedere la fissazione indisturbata per 40 minuti a temperatura ambiente per terminare la fissazione. Lavare le antenne tre volte con PBST per 10 minuti per ogni lavaggio durante la rimozione della soluzione di lavaggio. Per prima cosa, portare tutte le antenne al centro della piastra utilizzando un ago.Quindi rimuovere la soluzione dal lato della piastra. L'agitazione durante l'incubazione non è necessaria. Per prepararsi alla colorazione, rimuovere l'ultimo lavaggio di PBST e bloccare le antenne fissate riempiendo la camera con 90 microlitri di siero di cavallo al 5% in PBST 0,1%, quindi sostituire la soluzione di blocco con gli anticorpi primari diluiti in una miscela di siero di cavallo al 5%.In PBST, gli anticorpi primari utilizzati sono l'anticorpo murino anti GFP diluito 1:400 e l'anticorpo di ratto anti eof, diluito ad una concentrazione di 1:200 per evitare che i campioni delle antenne si secchino. Posizionare un tessuto umido nel coperchio della piastra di coltura e avvolgerlo con il parafilm. Quindi collocare la piastra di coltura in un contenitore di plastica contenente tessuti umidi.Incubare le antenne negli anticorpi primari per 48 ore a quattro gradi Celsius dopo 48 ore. Rimuovere gli anticorpi primari non legati con sei lavaggi in PBST per 10 minuti ciascuno. Simile alla procedura di rimozione del fissativo precedentemente descritta.Dopo un'ora di lavaggi con PBST, aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluita in una miscela di siero di cavallo al 5% in PBST; in questo esempio, gli anticorpi sono SI due anti IgG coniglio e SI tre anti IgG ratto. Coprire il contenitore con carta d'alluminio da questo momento in avanti per prevenire la fotobleaching del fluoro quattro. Successivamente, incubare l'antenna nell'anticorpo secondario per 48 ore a quattro gradi Celsius.A questo punto, l'antenna è pronta per essere montata. Rimuovere dalla piastra colturale la maggior quantità possibile di PBST e iniziare gradualmente ad aggiungere glicerolo alle antenne. Successivamente, aggiungere alla piastra glicerolo al 40% per uno o due minuti, quindi rimuoverlo e aggiungere glicerolo all'80%, lasciandolo agire per cinque minuti.La colorazione fluorescente ha rivelato neuroni positivi per Elof e i neuroni olfattivi bersaglio. Combinando questo procedimento con altri metodi simili, inclusa la generazione di mosaicici genetici nei neuroni olfattivi, speriamo di avviare lo studio dei meccanismi che controllano la diversificazione dei neuroni olfattivi e di rispondere ad altre importanti domande scientifiche.

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Questo protocollo descrive la procedura di dissezione, le condizioni di coltura e l'imaging dal vivo di un sistema di espianto antenna-cervello per lo studio dell'assemblaggio del circuito olfattivo.

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Descriviamo qui i metodi per indurre e analizzare il rimodellamento olfattivo dipendente dall'esperienza dei glomeruli sinaptici del lobo antennale nel cervello giovanile di Drosophila .

Rimodellamento dipendente dall'esperienza del cervello giovanile, neurone sensoriale olfattivo, connettività sinaptica in un periodo critico della prima infanzia

L'ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (EASI-FISH) è una tecnica robusta che combina la microscopia ad espansione con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per rilevare l'espressione di più geni nei tessuti spessi. Questo protocollo delinea i recenti progressi nel metodo e il suo adattamento per l'etichettatura del sistema nervoso centrale della Drosophila intatta.

Rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

Questo articolo descrive un protocollo efficiente di dissezione immaginale del disco e colorazione degli anticorpi, economico con i reagenti e facilita la gestione di dischi immaginari in piccole quantità.

Dissezione su piccola scala e colorazione di anticorpi dei dischi immaginari occhio-antenna e alare da Drosophila melanogaster

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