Valutare Liquidazione fagocitaria della morte cellulare in corsa sperimentale da Ligatable Fluorescent Probes

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di marcare selettivamente le cellule fagocitiche attive, che eliminano i cadaveri cellulari durante l'ictus. Ciò si ottiene preparando prima i componenti per la reazione di amplificazione del segnale basata su Tite. Il secondo passo è preparare le sezioni.

Successivamente, la reazione di marcatura viene eseguita utilizzando l'enzima vaccinia, la topoisomerasi e le sonde fluorescenti responsabili. Il passaggio finale è il miglioramento del segnale fluorescente basato su IDE. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per valutare la clearance fagocitaria delle cellule morte nelle sezioni di tessuto dell'ischemia cerebrale focale.

L'eliminazione delle cellule morte da parte dei fagociti svolge un ruolo importante nel recupero del cervello dopo l'ischemia. Il metodo presentato determina l'efficienza di questo processo etichettando solo quelle dimensioni di pego che rimuovono attivamente le cellule morte. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sul cervello ischemico, può anche essere utilizzato per studiare il danno ischemico in altri organi e tessuti.

Dove la clearance acida delle cellule morte è importante. Sebbene l'amplificazione del segnale IDE o la fase TSA si verifichi nella fase finale della marcatura, la preparazione per questa reazione può richiedere più di un'ora. È quindi più conveniente fare prima i reagenti TSA.

Il primo passo consiste nel produrre la soluzione madre di fluoro quattro TYROM a 300 microlitri di DMSO nei file di reagenti TYROM inclusi nel kit di etichettatura TSA. Quindi, preparare il tampone di lavaggio TNT per sciogliere completamente il reagente bloccante. Quando si prepara il tampone bloccante TNB, aggiungerlo lentamente a piccoli incrementi mescolando, scaldare la soluzione gradualmente fino a 55 gradi Celsius.

Con l'agitazione continua, la soluzione apparirà lattiginosa e dovrà essere portata a temperatura ambiente prima di utilizzare l'aliquota e conservata a meno 20 gradi Celsius per un uso a lungo termine per questa procedura, i vetrini vengono preparati in anticipo montando sezioni spesse cinque micrometri. Taglio da tessuto fissato in formalina. Per prima cosa, trattare le sezioni con xilene per 15 minuti, reidratare le sezioni attraverso una serie di lavaggi con etanolo, seguiti da due lavaggi in acqua.

Successivamente, preparare la soluzione di lavoro della proteinasi K diluendo una soluzione madre a 50 microgrammi per millilitro in PBS. La parte più difficile di questo esperimento è determinare la durata ideale per i controlli della digestione della proteinasi K con tempi di digestione più brevi e più lunghi per garantire il successo a seconda delle dimensioni e del tipo di tessuto. Aggiungere il volume appropriato di soluzione di lavoro della proteina ACE K alle sezioni e incubare per 15 minuti a 23 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, lavare le sezioni in acqua distillata due volte per cinque minuti ciascuna. Mentre le sezioni sono in ammollo, preparare la miscela di etichettatura contenente la sonda attiva. Per preparare la soluzione della sonda attiva, combinare gli oligonucleotidi con acqua, un molare triss, HCL e la vaccinia topoisomerasi fornita nel kit, miscelati delicatamente mediante pipettaggio e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire l'attivazione della sonda.

Dopo il secondo lavaggio, prelevare le sezioni dal barattolo e aspirare l'acqua rimanente. Quando è pronta, applicare la soluzione di sonda attiva preparata in precedenza per il coperchio. Far scivolare le sezioni e incubarle per 15 minuti a 23 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, immergere i vetrini in acqua per rimuovere delicatamente i vetrini coprioggetti. Lavare gli scivoli in acqua tre volte per cinque minuti ciascuno. Dopo l'ultimo lavaggio, coprire le sezioni di tessuto con tampone bloccante TNB e incubare i vetrini in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente.

Durante questo periodo, preparare una diluizione da una a 100 di coniugati perossidasi di rafano e strippati. S-A-H-R-P nel tampone di blocco TNB, recuperare i vetrini e aspirare il tampone di blocco TNB. Prima di applicare la soluzione S-A-H-R-P, utilizzare una quantità di reagente sufficiente a coprire l'intera sezione di tessuto.

Una volta coperti, incubare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente Dopo l'incubazione, lavare i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno. Nel tampone di lavaggio TNT a temperatura ambiente, preparare una diluizione da uno a 50 del brodo fluoro four TY IDE in un diluente di amplificazione immediatamente prima dell'uso. Pipettare la soluzione sui vetrini coprendo completamente la sezione di tessuto.

Poiché la soluzione non può essere riutilizzata, eliminare la parte rimanente non utilizzata. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per tre-10 minuti. Monitorare la fluorescenza.

Aumentare al microscopio fino a quando i primi accenni di strutture sono visibili in questo momento. Procedere rapidamente alla fase di lavaggio. Lavare i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno.

In TNT Tampone di lavaggio a temperatura ambiente con agitazione. Dopo il lavaggio, aggiungere la soluzione antisbiadimento con DPI e vetrino coprioggetti. Osservare i risultati al microscopio a fluorescenza.

Queste immagini mostrano due esempi di clearance acida del PHA. La colorazione nucleare è mostrata in fluorescenza blu e la sonda topografica a vuoto responsabile è mostrata in verde, i diagrammi di fluorescenza degli eventi presentati in queste immagini mostrano nuclei di fagociti e nuclei extra inghiottiti da tic in vari stadi di digestione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, saprai come utilizzare le sonde fluorescenti in sezioni di tessuto. Sarai anche in grado di etichettare selettivamente le idi attive eliminando le cellule morte nel cervello ischemico.