Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i mitocondri associati a mRNA in fase di traduzione. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo cellule di lievito coltivate in condizioni che favoriscono l'arricchimento mitocondriale. Il secondo passaggio consiste nel lisare delicatamente le cellule in presenza di cicloesimide.

In seguito, i mitocondri vengono separati dai componenti solubili mediante centrifugazione differenziale. L'ultimo passaggio consiste nell'estrazione dell'RNA dai mitocondri e dai campioni di controllo. Infine, l'analisi northern viene utilizzata per dimostrare la purezza e la qualità dell'RNA associato ai mitocondri.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che molti tipi di RNA possono essere isolati in un'unica preparazione. Pertanto, è possibile effettuare un'analisi comparativa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella biologia cellulare, come il targeting intracellulare e la funzione degli organelli.

In questa procedura, i mitocondri verranno purificati da 100 a 150 mL di cellule di lievito coltivate fino a un OD 600 compreso tra 1 e 1,5 a 30 gradi celsius in un mezzo di crescita non fermentabile. Centrifugare le cellule a 3000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, scartare il soprannatante e lavare il pellet con acqua distillata e deionizzata, quindi centrifugare nuovamente.

Dopo aver eliminato il soprannatante, pesare il pellet cellulare. Tipicamente, si ottengono circa 0,6 grammi da 100 millilitri di cellule. Sospendere il pellet in un millilitro di tampone DTT per ogni 0,5 grammi di cellule.

È importante trattare le cellule con un agente riducente al fine di rompere i legami disolfuro presenti nella parete cellulare, migliorando così l'idrolisi; incubare le cellule per 10 minuti a 30 gradi Celsius con agitazione delicata. Successivamente, centrifugare le cellule a 3000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet.

In un millilitro di buffer xmal liasi per 0,15 grammi di cellule, non vortexare. Misurare l'OD 600 di un'aliquota di 10 microlitri di cellule in 990 microlitri di acqua e registrare questo valore. Aggiungere xmal liasi appena preparata alle cellule per idrolizzare i polimeri di glucosio a livello dei legami beta uno tre glucano e generare Sphero plast.

Da questo punto in poi, Sphero plast deve essere mantenuto in una soluzione isotonica per evitare la lisi; incubare le cellule per 15 minuti a 30 gradi Celsius con agitazione delicata. Per verificare l'idrolisi della parete cellulare e la generazione di sferoplasti, mescolare 10 microlitri di cellule con 990 microlitri di acqua e misurare l'OD a 600 nm. Si prevede che gli sferoplasti lisciano a causa della differenza osmotica e l'OD a 600 nm dovrebbe essere almeno dieci volte inferiore rispetto al valore determinato prima dell'aggiunta di xmal liasi. In caso contrario, proseguire l'incubazione con xmal liasi per altri 15 minuti.

Risospendere il PHE di Plast con 100 millilitri di mezzo di recupero e trasferire la sfera di plast in un matraccio di Helen Meyer. Incubare per un'ora a 30 gradi Celsius con agitazione. Questo passaggio di recupero è necessario poiché la traduzione è arrestata e la localizzazione dell'mRNA è interrotta durante il trattamento con XYs.

Dopo un'ora aggiungere 0,1 milligrammi per millilitro di cyclo eside e trasferire lo Sphero plast in provette coniche da 50 millilitri preraffreddate. L'aggiunta di cyclo eside è fondamentale per bloccare l'associazione dei ribosomi con gli mRNA. In questo modo, l'associazione degli mRNA ai mitocondri, dipendente dai ribosomi, viene mantenuta.

Centrifugare la sfera di plass a 3000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e lavare due volte con mannitolo freddo. Riutilizzare il tampone.

Sospendere la sfera di plass con quattro millilitri di tampone di manitolo freddo e trasferire la sospensione in un omogenizzatore a mortaio da 15 millilitri dotato di pestello ben aderente. Rompere delicatamente la sfera di plass con 15 passaggi e trasferire il lisato in un tubo da 13 millilitri. Centrifugare il lisato a 1.500 ×g per sei minuti a quattro gradi Celsius.

Per formare un pellet di nuclei e cellule integre. Trasferire con attenzione il soprannatante in un nuovo tubo. Mettere da parte un millilitro o il 25% del campione come campione non frazionato o totale.

Trasferire 50 microlitri di questo campione in un nuovo tubo e aggiungere 15 microlitri di quattro XLSB. Per l'analisi della proteina tramite western blot, l'RNA verrà precipitato dal resto del campione totale per le analisi northern e microarray. Centrifugare il soprannatante a 10.000 ×g.

Centrifugare per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per ottenere il pellet di mitocondri, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo e mantenere sul ghiaccio. Questa è la frazione citosolica.

Trasferire 50 microlitri di questo campione in un nuovo tubo e aggiungere 15 microlitri di quattro XLSB. Per l'analisi tramite western blot, l'RNA verrà precipitato dal resto del campione citosolico per analisi northern e microarray. Lavare il pellet con tre millilitri di mannitolo, tampone e centrifugare nuovamente a 10.000 ×g.

Centrifugare per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Sospendere nuovamente il pellet con tre millilitri di tampone contenente mannosio. Questo campione contiene i mitocondri ed è indicato come frazione mitocondriale.

Trasferire 50 microlitri di questo campione in un nuovo tubo e aggiungere 15 microlitri di quattro XLSB per l'analisi tramite Western blot. Per iniziare questa procedura, aggiungere a ciascun campione un volume di otto molar guad dium, HCEL e due volumi di etanolo al 100%, vorticare e incubare per almeno due ore a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare i campioni a 10.000 volte la forza di gravità per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Eliminare il soprannatante. Fare attenzione poiché il pellet potrebbe essere instabile. Dopo aver lavato il pellet con etanolo al 70%, sospendere il pellet con 400 microlitri di acqua priva di RNA e trasferire il campione in una nuova provetta einor.

Far precipitare nuovamente l'RNA aggiungendo 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M, pH 5,2 e due volumi di etanolo al 100%, vortexare e incubare per almeno due ore a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare i campioni a 20.000 volte la forza di gravità per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Eliminare il soprannatante e lavare con etanolo al 70%. Far asciugare il pellet all'aria e risospendere con acqua priva di RNAsi; conservare l'RNA a -80 gradi Celsius.

I campioni possono successivamente essere utilizzati per analisi northern o microarray. Per preparare l'RNA per l'analisi con microarray, sospensere innanzitutto ogni pellet di mRNA ottenuto dalla precipitazione con guanidina HCl ed etanolo in 650 microlitri di acqua libera da RNAsi e trasferirlo in una provetta con tappo a vite. Quindi aggiungere 650 microlitri di fenolo acido cloroformio ed eseguire un'energica agitazione vortex, seguita da centrifugazione alla velocità massima per due minuti.

Trasferire 500 microlitri della fase acquosa superiore in un nuovo tubo. Evitare di prelevare l'interfase, poiché contiene DNA. Prestare inoltre attenzione a non prelevare il fenolo, che può inibire la reazione di trascrizione inversa.

Rimuovere l'eparina dal campione di RNA mediante precipitazione con cloruro di litio. Aggiungere cloruro di litio fino a una concentrazione finale di due moli e incubare i campioni tutta la notte a meno 20 gradi Celsius il giorno successivo. Scongelare i campioni a quattro gradi Celsius e centrifugare a 20.000 ×g.

Centrifugare per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con attenzione il soprannatante e lavare il pellet con etanolo all'80%, centrifugando nuovamente. Scartare ancora il soprannatente, lasciare asciugare all'aria e risospendere il pellet in 150 microlitri di acqua priva di RNAse per rimuovere eventuali tracce di precipitato di cloruro di litio. Precipitare nuovamente con 0,1 volumi di acetato di sodio tre molare a pH 5,3 e tre volumi di etanolo al 100%, quindi incubare a meno 20 gradi Celsius per almeno due ore.

Centrifugare alla velocità massima per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare con attenzione il pellet trasparente con etanolo al 80% ed essiccare all'aria. Infine, risospendere il pellet in 25 microlitri di acqua priva di RNAsi e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius.

Il successo di questo protocollo nel separare una frazione contenente mitocondri da componenti citosolici viene meglio verificato eseguendo un'analisi northern e un'analisi western su campioni provenienti dai diversi passaggi di isolamento. In questo esempio, i campioni erano stati prelevati prima della frazionamento, ovvero dalla frazione totale, dalla frazione citosolica e dalla frazione mitocondriale. È stata eseguita un'analisi northern per le seguenti mRNA: COB e un RNA.

Che viene trascritto all'interno dei mitocondri, un CO1 e un mRNA che codifica per una proteina importata nei mitocondri. Un CT1, un mRNA che codifica per la proteina actina citosolica e SEC61 un mRNA che codifica per una proteina residente nel reticolo endoplasmatico. Nel pannello inferiore è mostrata una colorazione con blu di metilene della membrana nord, dove vengono rilevate due bande prominenti di RNA, 25S e 18S.

Dato che COB viene trascritto all'interno dei mitocondri, il suo segnale dovrebbe essere esclusivamente mitocondriale, come osservato in questo studio. La comparsa di COB nella frazione citosolica indicherà una lisi mitocondriale durante la preparazione.

ACO uno codifica una proteina che viene importata nei mitocondri e appare principalmente nella frazione mitocondriale. CT uno codifica una proteina citosolica e pertanto appare principalmente nella frazione citosolica. La presenza di SEC 61 nella frazione mitocondriale indica la presenza di componenti del reticolo endoplasmatico in questa frazione.

I segnali degli RNA sono presenti in entrambe le frazioni, indicando la presenza di ribosomi. È stata eseguita un'analisi western per le seguenti proteine: POR1 mitocondriale, proteina della membrana esterna HX, K1A, proteina citosolica CUE1 e proteina del reticolo endoplasmatico RPL39. Una proteina ribosomiale, come previsto, il segnale di POR1 è stato rilevato solo nella frazione mitocondriale.

Se un segnale di POR fosse stato rilevato nella frazione citosolica, ciò suggerirebbe una dissociazione di componenti mitocondriali durante la preparazione. Inoltre, come previsto, hx K uno è stato rilevato solo nella frazione citosolica. Il forte segnale di CUE uno nella frazione mitocondriale indica che quantità significative di materiale derivato dal reticolo endoplasmatico vengono co-isolate nella frazione mitocondriale.

Questo potrebbe essere il risultato dei noti contatti fisici tra il reticolo endoplasmatico e i mitocondri. Il segnale di RPL39 appare in entrambe le frazioni, confermando nuovamente la presenza di ribosomi in entrambe; escludendo il passaggio di recupero dalla procedura, si osserva la scomparsa dei ribosomi dalla frazione M, il che influirà sull'associazione dell'mRNA ai mitocondri. Oltre a verificare la qualità della separazione tra componenti mitocondriali e citosoliche, è importante confermare che l'RNA o le proteine nei campioni siano integri e che non si verifichino perdite significative di RNA o proteine durante la preparazione dei campioni.

Integro, RNA e proteine devono essere rilevati come bande distinte nelle analisi, come mostrato qui. Per il mRNA di c CCP, che codifica una proteina importata nei mitocondri, la comparsa di bande più corte aggiuntive o strisce indica degradazione. Perdite gravi si tradurranno in una differenza significativa tra la quantità totale e quella relativa del segnale, cosa che non è stata osservata, nel complesso.

Questi risultati confermano questo protocollo come un metodo efficace per l'isolamento di mRNA, ribosomi e proteine in un'unica procedura. Dopo aver eseguito questa procedura, è possibile effettuare analisi su scala genomica come RNA-Seq o analisi proteomiche al fine di identificare caratteristiche chiave e uniche delle funzioni organellari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare l'RNA associato ai mitocondri.