Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i mitocondri associati alla traduzione degli mRNA. Ciò si ottiene raccogliendo prima le cellule di lievito coltivate in condizioni di arricchimento dei mitocondri. Il secondo passo consiste nel pidacciare delicatamente le cellule in presenza di cicloheide.

Successivamente, i mitocondri vengono separati dai componenti solubili mediante centrifugazione differenziale. La fase finale è l'estrazione dell'RNA dai mitocondri e dai campioni di controllo. In definitiva, l'analisi del nord viene utilizzata per mostrare la purezza e la qualità dell'RNA associato ai mitocondri.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che molti tipi di RNA possono essere isolati in un'unica preparazione. Pertanto, è possibile effettuare un'analisi comparativa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare come il targeting intracellulare e la funzione organo.

In questa procedura, i mitocondri saranno purificati da 100 a 150. Millilitri di cellule di lievito sono cresciute fino a un OD 600 da uno a 1,5 a 30 gradi Celsius su una crescita non fermentabile. Medio. Centrifugare le celle a 3000 volte la gravità per cinque minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante e lavare nuovamente il pellet con centrifuga ad acqua distillata doppia.

Dopo aver scartato il surnatante, pesare il pellet della cella. In genere circa 0,6 grammi si ottengono da 100 millilitri di cellule. Resus sospendere il pellet in un millilitro di tampone DTT per 0,5 grammi di cellule.

È importante trattare le cellule con un agente riducente per rompere i legami dissolfuro all'interno della parete cellulare, migliorando così l'idrolisi, incubare le cellule per 10 minuti a 30 gradi Celsius agitando delicatamente. Successivamente centrifugare le celle a 3000 volte la gravità per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet.

In un millilitro di tampone liasi xmal per 0,15 grammi di cellule non vortice. Misurare l'OD 600 di un'aliquota di 10 microlitri delle cellule in 990 microlitri di acqua e registrare questo valore. Aggiungere la liasi xmal appena preparata alle cellule per idrolizzare i polimeri di glucosio ai legami beta, uno, tre glucani e generare Spheroplast.

Da qui in poi Sphero plast deve essere conservato in una soluzione isotonica per evitare la lisi, incubare le cellule per 15 minuti a 30 gradi Celsius agitando delicatamente. Per verificare l'idrolisi della parete cellulare e della sfera di generazione di plast, mescolare 10 microlitri di cellule con 990 microlitri di acqua e misurare l'OD 600 Le piastre Sphero dovrebbero pidocchiare a causa della differenza osmotica e l'OD 600 dovrebbe essere almeno dieci volte inferiore al valore determinato prima dell'aggiunta della liasi xmal. In caso contrario, continuare l'incubazione con xmal liase per altri 15 minuti.

Risospendere il PHE di Plast con 100 millilitri di terreno di recupero e trasferire la sfera di plast in un pallone Helen Meyer. Incubare per un'ora a 30 gradi Celsius agitando. Questa fase di recupero è necessaria poiché la traduzione viene arrestata e la localizzazione dell'mRNA viene interrotta durante il trattamento con XYs.

Dopo un'ora aggiungere 0,1 milligrammi per millilitro, cicloheide, e trasferire Sphero plast in tubi conici da 50 millilitri pre-raffreddati. L'edizione Cyclo Heide è importante per congelare l'associazione dei ribosomi con gli mRNA. Pertanto, viene mantenuta l'associazione dell'mRNA dipendente dai ribosomi con i mitocondri.

Centrifuga, la sfera di plass a 3000 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e lavare due volte con mannitolo freddo. Buffer reus.

Sospendere la sfera di plass con quattro millilitri di tampone manitol freddo e trasferire la sospensione in un omogeneizzatore in piuma della capacità di 15 millilitri dotato di un pestello a tenuta stagna. Rompere delicatamente la sfera di plass con 15 colpi e trasferire il lisato in un tubo da 13 millilitri. Centrifugare il lisato a 1.500 volte la gravità per sei minuti a quattro gradi Celsius.

Per pellettare i nuclei e le cellule integre. Trasferisci con cura il super natin in un nuovo tubo. Mettere da parte un millilitro o il 25% del campione come campione non frazionato o totale.

Trasferire 50 microlitri di questo campione in una nuova provetta e aggiungere 15 microlitri di quattro XLSB. Per l'analisi del sangue occidentale, l'RNA sarà precipitato dal resto del campione totale per analisi settentrionali e microarray. Centrifugare il super natin a 10.000 volte.

Gravità per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per pellettare i mitocondri, trasferire il super natin in un nuovo tubo e tenerlo in ghiaccio. Questa è la frazione citosolica.

Trasferire 50 microlitri di questo campione in una nuova provetta e aggiungere 15 microlitri di quattro XLSB. Per l'analisi western blot, l'RNA sarà precipitato dal resto del campione citosolico per analisi northern e microarray. Lavare il pellet con tre millilitri di mannitolo, tamponare e centrifugare nuovamente a 10.000 volte.

Gravità per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Reus sospende il pellet con tre millilitri di tampone mannitolo. Questo campione contiene i mitocondri ed è indicato come frazione mitocondriale.

Trasferire 50 microlitri di questo campione in una nuova provetta e aggiungere 15 microlitri di quattro XLSB per l'analisi Western blot. Per iniziare questa procedura, aggiungere a ciascun campione un volume di otto guad dium, HCEL e due volumi di vortice di etanolo al 100% e incubare per almeno due ore a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare i campioni a 10.000 volte la gravità per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il surnatante. Fare attenzione perché il pellet potrebbe essere instabile. Dopo aver lavato il pellet con reus etanolo al 70%, sospendere il pellet con 400 microlitri di acqua priva di RNA e trasferire il campione in una nuova provetta einor.

Far precipitare nuovamente l'RNA aggiungendo 0,1 volumi di tre molari di acetato di sodio a pH 5,2 e due volumi di vortice di etanolo al 100% e incubare per almeno due ore a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare i campioni a 20.000 volte. Gravità per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il surnatante e lavare con etanolo al 70%. Asciugare all'aria il pellet e sospendere il resus con RNA libero di acqua immagazzinare RNA. Campioni a meno 80 gradi Celsius.

I campioni possono essere successivamente utilizzati per analisi northern o microarray. Per preparare l'RNA per l'analisi dei microarray, sospendere prima ogni pellet di MRNA ottenuto dalla precipitazione di guin HCL ed etanolo con 650 microlitri di acqua priva di RNA e trasferirlo in un tubo a vite e orph. Aggiungere quindi 650 microlitri di cloroformio fenolico acido e centrifugare energicamente alla massima velocità per due minuti.

Trasferire 500 microlitri della fase acquosa superiore in una nuova provetta. Evitare di assumere l'interfase in quanto contiene DNA. Attenzione anche a evitare di assumere fenolo, che può inibire la reazione di trascrizione inversa.

Rimuovere l'eparina dal campione di RNA mediante precipitazione di cloruro di litio. Aggiungere cloruro di litio a una concentrazione finale di due molari e incubare i campioni per una notte a meno 20 gradi Celsius il giorno successivo. Scongelare i campioni a quattro gradi Celsius e centrifugare a 20.000 volte.

Gravità per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare con cura il surnatante e lavare il pellet con centrifuga di etanolo all'80%. Ancora una volta, scartare il surnatante asciugare all'aria e risospendere il pellet in 150 microlitri di RNA acqua libera per rimuovere eventuali residui di cloruro di litio precipitare nuovamente con 0,1 volume di tre molari di acetato di sodio pH 5,3 e tre volumi di etanolo al 100% incubare a meno 20 gradi Celsius per almeno due ore.

Centrifugare alla massima velocità per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare accuratamente il pellet trasparente con etanolo all'80% e asciugarlo all'aria. Infine risospendere il pellet con 25 microlitri di RNA di acqua libera e mantenere i campioni a meno 80 gradi Celsius.

Il successo di questo protocollo nella separazione di una frazione contenente mitocondri dai componenti citosolici è meglio testato eseguendo analisi nordiche e analisi occidentali su campioni provenienti dalle diverse fasi di isolamento. In questo esempio, i campioni provenivano da prima del frazionamento o dalla frazione totale, dalla frazione citosolica e dalla frazione mitocondriale. L'analisi del nord è stata eseguita per i seguenti mRNA, COB e RNA.

Questo viene trascritto all'interno dei mitocondri, quello A CO e MRNA che codifica una proteina che viene importata nei mitocondri. Una CT, una Mr.Nna che codifica per la proteina actina citosolica e SEC 61 una M nna che codifica per una proteina residente nell'ER. Il pannello inferiore è una colorazione blu di metilene della membrana settentrionale dove vengono rilevate due bande prominenti di RNA 25 s e 18 s.

Poiché COB è trascritto all'interno dei mitocondri, il suo segnale dovrebbe essere esclusivamente nei mitocondri. Come è stato osservato in questo studio. La comparsa di COB nella frazione citosolica indicherà la lisi dei mitocondri durante la preparazione.

ACO one codifica per una proteina che viene importata nei mitocondri e appare principalmente nella frazione mitocondriale. Una CT codifica per una proteina citosolica e quindi appare principalmente nella frazione citosolica. La presenza di SEC 61 nella frazione mitocondriale indica la presenza di componenti ER in questa frazione.

I segnali degli RNA compaiono in entrambe le frazioni indicando la presenza di ribosomi. L'analisi Western è stata eseguita per le seguenti proteine, POR uno A mitocondri, proteina della membrana esterna hx, K one A, proteina citosolica CUE one e proteina ER e RPL 39. Una proteina ribosomiale, come previsto, il segnale POR one è stato rilevato solo nella frazione mitocondriale.

Se il segnale POR one fosse rilevato nella frazione citosolica, suggerirebbe la dissociazione dei componenti mitocondriali durante la preparazione. Inoltre, come previsto, hx K one è stato rilevato solo nella frazione citosolica. Il forte segnale CUE one nella frazione mitocondriale indica che quantità significative di materiale correlato all'ER sono co-isolate nella frazione mitocondriale.

Questo può essere il risultato dei contatti fisici noti tra l'ER e i mitocondri. Il segnale RPL 39 appare in entrambe le frazioni, ancora una volta, confermando la presenza di ribosomi in entrambe le frazioni, escludendo la fase di recupero dalla procedura si ottiene la scomparsa dei ribosomi dalla frazione M, che influenzerà l'associazione dell'mRNA con i mitocondri. Oltre a verificare la qualità della separazione tra i componenti mitocondriali e citosolici, è importante confermare che l'RNA o le proteine nei campioni siano intatti e che non vi siano gravi perdite di RNA o proteine durante la preparazione del campione.

Intatti, l'RNA e le proteine devono essere rilevati come bande distinte nelle analisi, come mostrato qui. Per l'mRNA c CCP one, che codifica per una proteina che viene importata nei mitocondri, la comparsa di ulteriori bande più corte o strisci indicherà la degradazione. Gravi perdite si tradurranno in una differenza significativa tra la quantità totale e la quantità relativa di segnale, che non è stata osservata, prese insieme.

Questi risultati convalidano questo protocollo come metodo efficace per l'isolamento di mRNA, ribosomi e proteine in un'unica procedura. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi a livello di genoma come l'RNA-Seq o l'analisi proteomica al fine di identificare le caratteristiche chiave e uniche delle funzioni organiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'RNA associato ai mitocondri.