La stampa Sommerso di celle su una superficie modificata utilizzando un flusso di Microspotter continua
April 22nd, 2014
Questa tecnologia di stampa microfluidica 3D stampa array di cellule su superfici sommerse. Descriviamo come gli array di cellule vengono erogati microfluidicamente in celle a flusso 3D su superfici sommerse. Stampando su superfici sommerse, sono stati prodotti microarray cellulari che consentono lo screening dei farmaci e la valutazione della citotossicità in una moltitudine di aree.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stampare tre fibroblasti T tre su una superficie rivestita di siero. Ciò si ottiene pre-adsorbendo prima il siero su una superficie di coltura tissutale. Il secondo passo consiste nel stampare una sospensione di fibroblasti sulla superficie utilizzando un micro spotter a flusso continuo, seguito dall'incubazione delle cellule a 37 gradi Celsius per due ore.
Successivamente, le cellule stampate e le cellule seminate attraverso la coltura cellulare standard vengono colorate con ioduro di propidio e visualizzate al microscopio invertito per il confronto. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per valutare la vitalità, la densità e la morfologia cellulare in momenti rilevanti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la stampa a spillo, è che la testina di stampa forma un sigillo sulla superficie, consentendo la stampa di celle mentre sono immerse in supporti cellulari.
Mentre la stampa sommersa di cellule è utile per lo screening di nuovi farmaci candidati per la sicurezza e l'efficacia, la stampa sommersa in generale è utile anche per altre applicazioni. Ad esempio, possiamo analizzare nuovi farmaci candidati contro fette di tessuto, oppure possiamo usarlo come modello per sistemi di organi. Ad esempio, un modello di profusione epatica.
In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché durante l'adescamento della stampante e la stampa cellulare, l'aria non può entrare nelle linee o può causare la morte cellulare. Per iniziare, scongelare tre cellule T per due o tre minuti in un bagno d'acqua agitante a 37 gradi Celsius. Risospendere le cellule in cinque millilitri di terreno completo e centrifugare a 1500 Gs per tre minuti.
Rimuovere il surnatante della cella senza disturbare il pellet della cella. Quindi risospendere le cellule in cinque millilitri di terreno e trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri. Quindi, aggiungere 10 microlitri di triam blue alla sospensione cellulare e mescolare con la punta della pipetta 10 microlitri delle cellule colorate in una camera emocitometrica.
Prima di contare le celle con un ingrandimento di 10 volte, contate le cellule vive che assomigliano a piccole palline bianche per quattro dei nove grandi quadrati. Conta solo le cellule vive che non appaiono blu scuro dalla colorazione blu trippen. Calcola il numero medio di cellule per quadrato grande, ottenendo il numero di cellule moltiplicato per 10.000 cellule per millilitro nella sospensione cellulare originale.
Quindi seminare le cellule a una densità di 100.000 cellule per millilitro con un totale di cinque millilitri in ogni matraccio T 25. Coltivare le cellule con una fluenza compresa tra il 70 e l'80% di co prima di iniziare gli esperimenti. Per preparare la superficie di stampa, utilizzare un pennarello per contrassegnare un rettangolo delle dimensioni della testina di stampa sul fondo di un polistirene trattato con coltura tissutale 12.
Preparare con pozzetto 50 microlitri di siero fetale bovino nell'area rettangolare e distribuirlo su tutta la regione. Con la punta, lasciare la piastra a pozzetti in una cappa sterile di biosicurezza per una notte per consentire alla macchia di siero di asciugarsi completamente. Per iniziare la stampa sommersa, sciacquare la testina di stampa con acqua distillata.
Quindi riempire una capsula di Petri da 60 millimetri con acqua distillata e agganciare la testina di stampa alla superficie che fa fluire acqua distillata attraverso ciascuna delle linee per due minuti a 150 microlitri al minuto utilizzando una pompa pneumatica. Quindi scartare l'acqua dalla capsula di Petri e riempirla con acqua pulita. Quindi, spostare la testina di stampa su e giù nell'acqua tre volte.
Agganciare il centro della testina di stampa sul punto rivestito di siero nella piastra a 12 pozzetti pre-preparata. Quindi adescare la testina di stampa con Prewarm. Supporti completi a 300 microlitri per canale.
Se si eseguono più stampe, aggiungere un risciacquo con candeggina oltre al risciacquo con acqua tra le stampe. Procedere alla stampa delle celle sospese a una concentrazione di 50.000 cellule per millilitro sulla superficie e a 60 microlitri al minuto. 100 microlitri per canale.
Dopo la stampa delle cellule, posizionare la testina di stampa lasciata agganciata alla superficie e il collettore in un incubatore per colture cellulari. Impostare al 5% di anidride carbonica e 37 a gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione di due ore, rimuovere la testina di stampa e posizionare il coperchio sul piatto di coltura.
L'ora in cui la testina di stampa viene rimossa è considerata il punto dell'ora zero. Per il confronto, viene eseguita anche la coltura cellulare standard. Aggiungere un millilitro di terreno di preriscaldamento a una delle piastre da 12 pozzetti macchiate nel siero, quindi prelevare un millilitro della sospensione cellulare rimanente e pipettarlo in un singolo pozzetto della piastra a 12 pozzetti.
Questo produrrà una coltura contenente 50.000 cellule nella piastra. Posizionare la piastra di coltura cellulare in un incubatore a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione di due ore, iniziare a cronometrare la coerenza tra i campioni stampati e quelli di semina.
Questo è considerato il punto dell'ora zero. Dopo 0, 2, 24 e 48 ore, preparare le cellule da ciascuno dei due metodi per l'imaging colorandole con ioduro di propidio, che è incorporato solo nel nucleo delle cellule morte. Per prima cosa, sciacquare delicatamente le cellule tre volte con un millilitro di soluzione salina soffiata con fosfato con calcio e magnesio per rimuovere eventuali detriti.
Quindi, aggiungere un millilitro di terreno di coltura preriscaldato a ciascun recipiente di coltura, quindi un microlitro di ioduro di propidio. La soluzione madre incubare le cellule colorate con ioduro di propidio a 37 gradi Celsius per 10 minuti prima di visualizzare le cellule utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 10x e 40x. Infine, gettare le cellule in un contenitore appropriato per il rischio biologico.
La linea cellulare di fibroblasti, tre cellule T NIH, è stata stampata o seminata su una superficie sommersa. Dopo la stampa e la semina, le cellule sono state visualizzate per valutare la densità e la morfologia in punti temporali rilevanti. Le immagini hanno mostrato che le cellule possiedono fenotipi quasi identici in ogni punto temporale e ad ogni ingrandimento.
Sulla base di queste cifre, è stato determinato che la stampa effettiva è minima. La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando una colorazione con ioduro di propidio e ha rivelato che la vitalità per le cellule stampate non era significativamente diversa da quella delle cellule sedute per ogni punto temporale. La principale differenza tra i due metodi di fissaggio delle celle alla superficie è la densità delle celle.
La densità delle celle stampate diminuisce di oltre il 50% sia nelle celle sedute che in quelle stampate. Sono necessari ulteriori studi per determinare la causa di questa diminuzione. Tuttavia, i rapporti di densità stampati complessivi rispetto ai semi rimangono significativamente più alti.
La densità delle cellule stampate nella cella a flusso era circa 10 volte più densa in ogni momento rispetto alle celle seminate, considerando che le cellule sono state stampate alla stessa densità della semina, ma in un'area più piccola. Nell'ultimo momento, le cellule hanno la stessa densità, il che è probabilmente dovuto alla motilità cellulare e alle limitazioni del consumo di risorse. Sin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nelle aree della scoperta di farmaci per studiare gli effetti della tossicità e dell'efficacia dei farmaci sulle cellule e sugli aiuti antitumorali, sulle malattie cardiache e su altri campi ad alta domanda.
Utilizzando la stampa su cellule sommerse in combinazione con altre tecnologie come l'aderenza e l'adesione cellulare programmabile, possiamo estendere la portata della tecnica alle cellule in sospensione per una maggiore scoperta di farmaci e uno screening di sviluppo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una solida comprensione di come stampare le cellule utilizzando la nostra tecnica di stampa sommersa.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo studio presenta una nuova tecnologia di stampa microfluidica 3D che consente la stampa di array di cellule su superfici sommerse. Questo metodo facilita lo screening farmacologico e la valutazione della citotossicità consentendo la consegna precisa di cellule in un microambiente controllato.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Microfluidica
- Biologia cellulare
- Screening farmacologico
Contesto
- Le tecnologie di stampa 3D stanno avanzando nelle applicazioni biologiche.
- La stampa sommersa consente una migliore vitalità e funzionalità delle cellule.
- I metodi tradizionali potrebbero non fornire lo stesso livello di controllo sul posizionamento delle cellule.
- Questa tecnica può migliorare la valutazione degli effetti dei farmaci sulle cellule.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per stampare fibroblasti su una superficie rivestita di siero.
- Confrontare la vitalità e la morfologia delle cellule stampate rispetto ai metodi di coltura standard.
- Utilizzare la microscopia a fluorescenza per un'analisi dettagliata delle caratteristiche cellulari.
Metodi utilizzati
- Pre-adsorbimento del siero sulle superfici di coltura tissutale.
- Micro spotter a flusso continuo per la stampa cellulare.
- Incubazione delle cellule stampate a 37 gradi Celsius.
- Colorazione con ioduro di propidio per la visualizzazione sotto un microscopio invertito.
Risultati principali
- Stampa riuscita di fibroblasti su superfici sommerse.
- Confronto della vitalità e della morfologia tra cellule stampate e colture standard.
- La microscopia a fluorescenza ha rivelato informazioni significative sulla densità e la salute delle cellule.
- La tecnica ha dimostrato vantaggi rispetto ai metodi di stampa a spillo tradizionali.
Conclusioni
- Il metodo di stampa microfluidica 3D è efficace per la creazione di array cellulari.
- Questo approccio può migliorare i processi di screening farmacologico.
- Ulteriori ricerche potrebbero espandere le applicazioni in vari campi biologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Submerged microfluidic cell printing enables physiologically relevant cell phenotype maintenance and precise spatial organization for drug screening applications. This technology addresses key limitations of conventional printing methods by allowing automated, multiplexed deposition of cells onto submerged surfaces without disturbing material properties. The approach supports predictive cytotoxicity and efficacy assessment across therapeutic areas including oncology, metabolic disease, and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled cell array patterning on submerged surfaces.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining native cell phenotypes during printing and culture.
- Predictive Value: Facilitates functional target validation by preserving cell morphology and viability comparable to standard culture.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream drug screening workflows with consistent cell density and distribution.
- Operational Value: Delivers assay standardization and reproducibility through sealed microfluidic printing that prevents air entrapment and cell death.
- Scalability Value: Enables multiplexed array production for high-throughput compound evaluation in cancer, diabetes, inflammation, and cardiovascular disease models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Provides disease-relevant systems for monitoring cellular responses to drug candidates without surface disturbance artifacts.
- Continuity Value: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining cell functionality from printing through 48-hour assessment periods.
- Risk Mitigation: Supports mechanism-based de-risking by allowing direct comparison of printed versus seeded cell responses to compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling precise cell deposition for assay development, supporting lead identification through quantitative viability and morphology assessment, and informing preclinical decisions via density-based phenotypic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled cell array formation that clarifies spatial organization effects on drug response.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible submerged printing that ensures consistent cell-sealing interactions critical for compound screening.
- Analytics: Enables quantitative comparison of cell viability, density, and morphology via propidium iodide staining and fluorescence microscopy readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining cell phenotypes over 48 hours, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform technology adaptable to multiple cell types and therapeutic areas beyond fibroblast models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preservation of physiologically relevant cell states post-printing.
- Operational Value: Standardization and scalability via automated microfluidic sealing that eliminates variability from manual printing techniques.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through reliable cytotoxicity assessment that reduces late-stage biological risk in drug development.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization enabled by quantitative density and viability metrics that inform resource allocation across projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic system operation and sterile cell handling techniques.
- Dependent on pneumatic pump infrastructure and biocompatible printhead materials for consistent sealing.
- Necessitates cross-team standardization of serum pre-adsorption protocols and incubation conditions for reproducibility.
- Involves adaptation considerations when extending to suspension cells or tissue slice models as noted in source material.
- Practical limitation: Air entrapment during priming or printing can cause cell death, requiring meticulous fluid handling.
