Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG 35-55) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice
April 15th, 2014
Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla. C57BL / 6 topi sono immunizzati con mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), con un conseguente paralisi flaccida ascendente causata da cellule immunitarie autoreattive nel sistema nervoso centrale. Saranno discussi protocolli per l'induzione della malattia e monitoraggio.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre un modello animale di encefalomielite autoimmune sperimentale che imiti le caratteristiche cliniche e fisiopatologiche della sclerosi multipla. Ciò si ottiene preparando prima l'antigene e l'adiuvante e la tossina della pertosse. Il secondo passo consiste nell'iniettare l'antigene e l'emulsione CFA per via sottocutanea e la tossina della pertosse per via intraperitoneale.
Due giorni dopo, agli m viene nuovamente iniettata la tossina della pertosse intraperitoneale. Successivamente, gli animali vengono pesati e il loro punteggio clinico viene valutato quotidianamente. In definitiva, i segni clinici di autoimmune sperimentale e di encefalomielite possono essere osservati di solito tra il nono e il 14° giorno dopo l'immunizzazione.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti, che coinvolgono, ad esempio, agenti tossici come il rizone o diverse varianti di EIE, è il motivo per cui tutti imitano le caratteristiche della SM che differiscono enormemente nelle caratteristiche patologiche sottostanti, come il coinvolgimento del sistema immunitario adattativo. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della difficile gestione dell'immunizzazione. È assolutamente necessario ridurre lo stress per gli animali e garantire un'immunizzazione ottimale dopo il suo sviluppo.
Questo modello ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroimmunologia per caratterizzare gli animali knockout. Per identificare nuovi bersagli farmacologici molecolari o per testare promettenti candidati farmaci Per preparare la soluzione peptidica, iniziare diluendo il peptide MOG liofilizzato da 35 a 55 in acqua distillata doppia fino a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro. Sono necessari 100 microlitri di questa soluzione per topo e un po' di volume viene perso durante la preparazione.
Quindi fai da 1,5 a due volte la quantità di soluzione necessaria. Conservare la soluzione peptidica a meno 20 gradi Celsius per creare frons adiuvante completo o CFA posizionare 100 milligrammi di micobatterio essiccato per la tubercolosi. H 37 RA in un mortaio e macinarlo con un pestello fino ad ottenere una polvere sottile.
Quindi aggiungere 10 millilitri di coadiuvante di fronde incomplete per ottenere una soluzione di calza CFA da 10 milligrammi per millilitro. Il brodo di CFA può essere conservato a quattro gradi Celsius fino a quando non sarà necessario il giorno dell'immunizzazione. Diluire la soluzione madre di CFA con un coadiuvante fres incompleto a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro, miscelato accuratamente per risospendere il materiale particellare e metterlo su ghiaccio.
Dopo lo scongelamento, un'aliquota della soluzione peptidica MOG da 35 a 55. Mettilo sul ghiaccio. Utilizzare una siringa da due millilitri e una cannula calibro 27 per aspirare un millilitro di CFA.
Quindi utilizzare una seconda siringa da due millilitri e una cannula calibro 20 per aspirare un millilitro della soluzione MOG da 35 a 55. Rimuovere eventuali bolle d'aria e collegare entrambe le siringhe con una valvola a tre vie. Con la valvola a tre vie quasi chiusa, spingere l'emulsione da una siringa all'altra e rimettere in mano mescolando accuratamente per almeno 10 minuti.
Al termine, la soluzione deve essere bianca, rigida e viscosa senza separazione delle fasi. Ora lascia riposare l'emulsione per almeno 30 minuti o fino a diversi giorni prima dell'immunizzazione Controlla che sia ancora emulsionata. Il giorno dell'immunizzazione, aspirare la soluzione in una delle due siringhe e collegare una cannula calibro 27.
Ricostituire 50 microgrammi di tossina della pertosse in 500 microlitri di acqua bidistillata. Per una soluzione madre da 100 microgrammi per millilitro, conservare la soluzione madre a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Il giorno dell'immunizzazione, diluire la soluzione madre per la pertosse da uno a 50.
Con PBS, preparare una siringa con 200 microlitri della soluzione iniettabile diluita di pertosse, che contiene 400 nanogrammi di tossina della pertosse e aspirare altri 100 microlitri per lo spazio morto del mozzo dell'ago. Dopo aver anestetizzato un topo con isofluoro, valutare il livello di anestesia utilizzando un pizzico per le dita dei piedi. Iniettare 100 microlitri di emulsione di antigene CFA per via sottocutanea in due siti diversi su ciascun fianco posteriore.
Dopo l'iniezione, dovrebbe formarsi una massa bulbosa sotto la pelle, che dovrebbe persistere per tutto l'esperimento. Quindi, iniettare la siringa preparata contenente 200 microlitri di tossina della pertosse intraperitoneale. Assicurati che i singoli topi possano essere facilmente identificati per la valutazione quotidiana.
Ad esempio, da segni di colore sulla base della coda.
Panoramica
Questo articolo discute l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) nei topi C57BL/6, un modello per la sclerosi multipla. La procedura prevede l'immunizzazione con il peptide della glicoproteina oligodendrocitica della mielina (MOG) 35-55, che porta a segni clinici di paralisi.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroimmunologia
- Malattie autoimmuni
- Modelli animali di malattia
Sfondo
- L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) imita la sclerosi multipla.
- I topi C57BL/6 sono comunemente usati per questo modello.
- L'immunizzazione innesca una risposta autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale.
- Comprendere l'EAE aiuta a identificare potenziali bersagli terapeutici per la sclerosi multipla.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un modello animale affidabile di EAE.
- Valutare le caratteristiche cliniche e fisiopatologiche della sclerosi multipla.
- Facilitare la ricerca sui meccanismi neuroimmunologici e il test dei farmaci.
Metodi utilizzati
- Preparazione del peptide MOG 35-55 e dell'adiuvante completo di Freund (CFA).
- Iniezione sottocutanea di antigene ed emulsione di CFA.
- Iniezione intraperitoneale di tossina pertussica.
- Monitoraggio giornaliero dei punteggi clinici e del peso degli animali.
Principali risultati
- I segni clinici di EAE tipicamente osservati tra i giorni 9 e 14 dopo l'immunizzazione.
- Induzione riuscita di paralisi flaccida nei topi.
- Il modello consente lo studio delle risposte immunitarie nel sistema nervoso centrale.
- Facilita l'identificazione di nuovi bersagli molecolari per i farmaci.
Conclusioni
- Il modello EAE è uno strumento prezioso per studiare la sclerosi multipla.
- Una gestione adeguata e la riduzione dello stress sono cruciali per un'immunizzazione di successo.
- Questo metodo migliora la comprensione dei processi neuroimmunologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The MOG35-55-induced EAE model in C57BL/6 mice provides a robust and reproducible system for studying autoimmune neuroinflammation relevant to multiple sclerosis pathophysiology. This model enables mechanistic de-risking of therapeutic candidates by recapitulating adaptive immune-mediated demyelination and neurodegeneration. It supports target validation and preclinical screening by allowing evaluation of drug effects on clinical disease progression and immune responses in a genetically tractable background.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of autoimmune hypotheses involving MOG-specific T-cell responses and CNS inflammation.
- Operational Value: Provides a standardized model for validating targets in neuroinflammatory pathways using genetic or pharmacological modulation.
- Predictive Value: Supports target confidence by modeling the effector phase of autoimmune encephalomyelitis with clinical readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable clinical scores and weight loss metrics for dose-response assessment of immunomodulatory compounds.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow for compound testing with defined immunization and monitoring timelines.
- Assay Readiness: Outputs enable standardized evaluation of therapeutic impact on disease onset, severity, and duration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic studies of immune cell infiltration, demyelination, and axonal damage relevant to MS pathology.
- Translational Continuity: Allows evaluation of target engagement and pathway modulation from discovery through preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on clinical score thresholds and histopathological correlates.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, providing immunological and clinical readouts that inform compound advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of autoimmune mechanisms and functional validation of targets in neuroinflammation.
- Screening: Delivers quantitative clinical and phenotypic outputs enabling compound comparison and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Generates longitudinal clinical scoring and weight data for statistical evaluation of treatment effects.
- Translational Research: Connects immunomodulatory mechanisms to disease-modifying potential in a disease-relevant system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for screening multiple candidates across neuroimmunology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in autoimmune CNS disorders through reproducible disease induction.
- Operational Value: Ensures standardization across studies via defined antigen preparation, adjuvant emulsification, and toxin dosing protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets with high translational failure potential.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by linking target modulation to clinical outcomes in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, emulsion preparation, and clinical scoring to minimize variability.
- Dependent on precise CFA-MOG emulsion quality and pertussis toxin dosing for consistent disease induction.
- Necessitates standardized scoring protocols and blinding for cross-functional data interpretation.
- Requires adaptation considerations when translating findings across different genetic backgrounds or disease variants.
- Practical limitations include model variability influenced by microbiota, housing conditions, and technician proficiency.
