Name: Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG 35-55) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Impara a indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) nel topo C57BL/6 utilizzando il peptide MOG 35-55. Questo modello animale riproduce le caratteristiche cliniche della sclerosi multipla per studiare i meccanismi neuroimmunologici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) Münster (SEED 12/3, SB).

1. Osservazioni generali per esperimenti del mouse <ol><li> Tutti gli esperimenti con i topi devono essere effettuate in conformità con le linee guida del rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l&#39;uso. </li><li> Mantenere i topi in condizioni esenti da organismi patogeni e di consentire loro di avere accesso a cibo e acqua ad libitum. Nota: E &#39;importante usare età e topi appaiati per sesso in gruppi sperimentali, perché la suscettibilità alla malattia può variare a seconda dell&#39;età e del sesso. </li><li> A seconda delle condizioni sperimentali adottate, un gruppo di controllo sham immunizzato può essere considerato in cui MOG 35-55 peptide viene sostituito dal PBS senza antigene o un peptide nonencephalitogenic. </li><li> Si prega di considerare aspetti metodologici precedenti esperimenti di partenza (vedi anche sotto). Si consiglia di coinvolgere uno o due osservatori in cieco per EAE punteggio. </li></ol> 2. Preparazione di MOG 35-55 Emulsione <ol><li> 200 ml di un rapporto 1:1 di MOG 35-55 soluzione peptide e CFA deve essere iniettato per ciascun topo. Vi è una certa perdita dell&#39;emulsione viscoso durante la preparazione e l&#39;iniezione. Pertanto, preparare 1,5-2x della quantità necessaria. Calcolare il volume totale dell&#39;emulsione e dividere per 2 per gli importi richiesti sia soluzione MOG 35-55 peptide e CFA. </li><li> Diluire MOG liofilizzato 35-55 in DDH 2 O a una concentrazione finale di 2 mg / ml. Usiamo solitamente 200 mg MOG 35-55 peptide per mouse. Tale importo è contenuta in 100 ml di soluzione di riserva. La soluzione peptide deve essere conservata a -20 ° C. </li><li> Posizionare il contenuto di 1 fiala di essiccata H37Ra Mycobacterium tuberculosis (100 mg) in un mortaio. <ol><li> Terra con mortaio e pestello per ottenere una polvere sottile. </li><li> Aggiungere 10 ml di coadiuvanti incompleto di Freund per ottenere una soluzione madre 10 mg / ml CFA che può essere conservato a 4 ° C. </li><li> Prima di immunizzazione, diluire CFA soluzione stock with IFA ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. Mescolare accuratamente prima dell&#39;uso per risospenderne materiale particolato e prendere in considerazione una certa perdita di volume della soluzione viscosa durante i preparativi sperimentali. </li><li> Mescolare 1:1 con MOG 35-55 soluzione peptide fino / ml viene raggiunta la concentrazione finale di 1 mg. ATTENZIONE:-ucciso calore Mycobacterium tuberculosis stimola la risposta immunitaria innata. Evitare l&#39;inalazione, ingestione e contatto con la pelle e gli occhi. </li></ol></li><li> Preraffreddare soluzioni su ghiaccio. <ol><li> Elaborare 1 ml di 2 mg / ml CFA e 1 ml di 2 mg / ml soluzione MOG 35-55 in due siringhe da 2 ml. Calcolare il numero di siringhe necessarie in base al numero di animali immunizzati. ATTENZIONE: evitare assolutamente cucitura durante la preparazione di adiuvante in quanto può causare granulomi o indurre reazioni autoimmuni. </li><li> Utilizzare un G cannula 27 per il 35-55 soluzione MOG e G cannula 20 per il CFA. Evitare bolle d&#39;aria e collegare entrambe le siringhe con ahree-way-valvola. </li><li> Inviare l&#39;emulsione da una siringa all&#39;altra e miscelare accuratamente per almeno 10 min come una buona emulsificazione è un passaggio critico. Vicino chiudere la tre vie valvola a sostenere emulsione. La soluzione deve essere bianco, rigido e viscoso senza separazione di fasi. </li><li> Emulsione può essere conservato per diversi giorni prima dell&#39;immunizzazione. Attendere almeno 30 minuti dopo la preparazione delle emulsioni per osservare se sono stabili. Prima dell&#39;immunizzazione, disegnare la soluzione in una delle due siringhe e collegare un G cannula 27. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione tossina della pertosse <ol><li> Diverse quantità di tossina della pertosse possono essere trovati in letteratura che dipende anche dalla via di somministrazione (ad esempio per via endovenosa o intraperitoneale). Il nostro laboratorio utilizza 400 ng di tossina della pertosse in 200 ml di PBS per via intraperitoneale nel giorno della vaccinazione e due giorni dopo. ATTENZIONE: pertosse tossina ha molti effetti biologici. Evitare l&#39;inalazione, ingestione e contatto con la pelle e gli occhi. </li><li> Ricostituire 50 mg di tossina della pertosse in 500 microlitri DDH 2 O per una soluzione stock di 100 pg / ml. Conservare a 4 ° C. </li><li> Diluire 1:50 con PBS. 200 ml contengono ora 400 ng di PBS. Preparare la quantità necessaria di siringhe e di prendere in considerazione un eccesso di volume aggiuntivo di ~ 100 microlitri per ogni hub ago. </li></ol> 4. Immunizzazione degli animali <ol><li> Si prega di fare riferimento alla cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale per criteri specifici per la richiesta di eutanasia a breve termine. Il nostro laboratorio utilizza breve narcotizzazione con isoflurano, mentre altri protocolli come l&#39;iniezione di ketamina / xylazina o halothan può anche essere possibile. Attendere anestesia e utilizzare un pizzico piede convergenza anteriore per valutare il livello di anestesia. </li><li> Assicurarsi che la vaccinazione viene eseguita da una persona esperta di ridurre al minimo lo stress per gli animali e per garantire l&#39;immunizzazione ottimale. </li><li> Iniettare 100 ml di lottagen / CFA emulsione per via sottocutanea in due siti differenti su ogni fianco posteriore. Assicurarsi che una bulbose forma di massa sotto la pelle che dovrebbero persistere per tutta l&#39;esperimento. </li><li> Iniettare 200 ml di tossina della pertosse intraperitonelly. </li><li> Assicurarsi che i singoli topi possono essere facilmente identificati per la valutazione quotidiana, ad esempio segni di colore sulla base della coda. </li><li> Somministrare una seconda dose di tossina della pertosse secondo giorno dopo l&#39;immunizzazione. </li></ol> 5. Monitoraggio EAE <ol><li> Peso e score clinico devono essere valutati giornalmente. L&#39;insorgenza di EAE generalmente correlato a perdita di peso, che può essere utilizzato come indicatore di attività della malattia. Si prega di fare riferimento alla cura degli animali istituzionale e utilizzare comitato di predefinire criteri quando i singoli topi devono essere presi fuori degli esperimenti. Questo dovrebbe essere considerato quando la perdita di peso supera il 20% del peso corporeo iniziale oppure quando gravi segni clinici (EAE punteggio 7 o peggio) si verificano. Si prega di fare riferimento al reorientamenti prospettici del rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l&#39;uso per i punteggi massimi consentiti. </li><li> Quando i topi hanno sintomi clinici di EAE, è importante garantire che la bottiglia d&#39;acqua è ancora raggiungibile e che il cibo è posto sul pavimento della gabbia. </li><li> Diversi sintomi di punteggio possono essere usati. Nel nostro laboratorio è stabilita una scala 0-10. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Grado </td><td> Segno clinico </td><td> Commento </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Nessun segno clinico </td><td> Andatura normale, coda si muove e può essere sollevata, la coda si avvolge intorno ad un oggetto rotondo se il mouse si tiene alla base della coda </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Coda Parzialmente limp </td><td> Andatura normale, punta della coda si strugge </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Coda Paralizzato </td><td> Andatura normale, la coda si strugge </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Hind paresi degli arti, il movimento scoordinato </td&gt; <td> Andatura scoordinata, coda arranca, arti posteriori rispondono a pizzicare </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Uno degli arti posteriori paralizzati </td><td> Andatura non coordinata con quella degli arti posteriori trascinamento, coda arranca, un arto posteriore non risponde a pizzicare </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Entrambi gli arti posteriori paralizzati </td><td> Andatura non coordinata con entrambi gli arti posteriori trascinamento, coda arranca, entrambi gli arti posteriori non rispondono a pizzicare </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Arti posteriori paralizzati, debolezza arti anteriori </td><td> Andatura non coordinata con le zampe anteriori lottano per tirare corpo, arti anteriori riflesso dopo la presa, la coda arranca </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Arti posteriori paralizzati, una zampa anteriore paralizzato </td><td> Il mouse non può muoversi, una zampa anteriore risponde a pizzico punta, coda arranca </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Arti posteriori paralizzati, entrambe le zampe anteriori paralizzate </td><td> Il mouse non può muoversi, entrambi arti anteriori non rispondono a pizzico punta, coda arranca </td></tr><tr><td> 9 </td&gt; <td> Moribondo </td><td> Nessun movimento, respirazione alterata </td></tr><tr><td> 10 </td><td> Morte </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Sistema di punteggio clinico.

<ol><li>McFarland, H. F., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+a+complicated+picture+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity.</a> Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).</li>
<li>Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+world+is+not+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the world is not enough.</a> Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).</li>
<li>vander Star, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo models of multiple sclerosis.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).</li>
<li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of multiple sclerosis.</a> Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TASK1+channel+inhibitor+A293+shows+efficacy+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).</li>
<li>Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men%3A+experimental+autoimmune+encephalitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis.</a> Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).</li>
<li>Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAE%3A+an+immunologist%27s+magic+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">EAE: an immunologist's magic eye.</a> Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).</li>
<li>Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pertussis+toxin+modulates+the+immune+response+to+neuroantigens+injected+in+incomplete+Freund%27s+adjuvant%3A+induction+of+Th1+cells+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+presence+of+high+frequencies+of+Th2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells.</a> J. Immunol. 169, 117-125 (2002).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Una moltitudine di differenti modelli di EAE con i protocolli di immunizzazione attiva è stata descritta nel corso degli ultimi decenni. Mentre i modelli di ratto sono stati ampiamente utilizzati fino a poco tempo fa, i topi sono oggi il più popolare organismo modello per la ricerca EAE. Questo sviluppo è tra l&#39;altro a causa del repertorio ampio e sempre crescente di disponibili topi transgenici. Immunizzazione di topi C57BL / 6 con MOG 35-55 peptide è uno dei modelli più diffusi EAE e può essere considerato come un modello affidabile, riproducibile e ben impiego animale. In molti laboratori neuroimmunologici, MOG 35-55 EAE indotta è affermata come il modello di scelta, mentre altri modelli EAE sono utilizzati per più specifiche domande sperimentali. Un punto critico da considerare è la pianificazione delle impostazioni sperimentali per assicurare che gli esperimenti EAE vengono eseguiti metodologicamente corretto. Per la validità interna, segnando accecato dei sintomi della malattia è altamente raccomandato. Compegruppi imental devono essere di età, peso e sesso-abbinato e topi dovrebbero essere assegnati in modo casuale a gruppi di trattamento. Gli esperimenti devono essere sempre eseguiti in conformità con le normative sul benessere degli animali. Gli studi EAE sono spesso sottodimensionato e non tengono in considerazione gli errori statistici di tipo II. Pertanto, prima di esperimenti, calcoli dimensione del campione devono essere eseguite. Gruppi di dimensioni necessarie dipendono dalla dimensione prevista effetto. La consultazione di un esperto per l&#39;analisi statistica potrebbe essere considerato prima di iniziare gli esperimenti EAE. Alcune limitazioni del protocollo devono essere tenuti a mente. Ancora più importante, l&#39;interpretazione dei dati aEAE è compromessa dalla modalità di immunizzazione con l&#39;uso di adiuvante e tossina della pertosse che hanno influenza sia aggiunto a reazione immunologica. Va inoltre considerato che il modello MOG 35-55 EAE mostra principalmente una cellula CD4 + T guidato risposta immunologica. Cellule T CD8 + e cellule B giocanoun ruolo meno importante e protocolli alternativi devono essere considerati quando si affrontano questi tipi di cellule. Il decorso della malattia previsto è acuta, monofasico e auto-limitata. In alternativa, un decorso recidivante-remittente può essere raggiunto anche in modelli EAE alternativi. Un ulteriore importante limitazione del protocollo è una certa tendenza verso la componente immunologica della fisiopatologia MS. Nel corso degli ultimi anni, è diventato sempre più chiaro che la SM ha una forte componente neurodegenerativa. La morte degli oligodendrociti e neuroni risultati in un progressivo accumulo di deficit neurologici. Si deve tener conto che il modello EAE non può essere completamente adatto per affrontare questioni esperimenti relativi alle modalità neurodegenerative di infiammazione autoimmune. Modelli animali alternativi con un focus sul sistema nervoso centrale patologia potrebbero essere considerati - ad esempio, il modello cuprizone che compromette demielinizzazione tossica senza il coinvolgimento del sistema immunitario periferico. Il protocollo descritto da considerarsi come un modello di base neuroimmunologica sperimentale e può essere modificato per altre applicazioni. La procedura sperimentale sopra descritto può essere facilmente applicato ad altri protocolli EAE da diversi ceppi di topi o il tipo e la quantità di proteine ​​(ad esempio, utilizzare PLP 139-151 peptide e topi SJL per un corso della malattia EAE recidivante-remittente che è particolarmente adatto per la valutazione terapeutica effetti sulla recidive). Il protocollo descritto può anche essere usato per esperimenti di trasferimento adottivo (EAE passivo). In questo modello, C57BL / 6 topi sono immunizzati con MOG 35-55 peptide e CFA come descritto sopra. Al contrario, la tossina della pertosse non è necessaria. Dopo 7-15 giorni, milza o linfonodi sono isolate e le cellule immunitarie sono restimolati in vitro con MOG 35-55 peptide e varie citochine prima del trasferimento in un nuovo gruppo di topi C57BL/6se. Questi topi riceventi sviluppano EAE un paio di giorni di anticipo rispetto al momento clasimmunizzazione sico. Nelle condizioni in vitro possono essere variati per domande specifiche immunologici (ad es polarizzazione in T H 1 o T H 17 celle). A volte, bassa incidenza di malattia o sintomi di debolezza potrebbe essere una sfida sperimentale. Alcuni consigli per la risoluzione dei problemi sono: - La gravità della malattia può essere variato con diverse quantità di peptide / mouse. - Concentrazione ottimale CFA può variare da 1-5 mg / ml. Si consideri una titolazione di CFA nello stabilire gli esperimenti. Si prega di fare riferimento alle rispettive linee guida del rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l&#39;uso di concentrazioni di CFA accettati come molti regolamenti vietano concentrazioni CFA superiori a 2 mg / ml. - Diversi metodi sono descritti per preparare l&#39;emulsione. Metodi alternativi come il vortex per 1 ora o ultrasuoni possono essere considerate se il povero emulsione è considerato come possibfonte di errore le. - Età, sesso, stagione dell&#39;anno e delle condizioni ambientali all&#39;interno della struttura degli animali sono fattori importanti che influenzano la suscettibilità EAE. Occorre garantire che le condizioni siano comparabili tra esperimenti indipendenti. Come descritto sopra, il protocollo menzionato può essere utilizzato come punto di partenza per esperimenti EAE adottive. Questo modello è particolarmente adatto per la separazione effetti periferici e SNC di un fenotipo genetico (ad esempio trasferire cellule knockout encefalitogenici tipo selvatico in topi riceventi) e per specifiche domande immunologica del fenotipo delle cellule trasferiti si caratterizza accuratamente. L&#39;ultimo sviluppo nel campo della ricerca EAE nel corso degli ultimi anni sono T recettore delle cellule topi transgenici. Questi topi sviluppano sintomi EAE spontaneamente senza influenze esterne aggirando il problema della adiuvante inoculazione. Tuttavia, questo modello richiede grandi quantità di animali per breeding per garantire gruppi di dimensioni sufficienti. Valutazione dei topi knockout richiede incrocio prima di esperimenti EAE in contrasto aEAE. Come ogni topo sviluppa i sintomi della malattia in un giorno diverso, la valutazione di nuove sostanze può essere piuttosto complicato. Pertanto, il valore della classica aEAE per neuroimmunologica rimane incontrastato.

La sclerosi multipla (SM) è una malattia demielinizzante infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale in cui la distruzione di oligodendrociti e neuroni provoca sintomi clinici eterogenei e accumulando. MS è considerato come un disturbo autoimmune prototipo del sistema nervoso centrale (CNS) e modelli animali sono stati sviluppati per far luce sulla sua complessa patogenesi. Inoltre, le terapie attuali sono solo parzialmente efficaci e mira principalmente la fase infiammatoria della malattia, mentre la componente neurodegenerativa è probabilmente la grande sfida per il futuro approcci terapeutici 1,2. Mentre l&#39;esatta eziologia della malattia è ancora chiaro, una reazione autoimmune contro epitopi sulla guaina mielinica degli assoni del SNC è assunto per provocare l&#39;insorgenza della malattia. Disregolazione del sistema immunitario, la vulnerabilità genetica e fattori ambientali (ad esempio infezioni, vitamina D) si ritieneinfluenza aspetti centrali dei meccanismi fisiopatologici della SM. Tre diversi tipi di modelli animali sono attualmente stabiliti per l&#39;esplorazione di modelli patologici della SM: modelli virali come il virus encefalomielite murino di Theiler (TMEV), modelli indotte da agenti tossici come cuprizone, e, infine, diverse varianti di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) 3, 4. Anche se tutti imitano le caratteristiche della SM, essi differiscono enormemente per caratteristiche patologiche sottostanti, come il coinvolgimento del sistema immunitario adattativo. EAE è il modello animale più comune in quanto è particolarmente utile per studiare percorsi neuroinfiammatorie e spesso serve da modello &quot;prova di principio&quot; per l&#39;efficacia di strategie terapeutiche innovative 5,6. EAE può essere indotta in molti animali diversi (ad esempio topi, ratti, miniswine, cavie, polli o primati). Tuttavia, i topi sono diventati la specie più diffusa di utilizzare, che è almeno in parte dovutoad ampliare il repertorio di sofisticate transgenici o topi knockout 7. La fisiopatologia della EAE è basato sulla reazione del sistema immunitario contro antigeni specifici cerebrali. Questa reazione provoca l&#39;infiammazione e la distruzione delle strutture portanti antigene, con conseguente caratteristiche neurologiche e patologiche comparabili a quelli osservati nei pazienti con SM. Tre approcci diversi possono distinguere: attivamente indotta EAE (aEAE; immunizzazione attiva), trasferiti passivamente EAE (pEAE, il trasferimento di cellule encefalitogeniche da un animale immunizzato), e modelli più recentemente spontanei del mouse EAE (SEAE), che consentono lo studio di autoimmune meccanismi senza alcuna manipolazione esogena. Il modello più semplice è inducibile aEAE nei topi che producono in risultati rapidi e solidi. Questo modello è considerato come il &quot;gold standard&quot; di modelli animali neuroimmunologici da molti ricercatori nel campo 8. Per l&#39;induzione aEAE, l&#39;animaleè immunizzato con una iniezione sottocutanea di un&#39;emulsione composta dell&#39;antigene scelto e completare adjuvans di Freund (CFA) accompagnati da una iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse nel giorno di immunizzazione e due giorni dopo. Di conseguenza, i linfociti T specifici mielina sono attivati ​​in periferia e migrano nel sistema nervoso centrale attraverso il sangue-cervello-barriera. Al momento dell&#39;ingresso nel sistema nervoso centrale, le cellule T sono riattivati ​​dalle cellule presentanti l&#39;antigene locali e infiltranti conseguente successiva cascata infiammatoria, il coinvolgimento di altre cellule come monociti o macrofagi e, infine, a demielinizzazione e morte cellulare assonale 9. A seconda del protocollo di immunizzazione e combinazione di ceppo mouse (per esempio C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) e l&#39;antigene (ad es mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG), proteina basica della mielina (MBP), mielina proteina proteolipid (PLP)), la malattia Naturalmente può prendere una, il decorso della malattia remittente recidivante progressiva o cronica acuta. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; C57BL / 6 topi sono diventati il ​​ceppo più comunemente usato per la costruzione topi transgenici e una moltitudine crescente di knockout o topi transgenici è disponibile. Abbiamo qui descrive un protocollo per l&#39;immunizzazione di topi C57BL / 6 con MOG 35-55 peptide 10 che si traduce in un EAE monofasica con primi sintomi dopo 9-14 giorni, massimo malattia circa 3-5 giorni dopo l&#39;insorgenza della malattia e recupero sintomo lenta e parziale nel corso dei prossimi 10-20 giorni. Poiché il potenziale immunogenico di MOG 35-55 peptide da sola non è sufficiente per indurre la malattia, adiuvanti come CFA sono necessarie. Si presume che i componenti di CFA attivano fagociti mononucleari inducono la fagocitosi di queste molecole e la secrezione di citochine. Ciò comporta il prolungamento della presenza di antigeni e un trasporto più efficiente di questi per il sistema linfatico. Induzione EAE è facilitata dalla applicazione di tossina della pertosse (PT) che è tra l&#39;altro stato suggerito per modularela barriera emato-encefalica e la reattività immunologica sé 11. Dopo l&#39;induzione della malattia, particolare cura deve essere presa per la valutazione giornaliera di topi per i sintomi della malattia.

<table><tbody><tr><td>Topi femmina C57BL/6, età 10-12 settimane, ~20 g di peso</td><td>es. Jackson Laboratory, Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)</td><td>e.g. Pepceuticals Ltd</td><td></td><td>Store a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Freund' incompleto s adiuvante (IFA)</td><td>es. Sigma-Aldrich Co.</td><td>F5506</td><td>Negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Siringhe, 1 ml con 26 G 3/8 in ago</td><td>ad esempio Becton Dickinson & Co.</td><td></td><td></td>309625</tr><tr><td>Siringhe, 2 ml</td><td>es. B. Braun</td><td>7389</td><td></td></tr><tr><td>Aghi, 25 G 5/8 pollici e 30 G 1/2 pollici</td><td>es. Becton Dickinson & Co.,</td><td>305122, 305106</td><td></td></tr><tr><td>Valvola a tre vie</td><td>es. B. Braun</td><td>16494 C</td><td></td></tr><tr><td>Tossina pertosse, liofilizzata in tampone</td><td>Enzo Life Sciences Inc.</td><td>BML-G100</td><td>Negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>M. tubercolosi H37 RA</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Negozio a 4 gradi E</td></tr></tbody></table>

mielina oligodendrocyte glicoproteina (mog<sub&gt; 35-55</sub&gt;) indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (eae) in c57bl / 6 mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

La sclerosi multipla è una malattia cronica neuroinfiammatorie demielinizzante del sistema nervoso centrale con una forte componente neurodegenerativa. Mentre l&#39;esatta eziologia della malattia è ancora chiaro, linfociti T autoreattivi sono pensati per svolgere un ruolo centrale nella fisiopatologia. La terapia MS è solo parzialmente efficace finora e gli sforzi di ricerca continuano ad ampliare le nostre conoscenze sulla fisiopatologia della malattia e di sviluppare nuove strategie di trattamento. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il modello animale più comune per MS condividere molte caratteristiche cliniche e fisiopatologiche. C&#39;è una vasta diversità di modelli di EAE, che riflettono diversi aspetti clinici, immunologici ed istologici della SM umani. EAE Attivamente-indotta nei topi è il più semplice modello inducibile con risultati solidi e replicabili. E &#39;particolarmente adatto per lo studio degli effetti dei farmaci o di particolari geni, utilizzando topi transgenici contestati dalla Neuroi autoimmunenflammation. Pertanto, i topi sono immunizzati con omogenati SNC o peptidi di proteine ​​della mielina. A causa del basso potenziale immunogenico di questi peptidi, sono utilizzati coadiuvanti forti. EAE suscettibilità e fenotipo dipende l&#39;antigene scelto e ceppo roditore. Topi C57BL / 6 sono il ceppo comunemente utilizzato per la costruzione di topo transgenico e rispondono tra gli altri alla mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG). L&#39;epitopo immunogenico MOG 35-55 è sospeso in adiuvante completo di Freund (CFA) prima dell&#39;immunizzazione e la tossina della pertosse si applica al giorno di immunizzazione e due giorni dopo. Topi sviluppano un &quot;classico&quot; EAE monofasico auto-limitata con crescente paralisi flaccida entro 9-14 giorni dalla vaccinazione. I topi vengono valutati quotidianamente utilizzando un sistema di punteggio clinico per 25-50 giorni. Considerazioni speciali per la cura prelievo di animali con EAE così come applicazioni potenziali e limiti di questo modello sono discussi.

Dopo l&#39;immunizzazione, i topi devono essere valutati quotidianamente per la variazione di peso e sintomi clinici. Insorgenza della malattia è tipicamente correlata con una riduzione di peso che potrebbe iniziare 1-2 giorni prima che i sintomi di EAE sono visibili. I segni clinici di EAE solito iniziano tra il giorno 9 e 14 post-vaccinazione. Poiché le lesioni sono prevalentemente localizzate al midollo spinale in MOG-EAE in C57BL / 6 topi, che in genere sviluppano sintomi prevalentemente motorie in un caudale per modello rostrale. Un quadro esemplare di un topo immunizzato con sintomi di EAE (punteggio 6) è mostrata in Figura 1A. Alcuni sintomi EAE atipici potrebbero verificarsi anche come rotolare in modo assiale rotante, l&#39;aspetto curvo o ipersensibilità che non trovano riscontro nella EAE classica score illustrati nella tabella 1. Poiché i sintomi motori sono la caratteristica principale di questo modello, questo punteggio ci dà una buona indicazione della gravità della malattia. Diversi sistemi di monitoraggio (ad esempio segnare 0 -5 o 0-6) e più punteggi compositi complessi valutando diverse disavanzi sono stati pubblicati. Si prega di notare che i topi con sintomi gravi devono essere portati fuori dal dell&#39;esperimento in base al rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l&#39;uso. Topi mostrano recupero generalmente parziale dei sintomi nei prossimi 10-20 giorni. Un decorso della malattia rappresentativo è rappresentato in Figura 1B. Ci sono diversi momenti nel corso della EAE che sono di interesse per valutare parametri di risultati. Alcuni saggi tipici che si trovano spesso vengono descritti molto brevemente. Al massimo malattia, i topi possono essere valutati per la produzione di citochine e la proliferazione dopo ristimolazione di isolate cellule immunitarie con MOG 35-55 peptide in vitro (test di richiamo MOG). Le cellule immunitarie possono anche essere isolati dal cervello e midollo spinale di topi con sintomi di EAE e ulteriormente elaborati, ad esempio mediante citometria a flusso. L&#39;analisi istologica delle sezioni del midollo spinale può essere effettuata in malattie massima per il carico lesionale e demielinizzazione, mentre al momento i punti marcatori per la neurodegenerazione e morte delle cellule neuronali potrebbe essere di interesse. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Risultati rappresentativa EAE. A. immagine rappresentativa di un immunizzato C57BL / 6 mouse con sintomi EAE (EAE punteggio 6). Decorso della malattia B. rappresentativa dopo l&#39;immunizzazione oltre i 30 giorni. I dati sono mostrati come media ed errore standard della media (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla. C57BL / 6 topi sono immunizzati con mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), con un conseguente paralisi flaccida ascendente causata da cellule immunitarie autoreattive nel sistema nervoso centrale. Saranno discussi protocolli per l&#39;induzione della malattia e monitoraggio.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un modello animale di encefalomielite autoimmune sperimentale che imiti le caratteristiche cliniche e fisiopatologiche della sclerosi multipla. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando l'antigene e l'adjuvante e la tossina pertussica. Il secondo passaggio consiste nell'iniettare l'emulsione di antigene e CFA per via sottocutanea e la tossina pertussica per via intraperitoneale.Due giorni dopo, i m sono nuovamente iniettati con tossina della pertosse per via intraperitoneale. Successivamente, gli animali vengono pesati e il loro punteggio clinico viene valutato giornalmente. In definitiva, i segni clinici di encefalomielite autoimmune sperimentale possono solitamente essere osservati tra il nono e il quattordicesimo giorno dopo l'immunizzazione.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti, che comportano, ad esempio, agenti tossici come la rizone o diverse varianti dell'EIE, è che mentre tutti questi modelli riproducono caratteristiche della SM, differiscono notevolmente per le caratteristiche patologiche sottostanti, come il coinvolgimento del sistema immunitario adattativo. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà a causa della complessità nella gestione dell'immunizzazione. È assolutamente necessario ridurre lo stress negli animali e garantire un'immunizzazione ottimale dopo lo sviluppo del protocollo.Questo modello ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroimmunologia per caratterizzare animali knock-out. Per identificare nuovi bersagli molecolari per farmaci o per testare candidati farmaceutici promettenti, preparare la soluzione peptidica diluendo il peptide MOG 35-55 liofilizzato in acqua bidistillata fino a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro. Sono necessari 100 microlitri di questa soluzione per topo e un certo volume andrà perduto durante la preparazione.Preparare quindi da 1,5 a due volte la quantità di soluzione necessaria. Conservare la soluzione peptidica a meno 20 gradi Celsius. Per preparare l'adjuvante completo di Freund (CFA), aggiungere 100 milligrammi di Mycobacterium tuberculosis H37 RA essiccato in un mortaio e macinarlo con un pestello fino a ottenere una polvere fine.Quindi aggiungere 10 millilitri di adiuvante incompleto frons per ottenere una soluzione di CFA a 10 milligrammi per millilitro. La soluzione madre di CFA può essere conservata a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso, previsto per il giorno dell'immunizzazione. Diluire la soluzione madre di CFA con adiuvante incompleto fres fino a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro, mescolare accuratamente per ri-sospendere il materiale particolato e porre la soluzione sul ghiaccio.Dopo aver scongelato un'aliquote della soluzione del peptide MOG 35-55, collocarla sul ghiaccio. Utilizzare una siringa da due millilitri e una cannula da 27 gauge per aspirare un millilitro di CFA.Quindi utilizzare una seconda siringa da due millilitri e un ago da 20 gauge per aspirare un millilitro della soluzione MOG 35-55. Rimuovere eventuali bolle d'aria e collegare entrambe le siringhe a un rubinetto a tre vie. Con il rubinetto a tre vie quasi chiuso, spingere l'emulsione da una siringa all'altra e viceversa, mescolando accuratamente per almeno 10 minuti.Una volta terminato, la soluzione dovrebbe essere bianca, rigida e viscosa, senza separazione delle fasi. Lasciare ora l'emulsione a riposo per almeno 30 minuti o fino a diversi giorni prima della immunizzazione. Verificare che sia ancora emulsionata. Nel giorno dell'immunizzazione, aspirare la soluzione in una delle due siringhe e collegare un cannula da 27 gauge.Ricostituire 50 microgrammi di tossina della pertosse in 500 microlitri di acqua bidistillata. Per una soluzione madre di 100 microgrammi per millilitro, conservare la soluzione madre a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Il giorno dell'immunizzazione, diluire la soluzione madre di tossina della pertosse da uno a 50.Con PBS, preparare una siringa con 200 microlitri della soluzione di pertosse diluita per l'iniezione, contenente 400 nanogrammi di tossina della pertosse, e aspirare ulteriori 100 microlitri per compensare lo spazio morto dell'attacco dell'ago. Dopo aver anestetizzato un topo con iso-fluorano, valutare il livello di anestesia mediante pinzatura del dito del piede. Iniettare 100 microlitri di emulsione antigene CFA per via sottocutanea in due siti diversi su ciascun fianco posteriore.Dopo l'iniezione, dovrebbe formarsi una massa bulbosa sotto la pelle, che deve persistere per tutta la durata dell'esperimento. Successivamente, iniettare la siringa preparata contenente 200 µL di tossina della pertosse per via intraperitoneale. Assicurarsi che i singoli topi possano essere facilmente identificati per la valutazione giornaliera.Ad esempio, mediante segni colorati alla base della coda.

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Alcuni ceppi di topi sono in grado di resistere induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) con proteina basica della mielina. Qui descritto è un protocollo di immunizzazione semplice che inverte la mancanza di risposta e induce malattia paralitica in diversi tipiche macchie resistenti EAE del mouse.

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

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Questo manoscritto descrive i metodi per l'induzione e il punteggio del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE), insieme alla valutazione della distribuzione delle cellule immunitarie e dei livelli di citochine mRNA nei linfonodi, nella milza, nel sangue e nel midollo spinale utilizzando la citometria a flusso e la PCR quantitativa, rispettivamente, in varie fasi della malattia.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

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Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Analisi cinematica di andatura nel piano sagittale produce informazioni molto precise sulle modalità di esecuzione del movimento. Descriviamo l'applicazione di queste tecniche per identificare i deficit di andatura per topi sottoposti a demielinizzazione autoimmune-mediata. Questi metodi possono anche essere usati per caratterizzare i deficit di andatura per altri modelli di mouse con alterata locomozione.

Piano sagittale cinematica Gait Analysis nei topi C57BL/6 sottoposti a MOG35-55 indotto encefalomielite Autoimmune Sperimentale

Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

L'encefalomielite autoimmune sperimentale è uno dei modelli murini più utilizzati di sclerosi multipla. Nel protocollo attuale, i topi C57BL/6J di entrambi i sessi sono immunizzati con il peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina, con conseguente paresi ascendente della coda e degli arti. Qui discutiamo il protocollo di induzione e valutazione dell'EAE.

Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.

Quantificazione degli anticorpi autoreattivi nei topi dopo encefalomielite autoimmune sperimentale

Impara a indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) nel topo C57BL/6 utilizzando il peptide MOG 35-55. Questo modello animale riproduce le caratteristiche cliniche della sclerosi multipla per studiare i meccanismi neuroimmunologici.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG

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