Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all'attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è osservare l'attività dell'inflammasoma in cellule dendritiche umane in vitro utilizzando semplici saggi di lettura IL one beta. Per prima cosa aggiungere R 8 48 alle cellule per indurre l'espressione intracellulare di pro IL one beta. Quindi aggiungere nige per attivare la formazione di tre inflammasomi NLRP.

Ciò a sua volta innesca la scissione del pro IL un beta in un beta maturo prima della secrezione. Successivamente, raccogliere i campioni e misurare i risultati intracellulari pro IL one beta e extracellulari maturi IL one beta ottenuti misurando la secrezione di IL one beta da cellule innescate e attivate mediante immunofluorescenza, western blot ed eli. Un rilevamento dimostra che l'innesco della MDD umana provoca la produzione intracellulare di pro IL one beta in cellule innescate R 8 48 e la secrezione di IL one beta da cellule innescate e attivate con juris nigeriano.

Questo metodo può fornire informazioni sul ruolo dell'inflammasoma NLRP three nella risposta delle cellule dendritiche umane ai ligandi sintetici. Può anche essere applicato ad altri sistemi progettati per testare fattori scatenanti fisiologici come batteri, virus e malattie autoinfiammatorie. Aliquotare 200 microlitri di cellule dendritiche derivate da monociti appena isolate nel loro stato di riposo in una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti.

Inizia con le quattro condizioni standard del controllo negativo non stimolato, solo priming, solo attivazione e priming seguito da attivazione. Quindi, secondo il disegno sperimentale, includere i controlli del diluente per R 8 48 e la nissina per i saggi di colorazione delle citochine intracellulari a valle, includere i duplicati per i controlli dell'isotipo per innescare l'inflammasoma. ADD R 8 48, aggiungere una concentrazione finale di 10 micromolari nei pozzetti appropriati.

Mettere le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 18 ore. Quindi, per attivare l'inflammasoma NLRP tre, aggiungere nige a una concentrazione finale di 20 micromolari. Rimettere le colture nell'incubatore per altre sei ore per raccogliere i campioni, centrifugare la piastra di coltura a 974 volte G per tre minuti senza disturbare i pellet cellulari.

Trasferire ciascun surnatante in una piastra rotonda a fondo separato per misurare la secrezione di citochine mediante EISA. Ora lavare i pellet cellulari tre volte con 200 microlitri di un XPBS per rimuovere qualsiasi IL 1 beta extracellulare dai campioni cellulari per ulteriori analisi con una varietà di tecniche per la rilevazione del western blot di pro IL un beta licare le cellule direttamente in 10 microlitri di tampone di lisi denaturante. Dopo aver trasferito i lisati in provette da 1,5 millilitri, riscaldare i campioni per 10 minuti a 100 gradi Celsius per la rilevazione fluorescente mediante citometria a flusso di IL one beta.

Aggiungere 100 microlitri di terreno PHS al 5% ai campioni cellulari e un microlitro di anticorpi marcati in fluorescenza contro i marcatori fenotipici o il controllo isotipo, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo tre lavaggi PBS, fissare le celle con 100 microlitri di PFA al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tampone permeabile per 30 minuti, seguiti da 62 nanogrammi di anticorpi anti IL un beta FSE o campioni di incubazione isotipica per due ore a 37 gradi Celsius.

Lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di tampone permeabile e risospendere in un XPBS. Avvolgere i campioni in un foglio di alluminio e conservarli a quattro gradi Celsius. Se si rileva IL one beta al microscopio, colorare le cellule con dappy, aggiungere una montagna e posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sopra un vetrino.

Lasciare che la montagna si indurisca durante la notte prima di acquisire immagini al microscopio per il rilevamento fluorescente mediante citometria a flusso. Acquisisci i dati un campione alla volta. Impostare i cancelli sparsi anteriori e laterali sulle celle attive Cancello successivo sulle celle CD 11 C positive CD 14 negative.

Infine, analizzare la popolazione MODC basata sulla colorazione pro IL one beta nell'acquisizione dei dati al microscopio. Impostare il tempo di esposizione con la colorazione positiva R 8 48 campione trattato. Quindi determinare la percentuale di pro IL una beta che esprime MO dcs facilità per il rilevamento del western blot.

Caricare il volume totale del campione sul gel di poliacrilammide. Funzionare a 140 volt fino a quando la parte anteriore dello stampo non fuoriesce dal gel. Trasferire la proteina dal gel di poliacrilammide su A-P-V-D-F immo sulla membrana FL.

Bloccare la membrana con il 5% di BSA in TBST per un'ora. Incubare con l'anticorpo primario agitando a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Dopo tre lavaggi TBST di cinque minuti, incubare con l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per un'ora, dopo altri tre lavaggi TBST, visualizzare la membrana quando si misurano le citochine secrete mediante ELI SA, equilibrare i campioni a temperatura ambiente.

Centrifugare i campioni per consolidare la condensazione del surnatante e seguire le istruzioni del produttore per la misurazione di IL una beta La colorazione delle citochine intracellulari per pro IL one beta consente la microscopia e la lettura dei fatti da cellule dendritiche derivate da monociti CD 11 C positivi CD 14 negativi. Entrambe le tecniche possono essere quantificate in relazione a un controllo cellulare non primario o a riposo, nonché a un controllo isotipico. La percentuale di cellule di colorazione beta pro IL one viene moltiplicata per la mediana geometrica di questa popolazione per fornire l'intensità fluorescente mediana.

L'MFI è paragonabile alla quantità di pro IL one beta presente nelle cellule di colorazione positive. Qui. Le tecniche di immunoblotting vengono utilizzate per misurare il pro IL one beta dai lisati cellulari. I dati quantitativi sono espressi in relazione a un controllo cellulare interno come la beta tubulina, come previsto.

L'immunoblotting per pro IL one beta nelle cellule trattate con NI nigeriana rivela una diminuzione di pro IL one beta. Ciò è completato da un aumento concomitante di IL one beta nei surnatanti, misurato da E ELI a solo un R 8 48, seguito da condizioni nigeriane NI. La misurazione simultanea di altre citochine infiammatorie, come T, NF alfa, IL 10 e IL sei, assicura che Niger sia specifico nel causare la secrezione di IL one beta.

Il livello di priming dipende dal tempo e dalla dose. Ulteriori sperimentazioni come la misurazione della concentrazione di proteine ex extracellulari, il rilevamento della chemiluminescenza da una generazione beta matura o il blocco dell'inflammasoma aiuterebbero a determinare se l'IO ex extracellulare one beta è la forma matura scissa e se la secrezione di IO one beta è nlrp. Tre dipendenti dall'attività dell'inflammasoma.