Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all'attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è osservare l'attività dell'inflammasoma in cellule dendritiche umane in vitro, utilizzando semplici saggi di rilevamento dell'IL-1β. Prima aggiungere R 8 48 alle cellule per indurre l'espressione intracellulare del pro-IL-1β. Successivamente aggiungere nige per attivare la formazione dell'inflammasoma NLRP3.

Ciò a sua volta induce il taglio del pro-IL-1β in IL-1β matura prima della secrezione. Successivamente, raccogliere i campioni e misurare il pro-IL-1β intracellulare e l'IL-1β matura extracellulare, risultati ottenuti misurando la secrezione di IL-1β da cellule sensibilizzate e attivate mediante immunofluorescenza, western blot ed ELISA. Un'analisi di rilevamento dimostra che la sensibilizzazione delle cellule dendritiche umane induce la produzione intracellulare di pro-IL-1β nelle cellule sensibilizzate con R848 e la secrezione di IL-1β da cellule sia sensibilizzate che attivate con Nigericina e ATP.

Questo metodo può fornire informazioni sul ruolo dell'inflammasoma NLRP3 nella risposta delle cellule dendritiche umane a ligandi sintetici. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi progettati per testare stimoli fisiologici come batteri, virus e malattie autoinfiammatorie. Aliquotare 200 microlitri di cellule dendritiche derivate da monociti appena isolate nel loro stato di riposo in una piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo.

Iniziare con le quattro condizioni standard di controllo negativo non stimolato, solo priming, solo attivazione e priming seguito da attivazione. Successivamente, in base al disegno sperimentale, includere i controlli del diluente per R 8 48 e nissin; per i saggi di colorazione intracellulare delle citochine includere duplicati per i controlli isotipici al fine di attivare l'inflammasoma. AGGIUNGERE R 8 48, aggiungendo una concentrazione finale di 10 micromolari alle pozzette appropriate.

Collocare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 18 ore. Successivamente, per attivare l'inflammasoma NLRP3, aggiungere nige a una concentrazione finale di 20 micromolare. Reintrodurre le colture nell'incubatore per ulteriori sei ore; per raccogliere i campioni, centrifugare la piastra di coltura a 974 ×g per tre minuti senza disturbare i pellet cellulari.

Trasferire ogni sopranatante in una piastra separata a fondo rotondo per misurare la secrezione di citochine mediante EISA. Lavare ora i pellet cellulari tre volte con 200 microlitri di 1x PBS per rimuovere qualsiasi IL-1β extracellulare dai campioni cellulari, da sottoporre successivamente ad analisi mediante diverse tecniche. Per la rilevazione mediante western blot della pro-IL-1β, lisare direttamente le cellule in 10 microlitri di buffer di lisi denaturante. Dopo aver trasferito i lisati in provette da 1,5 millilitri, incubare i campioni per 10 minuti a 100 gradi Celsius per la rilevazione fluorescente mediante citometria a flusso dell'IL-1β.

Aggiungere 100 microlitri di mezzo PHS al 5% ai campioni cellulari e un microlitro di anticorpi marcati con fluorocromo per i marcatori fenotipici o il controllo isotipico, quindi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo tre lavaggi con PBS, fissare le cellule con 100 microlitri di PFA al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tampone permeabilizzante per 30 minuti, seguiti da 62 nanogrammi di anticorpo anti IL-1β FSE o controllo isotipico; incubare i campioni per due ore a 37 gradi Celsius.

Lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di tampone permeabilizzante e risospendere in un XPBS. Avvolgere i campioni nella stagnola e conservare a quattro gradi Celsius. Se si desidera rilevare IL-1β mediante microscopia, colorare le cellule con DAPI, aggiungere montante e posizionare delicatamente un coprioggetto sulla superficie di un vetrino.

Lasciare riposare il campione durante la notte prima di acquisire immagini al microscopio per la rilevazione fluorescente mediante citometria a flusso. Acquisire i dati un campione alla volta. Impostare i parametri di diffusione anteriore e laterale sulle cellule vitali. Successivamente, selezionare le cellule positive per CD11c e negative per CD14.

Analizzare infine la popolazione di MODC in base alla colorazione per pro-IL-1β nei dati acquisiti mediante microscopia. Impostare il tempo di esposizione utilizzando il campione trattato con R 8 48 che mostra una colorazione positiva. Quindi determinare la percentuale di MODC che esprimono pro-IL-1β per il rilevamento mediante western blot.

Caricare l'intero volume del campione sul gel di poliacrilamide. Eseguire a 140 volt finché il fronte colorato non esce dal gel. Trasferire le proteine dal gel di poliacrilamide sulla membrana FL in A-P-V-D-F immo.

Bloccare la membrana con BSA al 5% in TBST per un'ora. Incubare con l'anticorpo primario sotto agitazione a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Dopo tre lavaggi con TBST di cinque minuti, incubare con l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per un'ora; dopo altri tre lavaggi con TBST, acquisire l'immagine della membrana quando si misurano citochine secrete mediante ELISA, equilibrando i campioni a temperatura ambiente.

Centrifugare i campioni per consolidare la condensazione del sopranatante e seguire le istruzioni del produttore per la misurazione dell'IL una beta mediante colorazione intracellulare per citochine; la colorazione per la pro-IL una beta consente analisi al microscopio e letture quantitative da cellule dendritiche derivate da monociti CD11c positivo CD14 negativo. Entrambe le tecniche possono essere quantificate in relazione a un controllo di cellule non attivate o di riposo, nonché a un controllo di isotipo. La percentuale di cellule colorate per la pro-IL una beta viene moltiplicata per la mediana geometrica di questa popolazione per ottenere l'intensità mediana di fluorescenza.

L'MFI è paragonabile alla quantità di pro IL-1β presente nelle cellule positivamente marcate. Di seguito, vengono utilizzate tecniche di immunoblotting per misurare la pro IL-1β nei lisati cellulari. I dati quantitativi sono espressi in relazione a un controllo cellulare interno, come la beta-tubulina, come previsto.

Il blot immuno per la pro-IL-1β in cellule trattate con NI-Nigericina rivela una diminuzione della pro-IL-1β. Questo risultato è accompagnato da un contemporaneo aumento della IL-1β nei supernatanti, misurato mediante saggio ELISA solo dopo condizioni con NI-Nigericina. La misurazione simultanea di altri citochine infiammatorie, come TNF-α, IL-10 e IL-6, conferma che la Nigericina è specifica nell'indurre la secrezione di IL-1β.

Il livello di priming dipende dal tempo e dalla dose. Ulteriori esperimenti, come la misurazione della concentrazione proteica extracellulare, il rilevamento della chemiluminescenza derivante dalla generazione di IO-1β maturo o il blocco dell'inflammasoma, potrebbero aiutare a determinare se IO-1β extracellulare è la forma matura e tagliata e se la secrezione di IO-1β è dipendente dall'attività dell'inflammasoma NLRP3.