Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire un tessuto tridimensionale della cartilagine umana per testare la fattibilità della stampa 3D di tessuti, utilizzando una stampante a getto d'inchiostro termica modificata con fotopolimerizzazione simultanea. Ciò si ottiene modificando prima una stampante a getto d'inchiostro termico Hewlett Packard desk jet 500 disponibile in commercio e 5 1 16 2 6, una cartuccia d'inchiostro monocromatica in una stampante bio. Il secondo passo consiste nel combinare una semplice fase di stampa 3D e una lampada UV a lunga lunghezza d'onda per fornire la polimerizzazione istantanea dell'inchiostro biologico iniettato durante il processo di produzione.

Successivamente, l'inchiostro biologico viene preparato sospendendo condrociti articolari umani espansi in una soluzione di polietilenglicole al 10% a 5 milioni di cellule per millilitro. Il passaggio finale consiste nel stampare il tessuto cartilagineo strato per strato con fotopolimerizzazione simultanea. In definitiva, microscopia confocale e istologia.

La colorazione viene utilizzata per mostrare la distribuzione uniforme dei condrociti stampati in un idrogel 3D e l'eccellente produzione di matrice extracellulare della cartilagine nella neocartilagine omogenea durante la coltura. Il vantaggio principale di questa tecnologia rispetto alle misure esistenti come la polimerizzazione dopo la fabbricazione manuale o le celle di seduta dopo la scansione per la fabbricazione è che le celle stampate vengono consegnate con precisione nella posizione tattile e rimangono in posizione nella matrice. Invece di pensare al fondo dell'impalcatura a causa della gravità, forma una cartuccia omogenea.

La modifica della stampante illustrata in questo video si basa su una stampante a getto d'inchiostro termico Hewlett Packard desk jet 500 e su una cartuccia d'inchiostro nero 5 1 6 2 6 A. Iniziare rimuovendo il coperchio di plastica superiore della stampante e staccando con cautela il pannello di controllo dal coperchio. Staccare i tre collegamenti dei cavi tra la parte superiore della stampante e la base.

Quindi rimuovere la parte superiore della stampante dalla base. Successivamente, i piccoli accessori in plastica e gomma che compongono il sistema di pulizia della testina di stampa vengono rimossi dalla parte superiore della stampante. Rimuovere la base del vassoio della carta con le molle.

Anche la piastra metallica che copre la barra di alimentazione della carta in plastica deve essere rimossa. Inoltre, la barra di alimentazione della carta in plastica deve essere tagliata nella posizione centrale della ruota di alimentazione e le due ruote di alimentazione della carta rimosse. Ai fini di questo video, questi componenti sono già stati rimossi.

Dopo aver pulito la polvere e i detriti utilizzando salviette ad aria compressa ed etanolo, fissare la parte superiore della stampante alla base prima di utilizzare i raggi UV. Sterilizzata la stampante modificata per almeno due ore in una cappa a flusso laminare. Per modificare la cartuccia d'inchiostro, tagliare prima il cappuccio.

Utilizzando una sega a mano, svuotare l'inchiostro e rimuovere il filtro che copre il serbatoio del pozzetto inferiore della cartuccia. Sciacquare accuratamente la cartuccia con acqua corrente per rimuovere gli residui di inchiostro. Sonicare la cartuccia in acqua deionizzata per 10 minuti.

Esaminare la cartuccia per assicurarsi che tutto l'inchiostro sia stato rimosso. Spruzzare accuratamente la cartuccia con etanolo al 70% per la sterilizzazione, seguito da acqua deionizzata sterilizzata. Infine, installare una lampada UV a lunghezza d'onda lunga sulla piattaforma di stampa per fornire una capacità di fotopolimerizzazione simultanea.

Misura l'intensità dei raggi UV sulla piattaforma di stampa utilizzando un misuratore di luce UV. Regolare la distanza tra la lampada UV e la piattaforma della stampante, in modo che l'intensità sul soggetto di stampa sia compresa tra quattro e otto milliwatt per centimetro quadrato. Questa distanza tra la lampada e la piattaforma della stampante deve essere di circa 25 centimetri.

L'inchiostro biologico è preparato da condrociti umani per espandere i condrociti in una lastra monostrato. 5 milioni di condrociti umani in ogni fiaschetta di coltura tissutale T 1 75 per l'espansione cellulare In DMEM integrato con il 10% di siero di vitello e una x penicillina streptomicina glutammina cellule di coltura a 37 gradi Celsius con aria umidificata contenente il 5% di anidride carbonica. Cambiare il terreno di coltura ogni tre giorni fino a quando le cellule non sono confluenti all'85%.

Usa le celle dello stesso passaggio. Preparare la soluzione di polietilenglicole DL o peda. Sciogliere il peda in PBS fino a una concentrazione finale del 10% in peso per volume.

Aggiungere il fotoiniziatore I 2 9 5 9 a una concentrazione finale dello 0,05% in peso per volume del filtro. Sterilizzare la soluzione quando i condrociti umani in coltura sono confluenti all'85%. Raccogliere le cellule dopo aver calcolato la concentrazione delle cellule.

Trasferire il volume di sospensione cellulare necessario per preparare il bio in 5 milioni di cellule per millilitro in una centrifuga a provette coniche a 1200 giri/min per cinque minuti. Per pellettare le cellule, aspirare il surnatante e sospendere le cellule nella soluzione Pega preparata per formare l'inchiostro biologico. Per iniziare questa procedura, accendere la stampante e il laptop utilizzando Microsoft Word, creare un modello di stampa di un cerchio pieno con un diametro di quattro millimetri.

Posizionare lo stampo di plastica nella stampante. Regola la posizione del modello e assicurati che venga stampato esattamente nello stampo di plastica. Calcola il numero di stampe necessarie per raggiungere lo spessore desiderato dell'impalcatura.

Per un'altezza di quattro millimetri, sono necessarie 220 stampe per creare l'impalcatura desiderata. Caricare l'inchiostro bio nella cartuccia d'inchiostro. Coprire la cartuccia con un foglio di alluminio per proteggerla dall'esposizione diretta agli uuv.

Durante la stampa, inviare il comando di stampa alla stampante. Quando la stampante inizia a stampare, tirare il sensore della carta per continuare a stampare. In assenza di carta che passa attraverso la stampante, l'intero processo di stampa dovrebbe richiedere meno di quattro minuti per un'impalcatura di quattro millimetri di diametro e quattro millimetri di altezza.

Trasferire la neocartilagine stampata in una piastra da 24 pozzetti e aggiungere 1,5 millilitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto. Per valutare la vitalità cellulare, incubare la neocartilagine stampata in vitalità morta viva. Soluzione di lavoro di citotossicità a temperatura ambiente per 15 minuti al buio, tagliare a metà l'idrogel carico di cellule Dopo aver acquisito immagini fluorescenti dell'area di taglio, chiedere a un osservatore in cieco di contare le cellule vive e morte in cinque immagini scattate a caso per calcolare la vitalità cellulare.

In questa foto viene mostrato un tessuto neocartilagineo stampato rappresentativo con un diametro di quattro millimetri e un'altezza di quattro millimetri in base alle proprietà della stampante a getto d'inchiostro termica modificata. Per un costrutto di queste dimensioni, il volume e lo spessore di ogni strato stampato durante la costruzione strato per strato erano rispettivamente di 0,23 microlitri e 18 micron. L'intero processo di stampa per costruire il tessuto neocartilagineo ha richiesto meno di quattro minuti.

Queste immagini sono di condrociti marcati con coloranti fluorescenti verdi e arancioni. Il pannello A mostra una distribuzione cellulare uniforme dei condrociti stampati nello scaffold 3D. A causa della fotopolimerizzazione simultanea dell'impalcatura circostante durante la deposizione cellulare, il processo di stampa e fotopolimerizzazione è stato completato in quattro minuti con una vitalità cellulare del 90%. Al contrario, il pannello B mostra che senza fotopolimerizzazione simultanea, invece di rimanere nelle posizioni inizialmente depositate, la cellula è affondata nell'interfaccia orizzontale inferiore a causa della gravità.

Ci sono voluti 10 minuti di esposizione ai raggi UV per il gel, un costrutto delle stesse dimensioni di un A con una vitalità cellulare del 63% di zafferano e la colorazione dei condrociti stampati nell'idrogel PEG mostra un aumento graduale della produzione di prot glicani durante la coltura, indicando il fenotipo congenico dei condrociti stampati in 3D e la formazione di una neocartilagine omogenea. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare una stampante a getto d'inchiostro termica modificata per creare tessuti calcolati tridimensionali con una distribuzione uniforme delle cellule in un'impalcatura 3D.