L'uso di biosensori ottici privi di etichetta per rilevare modulazione dei canali del potassio da G-recettori accoppiati a proteine

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare la modulazione dei recettori accoppiati a proteine G da parte dei canali del potassio, utilizzando biosensori ottici senza etichetta basati sulla variazione della lunghezza d'onda di risonanza per raggiungere questo scopo. Cellule HEK 293 non trasfettate e cellule HEK 293 stabilmente trasfettate che esprimono il canale del potassio attivato dal sodio di ratto Slack B vengono seminate in una piastra ottica da 384 pozzetti e lasciate incubare tutta la notte. Successivamente, viene effettuata una misurazione del valore iniziale della massa vicina alla membrana plasmatica e vengono aggiunti agonisti dei recettori accoppiati a proteine G endogeni o GPCR. Come passaggio finale, si misura la variazione del segnale risultante dall'attivazione dei GPCR e si calcola la modulazione del canale del potassio su questa risposta.

In definitiva, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi delle neuroscienze e della segnalazione cellulare, misurando quantitativamente i meccanismi di segnalazione tra recettori accoppiati a proteine G e canali del potassio. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi attualmente disponibili per studiare le interazioni tra canali e proteine, ad esempio i saggi di co-precipitazione, consistono nella possibilità di eseguire il saggio su cellule vive e nel non richiedere l'uso di marcatori esogeni, che potrebbero alterare la struttura della proteina interagente.

E infine, all'interno delle cellule vive, è effettivamente possibile seguire le interazioni in tempo reale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui segnali tra recettori accoppiati a proteine G e canali del potassio, può anche essere utilizzato per studiare le risposte cellulari derivanti da cambiamenti indotti dal ligando nell'adesione cellulare, nella diffusione della tossicità, nella proliferazione, nella migrazione e in qualsiasi variazione della vicinanza della membrana plasmatica al biosensore ottico.

La tecnica ha inoltre il potenziale per essere utilizzata nella scoperta di nuovi approcci terapeutici per malattie causate da alterazioni dei canali ionici o dei recettori, come molte canalopatie, poiché può essere impiegata come metodo ad alto rendimento per testare gli effetti di agenti farmacologici sulle proteine dei canali. Interazioni proteiche. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di utilizzare questo metodo quando ci siamo resi conto della necessità di sviluppare un saggio in grado di analizzare le interazioni tra proteine dei canali in cellule vive.

Iniziare il rivestimento della piastra ottica biosensore da 384 pozzetti idratando una piastra di biossido di titanio con 20 microlitri per pozzetto di acqua sterile per colture cellulari, per 15 minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta a 16 canali per lavare la piastra una volta con 50 microlitri di soluzione salina tamponata al fosfato o PBS per pozzetto.

Successivamente, aggiungere 20 microlitri di una soluzione lavorativa di fibronectina preparata in ogni pozzetto prima di incubare per due ore a temperatura ambiente per creare la matrice extracellulare o ECM dopo l'incubazione. Lavare la piastra una volta con 50 microlitri di PBS per pozzetto, quindi aggiungere 40 microlitri di una soluzione lavorativa di ovoalbumina preparata in ciascun pozzetto.

Incubare bene la piastra durante la notte a quattro gradi Celsius per bloccare la piastra dopo il legame con l'ovalbumina. Lavare la piastra tre volte con 50 microlitri di PBS per pozzetto. Le piastre rivestite con ECM possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di quattro otto ore.

Rimuovere il mezzo di crescita sia dalle cellule HEK 293 non resecate che dalle cellule HEK 293 che esprimono stabilmente Slack B, coltivate come descritto nel protocollo testuale. Quindi aggiungere tripsina per staccare le cellule dalla piastra. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1000 ×g per un minuto.

Rimuovere il mezzo tripsinico e risospendere le cellule nel mezzo di crescita. Utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatico, determinare la concentrazione delle cellule per minimizzare gli effetti dell'evaporazione durante l'incubazione; diluire le cellule per ottenere il numero desiderato di cellule per pozzetto. Per questi esperimenti, in un volume di 50 microlitri di mezzo di crescita, utilizzare 1000 cellule per pozzetto.

Sono state seminate sul biosensore dopo aver pipettato 50 microlitri di cellule diluite in ciascun pozzetto, lasciando le cellule adese incubare tutta la notte in mezzo di crescita a 37 gradi Celsius, 5%CO2. Per preparare il saggio del biosensore ottico a gradiente di lunghezza d'onda di risonanza o RWG. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule al termine dell'incubazione.

Lavare le cellule una volta con soluzione salina equilibrata di Hank e quindi aggiungere 25 microlitri della soluzione a ciascuna. Posizionare la piastra del biosensore sul lettore e lasciare che le cellule raggiungano l'equilibrio alla temperatura ambiente per uno o due ore. Nel frattempo, preparare una piastra separata per i composti, dalla quale verranno aggiunti i ligandi di interesse alla piastra del biosensore durante il saggio.

Per questi saggi, 25 microlitri di soluzione contenente il composto sono stati aggiunti in ogni pozzetto della piastra biosensore per un volume totale di 50 microlitri. Per eseguire il saggio biosensore ottico RWG, effettuare una misurazione di base con il sistema scanner per i pozzetti da A1 a P12, che rappresentano metà della piastra da 384 pozzetti. Utilizzare una risoluzione massima di 3,75 micrometri per pixel per i 1,5 millimetri centrali di ciascun pozzetto, impiegando il software di scansione "bind scan"; questa scansione di base richiederà circa 30 minuti.

Quindi aggiungere 25 microlitri delle soluzioni del composto in ciascuna pozzetta, da A1 a P12. Successivamente, effettuare una misurazione iniziale delle pozzette da A13 a P24. Dopo aver ottenuto la misurazione iniziale di queste pozzette, aggiungere 25 microlitri delle soluzioni del composto in ciascuna delle pozzette da A13 a P24.

Come passaggio finale, effettuare una misurazione post-edizione del composto per le pozzette da A1 a P12 e ripetere per le pozzette da A13 a P24. Per analizzare i dati del saggio, aprire i dati del saggio di legame per la misurazione della linea di base in Windows e fare clic sul pulsante dell'editor della griglia per abilitare la selezione delle celle. Il software calcolerà le metriche di interesse definite dall'utente; aprire i plugin, che includono il cercatore di cellule, e impostare i parametri della funzione nel cercatore di cellule in modo che le cellule siano distinguibili rispetto allo sfondo del biosensore.

Esportare il file della mappa cellulare, che contiene i dati del rilevatore di cellule per la misurazione di base. Ripetere questi passaggi per i dati acquisiti dopo l'aggiunta del composto. Quindi aprire il plugin di base o quello aggiuntivo e importare la mappa cellulare ottenuta dalla misurazione di base.

Il software calcolerà lo spostamento del valore della lunghezza d'onda di picco o PWV tra i dati di fondo e quelli successivi al composto. Selezionare delta cell mean per l'output dello spostamento medio di PWV per le cellule. I dati possono quindi essere esportati in Microsoft Excel per ulteriori analisi.

Slack b stabilmente trasfettato, HEK 293. Le cellule e le cellule controllo non trasfettate HEK 293 sono state seminate a 1000 cellule per pozzetto su piastre biosensore RWG da 384 pozzetti rivestite con ECM; sono state generate mappe di gradiente di densità della massa prima e a 30 minuti dalla aggiunta del composto mediante la scansione bind.

Le aree software mostrate in rosso rappresentano i pixel identificati come appartenenti alle cellule, mentre le linee gialle distinguono le cellule dallo sfondo grigio della piastra. Il software bind view è stato utilizzato per determinare lo spostamento della PWV in seguito all'aggiunta di un agonista del recettore accoppiato alla proteina G, sottraendo la PWV dopo l'aggiunta del composto dalla PWV basale. Questo è rappresentato da un gradiente di colore in cui il rosso indica un aumento del valore della lunghezza d'onda di picco e il blu indica assenza di variazione.

Il recettore muscarinico endogeno di tipo M1 in risposta al carbacolo è stato applicato sia a cellule HEK 293 di controllo non trasfettate sia a cellule HEK 293 che esprimono stabilmente slack B, determinando un aumento positivo del valore della lunghezza d'onda di picco rispetto alle cellule di controllo. Le cellule trasfettate con slack B hanno mostrato un incremento maggiore del valore della lunghezza d'onda di picco. Il peptide S-F-L-L-R NH2, sale di trifluoroacetato, e il pentapeptide attivatore del recettore della trombina a estremità terminale, che presenta attività agonista nei confronti del recettore accoppiato a proteina G (GPCR) attivato da proteasi di tipo 1, hanno mostrato anch'essi risposte differenziali nelle cellule non trasfettate e in quelle trasfettate con slack B.

Questi risultati mostrano che la presenza del canale Slack B aumenta significativamente lo spostamento della velocità di propagazione del polso (PWV) che si verifica in seguito all'attivazione del recettore accoppiato alla proteina G endogeno nelle cellule K, e dimostrano la fattibilità di utilizzare questo saggio per studiare le interazioni tra proteine di canale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sviluppare ed eseguire un saggio con biosensore ottico senza marcatura. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita nell'arco di due giorni, a condizione che le cellule e i reagenti siano stati preparati con cura durante il tentativo di questa procedura.

È importante ricordare che i parametri del saggio, come il numero di cellule da seminare, il tempo di incubazione dei ligandi, ecc., devono essere ottimizzati per diverse linee cellulari. Una volta eseguita questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi, come R e l'intelligenza artificiale, per cercare di determinare quali proteine specifiche siano necessarie per il cambiamento osservato nel segnale. Non dimenticare che lavorare con colture cellulari umane può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come lavorare in una cappa a sicurezza biologica devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.