L'uso di biosensori ottici privi di etichetta per rilevare modulazione dei canali del potassio da G-recettori accoppiati a proteine

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare la modulazione dei recettori accoppiati a proteine G da parte dei canali del potassio, utilizzando biosensori ottici di classificazione della lunghezza d'onda di risonanza senza marcatura per ottenere questo risultato non resecato, le cellule HEK 2 93 e le cellule HEK 2 93 che esprimono stabilmente il canale del potassio attivato dal sodio di ratto slack B sono posizionate su una piastra di biosensore ottico a 384 pozzetti e lasciate incubare durante la notte. Successivamente, viene eseguita una misurazione di base della massa vicino alla membrana plasmatica e vengono aggiunti agonisti dei recettori endogeni accoppiati a proteine G o G PCR. Come passaggio finale, viene misurata la variazione del segnale risultante dall'attivazione del GPCR e viene calcolata la modulazione del canale del potassio di questa risposta.

In definitiva, questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze e della segnalazione cellulare misurando quantitativamente i meccanismi di segnalazione tra i recettori accoppiati a proteine G e i canali del potassio. I principali vantaggi dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi attualmente esistenti per esaminare le interazioni tra canali e proteine, ad esempio i saggi di CO e precipitazione, sono che il test può essere eseguito utilizzando cellule viventi. Non richiede l'uso di marcature esogene, che potrebbero alterare la struttura della proteina interagente.

E infine, all'interno delle celle viventi, è possibile seguire le interazioni in tempo reale. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla segnalazione tra GPCR e canali del potassio. Può anche essere utilizzato per studiare le risposte cellulari derivanti da cambiamenti indotti dal ligando nell'adesione cellulare e nella diffusione della tossicità, della proliferazione, della migrazione e di qualsiasi cambiamento nella vicinanza della membrana plasmatica al biosensore ottico.

La tecnica ha anche il potenziale per essere utilizzata nella scoperta di nuovi approcci terapeutici alle malattie causate da canali ionici o anomalie dei recettori, come molte canalopatie, perché può essere utilizzata come metodo ad alto rendimento per testare gli effetti di agenti farmacologici sulla proteina canale. Interazioni proteiche. Abbiamo avuto l'idea di utilizzare questo metodo per la prima volta quando ci siamo resi conto che era necessario sviluppare un test che potesse esaminare le interazioni delle proteine canale nelle cellule viventi.

Inizio 384. Rivestimento ottico della piastra del biosensore del pozzetto mediante idratazione di una piastra di biossido di titanio con 20 microlitri per pozzetto di coltura tissutale sterile, grado acqua per 15 minuti. Utilizzare quindi un pipettatore a 16 canali per lavare la piastra una volta con 50 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS per pozzetto.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di una soluzione di lavoro preparata per la fibronectina a ciascun pozzetto prima di incubare per due ore a temperatura ambiente per creare la matrice extracellulare o ECM dopo l'incubazione. Lavare la piastra una volta con 50 microlitri di PBS per. Bene, quindi aggiungi 40 microlitri di una soluzione di lavoro di ovoalbumina preparata a ciascuno.

Incubare bene la piastra per una notte a quattro gradi Celsius per bloccare la piastra dopo il legame con l'ovoalbumina. Lavare la piastra tre volte con 50 microlitri di PBS per pozzetto. Le piastre rivestite ECM possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di quattro otto ore.

Rimuovere il terreno di crescita sia dalle cellule HEK 2 93 non resecate che dalle cellule HEK 2 93 che esprimono stabilmente lo slack B che è stato coltivato come descritto nel protocollo di testo. Quindi aggiungere la tripsina per rimuovere le cellule dalla piastra. Raccogli le celle in centrifuga a 1000 volte la gravità per un minuto.

Rimuovere il mezzo tripsina e risospendere le cellule nel terreno di crescita. Utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato, determinare la concentrazione delle cellule per ridurre al minimo gli effetti dell'evaporazione durante l'incubazione Diluire le cellule per ottenere il numero desiderato di cellule per pozzetto. In un volume di 50 microlitri di terreno di crescita per questi esperimenti, 1000 cellule per pozzetto.

Sono stati placcati sul biosensore dopo aver pipettato 50 microlitri di cellule diluite in ciascuna, consentire alle cellule sedute di incubare durante la notte in mezzo di crescita a 37 gradi Celsius, 5% di CO2. Per preparare la classificazione della lunghezza d'onda di risonanza o il saggio del biosensore ottico RWG. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule dopo l'incubazione.

Lavare le cellule una volta con la soluzione salina bilanciata di matassa e poi aggiungere 25 microlitri di soluzione a ciascuna. Posizionare la piastra del biosensore sullo scanner di legatura e lasciare che le cellule si equilibrino a temperatura ambiente per una o due ore. Nel frattempo, preparare una piastra composta separata da cui verranno aggiunti i ligandi di interesse alla piastra del biosensore durante il saggio.

Per questi saggi, sono stati aggiunti 25 microlitri di soluzione contenente composto a ciascun pozzetto sulla piastra del biosensore per un volume totale di 50 microlitri. Per eseguire il test del biosensore ottico RWG, eseguire una misurazione di base con il sistema di scansione per i pozzetti, da A uno a P 12, che rappresentano la metà dei 384. La piastra del pozzetto utilizza una risoluzione massima di 3,75 micron per pixel per gli 1,5 millimetri centrali di ciascun pozzetto utilizzando il software di scansione di binding, questa scansione di base richiederà circa 30 minuti.

Quindi aggiungere 25 microlitri di soluzioni composte a ciascun pozzetto per pozzetti, da uno a P 12. Quindi, eseguire una misurazione di base dei pozzetti da A 13 a P 24. Seguendo la linea di base di questi pozzetti, aggiungere 25 microlitri di soluzioni composte a ciascuno dei pozzetti, da A 13 a P 24.

Come passaggio finale, eseguire una misurazione post edizione composta per i pozzetti, da A uno a P 12 e ripetere per i pozzetti da 13 a P 24. Per analizzare i dati del saggio, aprire il collegamento dei dati del saggio per la misurazione della linea di base in Windows e fare clic sul pulsante dell'editor della griglia per abilitare la selezione delle celle. Il software calcolerà le metriche di interesse definite dall'utente, aprirà i plug-in, che includono il cercatore di celle e i parametri di base o impostati dalla funzione nel cercatore di celle in modo che le cellule siano distinguibili dallo sfondo del biosensore.

Esportare il file della mappa delle celle, che contiene i dati del cercatore di celle per la misurazione della linea di base. Ripetere questi passaggi per i dati di addizione post-composta. Quindi apri la linea di base o il plug-in e importa la mappa delle celle dalla misurazione della linea di base.

Il software calcolerà lo spostamento del valore della lunghezza d'onda di picco o PWV tra i dati di fondo e post composti. Selezionare la media delle celle delta per l'output dello spostamento medio in PWV per le celle. I dati possono quindi essere esportati in Microsoft Excel per ulteriori analisi.

Allentamento b stabilmente trasfettato, HEK 2 93. Cellule e celle di controllo HEK 2 93 sono state posizionate a 1000 cellule per pozzetto su 384. Bene, le piastre del biosensore RWG rivestite ECM, le mappe del gradiente di densità della massa sono state generate prima e 30 minuti dopo l'edizione del composto con la scansione di legame.

Le aree software mostrate in rosso rappresentano i pixel identificati come appartenenti alle celle e le linee gialle, che distinguono le celle dallo sfondo grigio della lastra. Il software di visualizzazione bind è stato utilizzato per determinare lo spostamento della PWV sull'edizione agonista GPCR sottraendo l'edizione post composto PWV dalla PWV di base. Ciò è dimostrato da un gradiente di colore in cui il rosso rappresenta uno spostamento positivo nel valore della lunghezza d'onda di picco e il blu non rappresenta alcun cambiamento.

Il recettore muscarinico endogeno M1 contro il carbaholo è stato applicato sia alle cellule HEK 2 93 di controllo non resecate che alle cellule HEK 2 93 che esprimono stabilmente slack B e ha determinato un aumento positivo del valore della lunghezza d'onda di picco rispetto alle cellule di controllo. Le celle trasfettate B allentate avevano un aumento maggiore del valore della lunghezza d'onda di picco. S-F-L-L-R NH due, sale tri fluoro acetato e pentapeptide attivante il recettore terminale della trombina terminale che mostra attività agonista contro il recettore attivato dalla proteasi GPCR endogena uno ha anche mostrato risposte differenziali in cellule trasfettate B non resecate e allentate.

Questi risultati mostrano che la presenza del canale B Slack aumenta significativamente lo spostamento della PWV che si verifica dopo l'attivazione della PCR G endogena nelle cellule K e dimostrano la fattibilità dell'utilizzo di questo test per studiare le interazioni proteiche dei canali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare ed eseguire un saggio di biosensore ottico senza marcatura. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita nel corso di due giorni se le cellule e i reagenti sono stati preparati con cura durante il tentativo di questa procedura.

È importante ricordare che i parametri del test, come il numero di cellule da inserire, il tempo di incubazione dei ligandi, eccetera, devono essere ottimizzati per le diverse linee cellulari. Una volta eseguita questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi come R e AI per cercare di determinare quali particolari proteine sono necessarie per il cambiamento osservato nel segnale. Non dimenticare che lavorare con colture cellulari umane può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in una cappa di biosicurezza.