Un saggio di legame High Throughput MHC II per l'analisi quantitativa dei peptidi epitopi

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare il legame di brevi peptidi con le proteine immunitarie umane MHC di classe II mediante un saggio ad alto rendimento su piastre da 384 pozzetti. Questo viene ottenuto innanzitutto eseguendo saggi di legame in competizione in fase soluzione con i peptidi di interesse. Nel secondo passaggio, i complessi peptidi-MHC di classe II in equilibrio vengono catturati tramite un anticorpo anti-MHC di classe II immobilizzato su piastre ELISA ad elevata capacità di legame.

Successivamente, i complessi catturati vengono incubati con lo streptavidina marcata con oppio e quindi lo streptavidina non legato viene eliminato con lavaggi; l'oppio catturato viene quindi attivato. Infine, la fluorimetria risolta nel tempo può essere utilizzata per quantificare i livelli di peptide di controllo MHC di classe II catturato. Questo metodo può fornire informazioni preliminari sul potenziale immunogenico delle proteine bersaglio.

È particolarmente utile per convalidare l'output di predittori in silico. Iniziare la procedura aggiungendo 25 microlitri di soluzione di anticorpo L 2 43 appena diluita in ciascuna pozzetta di una piastra ELIZA bianca da 3 84 pozzette con elevata capacità di legame, sigillare la piastra con un film di poliestere e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, partendo da una soluzione madre da 10 millimolare di ciascun campione da testare.

Peptide e DMSO vengono utilizzati per preparare la seguente serie di diluizioni in tampone citrato fosfato, utilizzando 3 piastre polipropilene da 84 pozzetti. Si noti che un'intera piastra polipropilene da 84 pozzetti richiede tre piastre EIA separate, come illustrato. Successivamente, diluire le soluzioni stock selezionate di MHC di classe II fino a una concentrazione di 101 nanomolare nel tampone di reazione, utilizzando un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi diluire il peptide di controllo da 20 micromolare a un rapporto di uno a 100 nel mix master MHC due appena preparato e aggiungere 21,5 microlitri del mix master MHC due con peptide di controllo al controllo positivo. Pozzetto della piastra polipropilenica da 3 84 pozzetti, aggiungere il mix master MHC due contenente il peptide di controllo a ciascuna delle diluizioni del peptide in prova in rapporto uno a uno per creare la reazione di legame anche in questo momento. Infine, sigillare la reazione di legame con un film in poliestere e incubare la piastra per 12-24 ore in un incubatore non controllato per anidride carbonica a 37 gradi Celsius senza agitazione.

Il giorno successivo, diluire i pozzetti della reazione di legame nella piastra 3 84 in rapporto uno a uno con il buffer di neutralizzazione. Quindi lavare la piastra ELISA tre volte con 60 microlitri per pozzetto di PBS 0.05% tra 20 successivi trasferimenti, trasferendo 25 microlitri di ogni soluzione di reazione di legame neutralizzata dalla piastra 3 84 in triplice replicato sulla piastra 3 84 rivestita con anticorpo.

Piastra Eliza, quindi incubare la piastra ELIZA coperta con pellicola di poliestere a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, lavare la piastra ELIZA tre volte come appena dimostrato, quindi aggiungere 25 microlitri di streptavidina diluita di fresco a ciascun pozzetto. Incubare la piastra coperta con pellicola di poliestere al buio a temperatura ambiente per un'ora.

Durante l'incubazione, portare a temperatura ambiente, anch'essa al buio dopo un'ora, 10 millilitri di soluzione di potenziamento per piastra, lavare la piastra ELIZA come mostrato, quindi aggiungere 25 microlitri di soluzione di potenziamento in ogni pozzetto e incubare la piastra coperta con pellicola di poliestere per 10-15 minuti al buio. Infine, leggere la fluorescenza con un lettore fluorimetrico a piastra a fluorescenza risolta nel tempo con impostazioni opium. In questo esperimento rappresentativo, una sequenza peptidica matura di enterobacter Cloe P nine nine beta-lattamasi è stata analizzata per identificare possibili leganti peptidici verso l'allele MHC due.

Con una soglia del 5%, sono stati identificati 117 peptidi non o DRB1*15:01, con un residuo P1 obbligatorio in posizione uno, necessario per il legame con il MHC di classe II. I peptidi con punteggi maggiori o uguali a 2,6 sono probabili leganti. Pertanto, alla soglia del 5%, solo gli 11 peptidi con i punteggi più alti sono predetti legarsi al MHC di classe II DRB1*15:01.

È stato selezionato un pannello rappresentativo di epitopi predetti per l'analisi in questo saggio di legame MHC II. Frammenti peptidici della beta-lattamasi di queste 15 residui sono stati sintetizzati chimicamente in modo che ipotetici epitopi nonameri MHC II fossero inclusi all'interno dei loro frammenti proteici sintetici. La capacità di questi peptidi sintetici di competere con un peptide di controllo biotinilato della proteina basica della mielina B per il legame con MHC II DRB1*15:01 è stata quindi analizzata come appena illustrato.

Le curve di legame competitivo per i peptidi sintetici sono illustrate qui. I valori di IC50 sono stati calcolati adattando i dati trasformati in logaritmo mediante la funzione di adattamento non lineare per legame competitivo ad un solo sito di Prism. Come mostrato nella tabella e nel grafico, i peptidi si suddividono naturalmente in tre gruppi: leganti forti con un IC50 inferiore a un micromolare, leganti moderati con un IC50 maggiore o uguale a un micromolare ma inferiore a 100 micromolari, e leganti deboli con un IC50 maggiore o uguale a 100 micromolari. Dopo il loro sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei campi dell'immunologia molecolare e della progettazione di biofarmaci per esplorare in modo più completo gli eventi chiave del riconoscimento molecolare che sono alla base delle risposte immunitarie anti proteina nei pazienti umani.