Un saggio di legame High Throughput MHC II per l'analisi quantitativa dei peptidi epitopi

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare il legame di peptidi corti con due proteine immunitarie MHC umane utilizzando un saggio su piastra a 3 84 pozzetti ad alto rendimento. Ciò si ottiene eseguendo prima i saggi di legame della competizione nella fase di soluzione con i peptidi di interesse. Nella seconda fase, il peptide equilibrato MHC due complessi viene catturato con un anticorpo anti MHC due immobilizzato su piastre ELIZA ad alto legame.

Successivamente, i complessi catturati vengono incubati con la streptavidina marcata con l'oppio e quindi la streptavidina non legata viene lavata via e l'oppio catturato viene attivato. In definitiva, la fluorimetria risolta nel tempo può essere utilizzata per quantificare i livelli del peptide di controllo catturato MHC two. Questo metodo può fornire informazioni preliminari sul potenziale immunogenico delle proteine bersaglio.

È particolarmente utile per convalidare l'output dei predittori in silico, Inizia la procedura aggiungendo 25 microlitri di soluzione di anticorpi L 2 43 appena diluita a ciascun pozzetto di un 3 84. La piastra ELIZA bianca ad alto legame ha sigillato la piastra con un film di poliestere e l'ha incubata per una notte a quattro gradi Celsius. Iniziando poi con un ceppo da 10 millimolari di ogni test.

Il peptide e il DMSO producono le seguenti serie di diluizione e tampone fosfato citrato utilizzando 3 piastre in polipropilene da 84 pozzetti. Si noti che una piastra completa in polipropilene da 3 84 pozzetti richiede tre piastre EIA separate, come illustrato. Quindi, diluire le due soluzioni madre MHC selezionate a una concentrazione molare di 101 nano in tampone di reazione utilizzando un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi diluire il peptide di controllo da 20 micromolari a un rapporto di uno a 100 nella miscela master MHC two appena preparata e aggiungere 21,5 microlitri della miscela master MHC two con peptide di controllo al controllo positivo. Pozzetto della piastra in polipropilene a 3 84 pozzetti, aggiungere la miscela master MHC two contenente peptide di controllo a ciascuna delle diluizioni peptidiche di prova con un rapporto uno a uno per creare la reazione di legame anche in questo momento. Infine, sigillare la reazione di legame con un film di poliestere e incubare la piastra per 12-24 ore in un incubatore non controllato con anidride carbonica a 37 gradi Celsius senza agitare.

Il giorno successivo, diluire i pozzetti di reazione di legame nel 3 84. Piastra a pozzetti con rapporto uno a uno con tampone di neutralizzazione. Quindi lavare la piastra Eliza tre volte con 60 microlitri per pozzetto di PBS 0,05% tra 20 trasferimenti successivi, 25 microlitri di ciascuna soluzione di reazione di legame neutralizzata dalla piastra da 3 84 pozzetti in triplicato all'anticorpo rivestito 3 84.

Bene, la piastra Eliza incuba la piastra ELIZA ricoperta di pellicola di poliestere a quattro gradi Celsius durante la notte dopo l'incubazione. Lavare la piastra ELIZA tre volte come appena dimostrato, quindi aggiungere a ciascuna 25 microlitri di strep din oppio appena diluito. Incubare bene la piastra coperta con un film di poliestere al buio a temperatura ambiente per un'ora.

Durante l'incubazione, portare 10 millilitri di soluzione di potenziamento per piastra a temperatura ambiente anche al buio dopo un'ora, lavare la piastra ELIZA come dimostrato, quindi aggiungere 25 microlitri di soluzione di potenziamento a ciascun pozzetto e incubare la piastra ricoperta di pellicola di poliestere per 10-15 minuti al buio. Infine leggete la fluorescenza con un lettore di piastre fluorescenti a risoluzione temporale con impostazioni di oppio. In questo esperimento rappresentativo, una sequenza peptidica matura di enterobacter Cloe P nine nine beta-lattamasi è stata analizzata per leganti peptidici putativi all'allele MHC two.

DRB uno, quindici, o centodiciassette non o peptidi sono stati identificati con un residuo di ancoraggio P uno obbligatorio in posizione uno che è richiesto per il legame MHC due solo a una soglia del 5%. I peptidi con punteggi maggiori o uguali a 2,6 sono probabilmente leganti. Pertanto, alla soglia del 5%, si prevede che solo gli 11 peptidi più importanti leghino MHC due DRB 1 15 0 1.

Un pannello rappresentativo di epitopi predetti è stato selezionato per l'analisi in questo saggio di legame MHC two. I frammenti del peptide beta-lattamasi di questi 15 residui sono stati sintetizzati chimicamente in modo tale che i presunti epitopi MHC nonamero due sono stati incorporati all'interno dei loro frammenti proteici sintetici. La capacità di questi peptidi sintetici di competere con un peptide di controllo della proteina B basica della mielina biotinilata per il legame con MHC due DRB 1 15 0 1 è stata quindi analizzata come appena dimostrato.

Le curve di legame competitive per i peptidi sintetici sono illustrate qui. I valori di IC 50 sono stati calcolati adattando i dati di trasformata logaritmica utilizzando la funzione di adattamento non lineare di legame competitivo di un sito del prisma. Come dimostrato nella tabella come si vede nel grafico, i peptidi si sono naturalmente suddivisi in tre gruppi, leganti forti con un IC 50 inferiore a un micromolare, leganti moderati con un IC 50 maggiore o uguale a un micromolare, ma inferiore a 100 micromolari e leganti deboli con un IC 50 maggiore o uguale a 100 micromolari Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia molecolare e della progettazione bioterapeutica per esplorare più a fondo i principali eventi di riconoscimento molecolare che sono alla base delle risposte immunitarie antiproteiche nei pazienti umani.