Name: Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Impara a distinguere fenotipi benigni da maligni nelle cellule mammarie utilizzando un sistema di coltura tridimensionale con Matrigel. Questo metodo permette di analizzare cambiamenti cellulari e molecolari in oncologia.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R01 CA107469, R01 CA125577, e U01CA154224 di CG Kleer, la University of Cancer Support Center del Michigan.

1. Preparazione dei Materiali e cultura dei media <ol><li> Fattore di crescita Thaw ridotta (GFR) Matrigel a 4 ° CO / N. </li><li> Warm up supporti completi per la linea cellulare richiesto a 37 ° C. MCF10A-ATCC specificato media; F-12 medio di HME-Ham supplementato con 5% di siero fetale bovino, 1 mg / ml di idrocortisone, 5 pg / ml di insulina, 10 ng / ml di fattore di crescita epidermico, e 100 ng / ml di tossina del colera; F-12 supporti di SUM149-Ham, completata con il 5% FBS, 2 mg / ml di idrocortisone e 5 mg / ml di insulina; e MDA-MB-231-10% FBS-DMEM </li><li> Preraffreddare uno scivolo camera 8 pozzetti su ghiaccio. </li><li> Preparare cappa coltura tissutale e forniture. </li></ol> 2. Tre Culture dimensionale in 8 pozzetti diapositive Camera <ol><li> Coat ciascun pozzetto della slitta 8 pozzetti con 40 ml di GFR Matrigel. Aggiungere il Matrigel nel centro della diapositiva e poi diffusa utilizzando una punta di pipetta P200. Cercare di diffondere il più uniformemente possibile, evitando le bolle e invadendo che può portare aformazione di menisco. </li><li> Incubare i vetrini a 37 ° C in 5% CO 2. Mentre il Matrigel viene consolidando, trypsinize le cellule, raccogliere e girare a 150 xg nel tessuto della cultura centrifugare per 4 min. </li><li> Contare le cellule e diluire a 12.500 cellule / ml in mezzo completo della rispettiva linea cellulare. Aggiungere GFR Matrigel al 2% e aggiungere 400 microlitri di ciascun pozzetto di una diapositiva camera Matrigel prerivestita. </li><li> Incubare i vetrini in CO 2 incubatore. Dare freschi cambiamenti multimediali completi ogni 4 ° giorno fino a 15 giorni. </li><li> Il trattamento con inibitori farmacologici: Per gli studi inibitori aggiungono piccole molecole inibitrici ai media completo al momento della placcatura seguita da cambiamenti dei media freschi integrati con gli inibitori ogni tre giorni durante la crescita delle cellule di GFR Matrigel. </li><li> Il trattamento con proteina purificata: <ol><li> Piastra le cellule seguenti passaggi 2,1-2,3. Lasciare le culture di crescere per 4 giorni, seguiti da starvati sieroavanti per 16 ore. </li><li> Al giorno 5, trattare le cellule con una concentrazione adeguata di proteine ​​purificate in 0.1% FBS completato media per le cellule affamate di siero. Dare cambiamento fresca media con proteina purificata dopo 2 giorni. </li><li> Al giorno 10, sostituire il supporto condizionata e supporti completi HME. Lasciare le colture a crescere per altri 5 giorni. </li></ol></li><li> Immunofluorescenza delle strutture acinose coltivate su Matrigel: <ol><li> Preparare 2% paraformaldeide, 0,5% Triton X-100 e glicina 100 mM in 1x PBS, pH 7,4. Preparare tampone immunofluorescenza (IF buffer) che comprende 1x PBS contenente 0,1% di albumina di siero bovino, 0,2% Triton X-100, 0,05% Tween-20. </li><li> Utilizzare un puntale P200 per aspirare accuratamente il supporto condizionato. </li><li> Fissare le strutture acinose con 2% paraformaldeide preparata a temperatura ambiente (RT) per 20 min. </li><li> Permeabilize le cellule con 0,5% Triton X-100 per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare la culturas tre volte con glicina 100 mM, 10-15 min per ogni lavaggio. </li><li> Bloccare le cellule con 10% di siero di capra in tampone IF, chiamato blocco primario, per 1 ora a RT. </li><li> Incubare le colture con 20 ug / ml di capra anti F (ab &#39;) 2 frammento nel buffer di blocco primario per 30 min mouse. Questo passaggio è importante per bloccare il mouse specie IgG immunoreattivi in ​​Matrigel. </li><li> Incubare con anticorpo primario nella seconda soluzione di blocco (blocco Primario +20 mcg / ml di capra anti-topo F (ab &#39;) 2 frammento) O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare tre volte con tampone IF per 10-15 minuti ciascuno con dolce dondolio. </li><li> Incubare con fluorescenti anticorpi secondari coniugati nel tampone IF per 45 min. </li><li> Lavare 3x per 10 minuti ciascuno con tampone IF con dolce dondolio. </li><li> Montare i vetrini con il reagente anti-sbiadimento contenente DAPI per visualizzare i nuclei. </li><li> Lasciare i vetrini si asciughino O / N a RT. </li><li> Acquisizione Image: Acquisire le immagini confocale ai mi coloniadsection di cellule cresciute in cima Matrigel. Per ulteriori informazioni acquisire una serie di sezioni ottiche per tutta la lunghezza della struttura acinose da Z impilamento. </li></ol></li></ol> 3. Three Dimensional Cultura in 2-bene Slides Camera per Immunoblotting <ol><li> Preraffreddare 2 ben vetrino camera su ghiaccio. Seguire i passaggi 2,1-2,4 scaling up i reagenti per la camera 2 e scivolo ad esempio il cappotto con 160 ml di Matrigel e aggiungere 1,6 ml di cellula / Matrigel mescolare in ciascun pozzetto della diapositiva 2-bene. </li><li> Raccogliere le strutture acinose dal Matrigel utilizzando il kit di raccolta di cellule coltura 3D disponibili in commercio seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Diluire il lavaggio delle cellule e di raccolta delle cellule buffer a 1x e preraffreddare a 4 ° C. Lavaggio e stacchi di Matrigel devono essere eseguite su ghiaccio. </li><li> Lavare le strutture acinose 3x utilizzando il tampone di lavaggio delle cellule. </li><li> Raccogliere la acini in 15 ml provette per centrifuga con bu raccolta di celluleffer seguita da 30 minuti di incubazione su un agitatore a 4 ° C. Mescolare bene la sospensione con una pipetta 1 ml. Questo romperà il Matrigel in piccoli pezzi e rilasciare la maggior parte delle cellule nel buffer raccolta di cellule. </li><li> Agglomerare le cellule a 200 xg in una centrifuga cultura. Rimuovere lo strato galleggiante idrogel dalle cellule pellet con una pipetta P200. </li><li> Risospendere lisati in tampone campione SDS forniti con il kit. Tampone di lisi RIPA può anche essere usato. </li></ol> 4. Quantificazione dei vs maligna benigna fenotipo seno <ol><li> Crescere cellule in triplicato per ogni set di trattamento seguendo i passaggi 2,1-2,4. </li><li> Prendere immagini a contrasto di fase di strutture acinose da ciascun pozzetto a 5X o 10X risoluzione usando un microscopio a contrasto di fase collegato a un cambio diapositiva e un computer. Prendete le immagini spostando il vetrino da un fotogramma all&#39;altro e quindi copre l&#39;intero bene della diapositiva incamerata. </li><li> Contare il numero totale di strutture acinose,il numero di acini singolo piatto rotondo e il numero di strutture multiacinar casaccio o crescenti strutture prive organizzazione e con processi di ramificazione provenienti da esso. </li><li> Calcolare la percentuale di strutture acinose piatto rotondo singoli vs strutture maligni e la trama come grafico a colonne. Calcolare la significatività con il test t di Student. </li></ol>

<ol><li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma+in+breast+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li>
<li>Rosen, P. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosen%2C+PP+%22Rosen%27s+breast+pathology%22">Rosen's breast pathology</a>. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).</li>
<li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1%2Fp38+pathway%2C+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-%CE%B2+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth%2C+progression%2C+and+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li>
<li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li>
<li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li>
<li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype%2C+gene+expression%2C+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo descritto qui la coltura tridimensionale di cellule epiteliali mammarie su una membrana basale ricostituita e l&#39;utilità di questo sistema di distinguere tra vs maligno benigno fenotipo seno. Questo sistema può essere utilizzato anche per coltura diversi tipi di cellule di altri tessuti ghiandolari ed è stato riportato che sono stati utilizzati con successo per cultura prostata epiteliale, epiteliale bronchiale, e cellule epiteliali tiroidee, per citarne alcuni 12-14. L&#39;importanza della cultura...

Tre coltura tridimensionale (3D) di cellule epiteliali mammarie sulla membrana basale ricostituita è un importante sistema modello per studiare il complesso fenotipo e segnalazione associato di seno normale e cancro al seno 2,3. L&#39;unità funzionale del seno è il terminale condotto unità lobulare (TDLU) che consiste in un piccolo dotto che si dirama in acini. Gli acini sono strutture altamente organizzate, composto da due strati di cellule, cellule epiteliali e mioepiteliali, che sono circondate da una membrana basale 5. Le caratteristiche più distintive di acini normali sono polarizzazione cellulare, attacco alla membrana basale sottostante e comunicazione varie cellule specializzate. Questa organizzazione intricato è interrotto nei carcinomi invasivi. Le culture 2D ampiamente utilizzato, dove le cellule sono coltivate in monostrato, non consentono la formazione di acini. Così, la coltura monostrato manca nel fornire un sistema per catturare l&#39;intricata relazione tra le cellule epitelialiin seno normale e la loro deregolamentazione nel cancro al seno. Culture epiteliali monotipica funzionali delle cellule mammarie sono state sviluppate in diversi laboratori 2,3. Cultura 3D coinvolge la crescita delle cellule del seno su Matrigel, che è un estratto solubilizzato derivato da cellule di topo sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm ed è disponibile in commercio. Altri substrati 3D come il collagene che vengono utilizzati anche. Le cellule del seno possono essere coltivate in 3D da 3D saggio incorporato, in cui le cellule sono coltivate incorporato in Matrigel 2. In alternativa, le cellule possono essere coltivate da 3D sul dosaggio superiore, chiamato anche saggio overlay 3D, che è conveniente in quanto richiede minor volume di Matrigel, e facilita il controllo di lasso di tempo di formazione della colonia mediante imaging a contrasto di fase ed è ideale per l&#39;imaging in situ 2 -3. Il 3D sulla cima saggio è stato usato per definire la correlazione tra il fenotipo acinose e profilo di espressione genica 7. Cultura 3D può essere effectively utilizzato per distinguere le cellule normali e benigne da carcinoma invasivo. Cellule del seno normale e benigni formano la crescita arrestato strutture polarizzate con un lume ben definite nel centro di Matrigel mentre le cellule di carcinoma invasivo crescono prolifico e casaccio, senza compensazione del lume. E6/E7 immortalato cellule epiteliali mammarie umane e linea cellulare MCF10A, che è una linea cellulare spontaneamente immortalato isolato da un paziente di 36 anni con i cambiamenti fibrocistica, sono stati utilizzati con successo per riconquistare il fenotipo benigna del seno in 3D 3,8 e hanno servito come un sistema modello per studiare la funzione di soppressore tumorale oncogenica e di diverse molecole 8,9. Queste cellule benigne può essere progettato per manipolare gene (s) di interesse con l&#39;introduzione di lentivirus / retrovirus. Se il gene (s) di interesse è un soppressore del tumore, l&#39;abbattimento shRNA mediata porterà ad una trasformazione maligna mentre se il gene di interesse è una sovraespressione oncogene in cellule benignedovrebbe mostrare un fenotipo maligno. In entrambi i casi le strutture acinose formate in 3D possono catturare la trasformazione maligna. Benigni singole cellule placcato in 3D iniziano a proliferare e formare rotondo strutture sferiche. Di giorno 5-8 questo aggregato sferico delle cellule sarà differenziarsi in uno strato circostante polarizzata di celle che è in contatto con la Matrigel, e una massa interna di cellule meno polarizzate, che mancano contatto con la Matrigel. Nei prossimi 10-15 giorni le cellule interne inizieranno a morire per apoptosi formando un chiaro lume. Le cellule maligne cresceranno a casaccio perdere la loro polarità. Cellule altamente maligne di solito formano ramificazione delle strutture. Queste differenze nel fenotipo possono essere catturati da tempo di imaging a contrasto di fase, periodo e in situ immunoistochimica con marcatori molecolari rilevanti. I marcatori più comunemente utilizzati sono alfa 6-integrina, un marcatore polarità basale, in combinazione con il marcatore di proliferazione fosfo-istone 3 e il apoptotic marcatore spaccati caspasi-3. Quest&#39;ultimo è importante determinare se vi è formazione di lumen nel centro degli acini, una caratteristica delle cellule normali del seno e benigne. Altri marcatori di polarità e di contatto cellula-cellula comprendono GM130, laminina, ERM, E-caderina. Alternativamente le linee di cellule di cancro al seno può essere progettato per manipolare il gene di interesse. In questo caso reversione ad una maggiore crescita arrestata fenotipo benigno può essere utilizzato come lettura per distinguere dal fenotipo cancro. Cultura 3D può essere utilizzato anche con attenzione a delineare le vie di segnalazione coinvolte nella trasformazione maligna 10-11. Utilizzando il sopra citato le letture, inibitori farmacologici, anticorpi bloccanti o proteine ​​ricombinanti può essere utilizzato da individuare nella segnalazione molecolare che porta alla trasformazione maligna. Con un impegno costante da vari laboratori è possibile estrarre le cellule dal 3D per isolare l&#39;RNA e anche preparare lisati per immunoblotting e immunitànoprecipitation. Queste strategie sono descritte in un graduale e modo dettagliato nel protocollo.

<table><tbody><tr><td>Fattore di crescita ridotto Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td>Evitare il congelamento ripetuto scongelamento</td></tr><tr><td>Vetrini per hamber in vetro Lab-Tek a 8 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177402</td><td>Precool su ghiaccio&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetrini a camera di vetro Lab-Tek a 2 pozzetti&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td>Preraffreddare sul ghiaccio&nbsp;</td></tr><tr><td>Capra anti topo F(ab&acute;)2 frammento</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-006</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Sonde</td><td></td> molecolari<td>coniugate fluorescenti anticorpi Alexa</td> Si <td>prega di consultare il sito web delle sonde molecolari</td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento in oro prolungato con</td><td>sonde molecolari</td> DAPI <td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Cellula di coltura 3D Kit di raccolta</td><td>Trevigen</td><td>3448-020-k</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Apha-6-integrin</td><td>Fisher Scientific MAB1378</td><td></td><td>Diluizione 1:100 per IF</td></tr><tr><td>Anti-GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610822</td><td>diluizione 1:100 per IF</td></tr><tr><td>Anti-fosfo-istone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-222</td><td>Diluizione 1:100 per IF</td></tr><tr><td>Anti-Cleaved caspasi 3 (Asp 175)</td><td>Cell Segnalazione</td><td>9661s</td><td>Diluizione 1:50 per IF</td></tr><tr><td>Anti-E-caderina</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Diluizione 1:200 per IF</td></tr></tbody></table>

tre culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Carcinomi mammari invasivi sono un gruppo di tumori epiteliali maligni caratterizzato dall&#39;invasione dei tessuti adiacenti e la propensione a metastatizzare. L&#39;interazione dei segnali tra le cellule tumorali e il loro microambiente esercita una forte influenza sulla crescita del cancro al seno e comportamento biologico 1. Tuttavia, la maggior parte di questi segnali dalla matrice extracellulare sono persi o loro rilevanza è understudied quando le cellule vengono coltivate in coltura due dimensioni (2D) come un monostrato. Negli ultimi anni, tridimensionale coltura su una membrana basale ricostituita (3D) è emerso come un metodo di scelta per ricapitolare dell&#39;architettura tissutale di cellule mammarie benigne e maligne. Le cellule coltivate in 3D conservano gli spunti importanti della matrice extracellulare e forniscono un fisiologicamente rilevanti ex vivo di sistema 2,3. Di nota, vi è una crescente evidenza che suggerisce che le cellule si comportano diversamente quando coltivate in 3D rispetto al 2D 4. Cultura 3Dpuò essere usato efficacemente come mezzo per differenziare il fenotipo maligno dal fenotipo seno benigna e per consolidare la segnalazione cellulare e molecolare coinvolto 3. Una delle caratteristiche distintive di cellule epiteliali benigne è che essi sono polarizzati in modo che il citoplasma apicale è verso il lume e il citoplasma basale poggia sulla membrana basale. Questa polarità apico-basale si perde in carcinomi mammari invasivi, che sono caratterizzate da disorganizzazione e la formazione di anastomosi e la ramificazione tubuli che si infiltra a casaccio lo stroma circostante cellulare. Queste differenze istopatologici tra ghiandola benigna e il carcinoma invasivo possono essere riprodotti in 3D 6,7. Utilizzando le opportune read-out come il quantificazione di singole strutture acinose rotonde, o differenziale espressione di marcatori molecolari validati per la proliferazione cellulare, la polarità e l&#39;apoptosi in combinazione con altre tecniche di biologia molecolare e cellulare, cultur 3De in grado di fornire uno strumento importante per comprendere meglio i cambiamenti cellulari durante la trasformazione maligna e per delineare la segnalazione responsabile.

Cultura 3D può essere efficacemente utilizzata per differenziare fenotipo maligno delle cellule epiteliali mammarie umane dal seno benigno. Singole cellule benigne placcato in Matrigel crescere come strutture sferiche organizzate che possono essere facilmente imaged singola acini piatto rotondo in un piano utilizzando l&#39;imaging a contrasto di fase. Le singole cellule maligne piastrate su Matrigel crescono a casaccio, mostrano molto alto indice di rifrazione e sono difficili da immagine in un piano. Come mostrato in ...

Tre coltura tridimensionale di cellule epiteliali mammarie su una membrana basale ricostituita è un metodo utile ricordare l&#39;architettura in vivo del seno benigno, e per differenziare il fenotipo maligno dal fenotipo seno benigno. È importante sottolineare che questo sistema può essere applicato a studiare carcinomi invasivi in ​​altri tessuti.

Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare il sistema di coltura tridimensionale come mezzo per distinguere il fenotipo benigno del tessuto mammario da quello maligno. Questo viene ottenuto piantando inizialmente le cellule di controllo e quelle sperimentali in triplicato su uno strato di matrigel con fattori di crescita ridotti, in una camera da otto pozzetti. Il secondo passaggio consiste nel sostituire ogni quattro giorni il mezzo completo con mezzo fresco contenente matrigel al 2%, permettendo così alle colonie di tipo acinare di crescere per un periodo compreso tra 10 e 15 giorni.Successivamente, vengono acquisite le immagini a contrasto di fase delle colonie simili ad aser coltivate in 3D con una risoluzione di cinque x. L'ultimo passaggio consiste nell'elaborare le colture simili ad aser per l'analisi immunoistochimica con marcatori molecolari specifici, seguito dall'acquisizione di immagini confocali di colonie simili ad aser immuno marcate in C due nella sezione mediana. In definitiva, le immagini a contrasto di fase e confocali delle cellule coltivate in coltura 3D vengono utilizzate per identificare cambiamenti fenotipici e molecolari cellulari e quindi differenziare le cellule mammarie benigne da quelle maligne.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le colture bidimensionali o i saggi di invasione e migrazione, è la capacità di riprodurre l'architettura tissutale della mammella benigna e la sua perdita di organizzazione durante la trasformazione maligna. Pertanto, questa tecnica può essere utilizzata efficacemente per differenziare le cellule mammarie benigne da quelle maligne. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del cancro al seno, come i difetti delle vie di segnalazione sul fenotipo cellulare e l'identificazione di nuove vie oncogeniche e/o di soppressori tumorali.Per iniziare l'esperimento, scongelare l'Matrigel con fattori di crescita ridotti (GFR) a quattro gradi Celsius durante la notte. Successivamente, riscaldare il mezzo HME completo a 37 gradi Celsius e posizionare una slide con otto camere su ghiaccio per raffreddarla. Aggiungere 40 microlitri di Matrigel GFR al centro di ogni pozzetto della slide pre-raffreddata.Stendere il gel in modo il più uniforme possibile utilizzando la punta di una pipetta P200, evitando bolle e un'eccessiva diffusione, che potrebbe portare alla formazione di un menisco. Successivamente, solidificare il matri gel incubando il vetrino a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Mentre il matri gel si sta solidificando, trattare con tripsina le colture cellulari, le cellule HME, quindi raccoglierle in un tubo da 15 millilitri e centrifugare le cellule a 150 ×g per quattro minuti, contare le cellule e diluirle a 12.500 cellule per millilitro. In mezzo completo, aggiungere matri gel privo di fattori di crescita alla sospensione cellulare a una concentrazione finale del 2% e aggiungere 400 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto del vetrino con camera pre-codificata.Quindi posizionare il vetrino in un incubatore tamponato con CO2. Sostituire il mezzo con mezzo completo fresco ogni quattro giorni per 15 giorni. Per gli studi con inibitori, aggiungere inibitori di piccole molecole al mezzo completo al momento della semina, seguiti da cambi di mezzo fresco integrati con gli inibitori ogni tre giorni, per avviare la crescita delle cellule e triplicati per ogni serie di trattamenti.Acquisire immagini in contrasto di fase delle strutture di aser da ogni pozzetto a una risoluzione di cinque x utilizzando un microscopio in contrasto di fase collegato a un dispositivo di spostamento del vetrino e a un computer. Acquisire le immagini spostando il vetrino da un campo all'altro, coprendo l'intero pozzetto del vetrino a camere. Contare il numero totale di strutture di aser, il numero di asinine singole rotonde e piatte e il numero di strutture multi-aser o di strutture in crescita disordinata prive di organizzazione.E, con processi di ramificazione emananti, calcolare la percentuale di strutture asferiche appiattite a singolo ciclo rispetto alle strutture maligne e riportare i dati in un grafico a colonne. Calcolare la significatività mediante il test T di Student non appaiato a due code.Preparare i reagenti per la colorazione immunofluorescente come descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, utilizzare una pipetta P200 per aspirare con attenzione il mezzo condizionato. Quindi fissare l'ASIN o le strutture con paraformaldeide al 2% appena preparata a temperatura ambiente per 20 minuti; dopo la fissazione, permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,5% per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi lavare le colture tre volte con glicina 100 millimolare per 10-15 minuti per ogni lavaggio. Successivamente, bloccare le cellule nel buffer di blocco primario per un'ora a temperatura ambiente. Poi incubare le colture in 20 microgrammi per millilitro di frammento Fab2 di anticorpo caprino anti topo nel buffer di blocco primario, chiamato anche soluzione di secondo blocco, per 30 minuti al fine di bloccare le specie di IgG murine reattive verso i gruppi amminici nel matrigel.Dopo il blocco, incubare le cellule con l'anticorpo primario nella seconda soluzione di blocco durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule tre volte con tampone per immunofluorescenza o tampone I, agitando delicatamente per 10-15 minuti per ogni lavaggio. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi secondari marcati con fluorocromo nel tampone if F per 45 minuti.Successivamente, lavare le cellule tre volte per 10 minuti ciascuna con tampone if F e agitazione delicata. Montare i vetrini con DPI contenente un reagente anti-sfalsamento per visualizzare i nuclei. Lasciare asciugare i vetrini tutta la notte a temperatura ambiente.Quindi acquisire immagini confocali nella sezione mediana delle colonie di cellule in crescita sulla superficie del matrigel e una serie di sezioni ottiche lungo tutta la lunghezza della struttura asner, mediante z-stacking di immagini confocali di cellule HME controllo e con silenziamento di C CN sei, colorate con DPI. Le immagini del giorno 5 mostrano che le cellule con silenziamento mancano di organizzazione. Al giorno 15, le cellule controllo entrano in arresto della crescita, sviluppando strutture ASIN differenziate e un lume ben definito, a differenza delle cellule con silenziamento, che presentano un fenotipo invasivo con ramificazioni e strutture tubulari. La colorazione immunofluorescente mostra la perdita di espressione di laminina v, integrina alfa sei e ECA herrin, indicando rispettivamente la rottura della membrana basale, la perdita della polarità basale e il contatto tra cellule.In cellule maligne, le cellule di controllo mostrano uno strato integro intorno all'espressione basale asinina di alfa sei integrina e all'espressione apicale di GM uno 30 e eca. Qui, alle giunzioni intercellulari, il fenotipo maligno delle cellule HME con silenziamento di CCN sei è stato invertito mediante trattamento esogeno con proteina umana ricombinante purificata CCN sei. Due linee cellulari di carcinoma mammario altamente metastatiche, MCF 1 49 e M-D-A-M-B 2 31, sono state trattate con inibitori della chinasi p38 MAP, SB 2 0 3 8 50 e SB 2 0 2 1 90, che hanno ridotto il comportamento maligno.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare cellule mammarie in coltura 3D e di come utilizzare efficacemente la crescita in forma di sferoidi su matrigel come indicatore per differenziare i fenotipi cellulari mammari benigni da quelli maligni.

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