Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare il sistema di coltura tridimensionale come mezzo per distinguere il fenotipo benigno della mammella dal fenotipo maligno della mammella. Ciò si ottiene placcando prima le cellule di controllo e sperimentali in triplicati su uno strato di matrigel ridotto dal fattore di crescita in un vetrino a otto pozzetti. Il secondo passo consiste nel fornire nuovi cambi di terreno completi con Matrigel GFR al 2% ogni quattro giorni, consentendo alle colonie simili all'asinina di crescere per 10-15 giorni.

Successivamente, le immagini a contrasto di fase delle colonie simili agli aser cresciute in 3D vengono acquisite con una risoluzione di cinque x. La fase finale consiste nell'elaborare le colture aser like per l'analisi immunocitochimica con marcatori molecolari pertinenti, seguita dall'acquisizione di immagini confocali di colonie aser like in C two immuno stain nella sezione centrale. In definitiva, il contrasto di fase e le immagini confocali delle cellule coltivate in coltura 3D vengono utilizzate per identificare i cambiamenti fenotipici e molecolari cellulari e quindi differenziare le cellule mammarie benigne dalle cellule maligne.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le colture bidimensionali, i saggi di invasione o migrazione, è che può ricapitolare l'architettura tissutale della mammella benigna e la sua perdita di organizzazione durante la trasformazione maligna. Pertanto, questa tecnica può essere efficacemente utilizzata per differenziare le cellule mammarie benigne dalle cellule mammarie maligne. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro al seno, come il difetto delle vie di segnalazione sul fenotipo cellulare e nell'identificazione di nuove vie oncogeniche e/o oncosoppressori.

Per iniziare l'esperimento, scongelare il fattore di crescita ridotto o GFR matrigel a quattro gradi Celsius durante la notte. Quindi, riscaldare il terreno HME completo a 37 gradi Celsius e posizionare un vetrino a otto pozzetti sul ghiaccio per raffreddarlo. Aggiungere 40 microlitri di GFR Matrigel al centro di ciascun pozzetto del vetrino preraffreddato.

Stendere il gel il più uniformemente possibile utilizzando un puntale per pipetta P 200, evitando bolle e una diffusione eccessiva, che possono portare alla formazione del menisco. Quindi solidificare il gel matri incubando il vetrino a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 mentre il gel matri solidifica gli occhi della tripsina, le cellule HME, quindi raccoglierle in un tubo da 15 millilitri e far girare le cellule a 150 volte la gravità per quattro minuti, contare le cellule e diluirle a 12.500 cellule per millilitro. In terreni completi, aggiungere GFR matrigel alla sospensione cellulare a una concentrazione finale del 2% e aggiungere 400 microlitri della soluzione a ciascun pozzetto del vetrino della camera precodificata.

Quindi posizionare il vetrino in un'incubatrice tamponata con CO2. Sostituire il supporto con un nuovo supporto completo ogni quattro giorni per 15 giorni. Per gli studi sugli inibitori, aggiungere inibitori di piccole molecole al terreno completo al momento della piastra, seguiti da nuovi cambi di terreno integrati con gli inibitori ogni tre giorni per iniziare la crescita delle cellule e dei triplicati per ogni set di trattamento.

Acquisisci immagini a contrasto di fase delle strutture aser da ciascun pozzetto con una risoluzione cinque volte superiore utilizzando un microscopio a contrasto di fase collegato a uno spostatore di vetrini e a un computer. Scatta le immagini spostando il vetrino da un fotogramma all'altro, coprendo l'intero pozzetto del vetrino a camera. Conta il numero totale di strutture aser, il numero di aser singoli aser piatti e il numero di strutture multi aser o strutture a crescita casuale prive di organizzazione.

E con i processi di ramificazione emananti, calcola la percentuale di strutture aser piatte rotonde singole rispetto a strutture maligne e traccia le informazioni. Come grafico a colonne. Calcola la significatività con il test T dello studente non accoppiato a due code.

Preparare i reagenti per la colorazione in immunofluorescenza come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, utilizzare una pipetta P 200 per aspirare con cura il fluido condizionato. Quindi fissare l'ASIN o le strutture con il 2% di para formaldeide appena preparato a temperatura ambiente per 20 minuti dopo il fissaggio, permeasare le cellule con tritton X 100 allo 0,5% per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi lavare le colture tre volte con 100 millimetri di glicina per 10-15 minuti per ogni lavaggio. Quindi, bloccare le celle nel tampone a blocchi primario per un'ora a temperatura ambiente. Quindi incubare le colture in 20 microgrammi per millilitro di capra anti topo fab due frammento in tampone di blocco primario, chiamato anche seconda soluzione bloccante per 30 minuti per bloccare la specie IgG di topo amminica reagire nel matrigel.

Dopo il blocco, incubare le cellule con l'anticorpo primario nella seconda soluzione bloccante per una notte a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule tre volte con tampone di immunofluorescenza o tampone con un leggero dondolio per 10-15 minuti per ogni lavaggio. Quindi incubare le cellule con anticorpi secondari coniugati fluorescenti in tampone if F per 45 minuti.

Quindi, lavare le celle tre volte per 10 minuti ciascuna con tampone if F e dondolando delicatamente. Montare i vetrini con DPI contenente reagente anti dissolvenza per visualizzare i nuclei. Lasciare asciugare i vetrini per una notte a temperatura ambiente.

Quindi acquisire immagini confocali nella sezione centrale della colonia di cellule che crescono sopra il matrigel e una serie di sezioni ottiche su tutta la lunghezza della struttura di Asner impilando z le immagini confocali di DPI colorate con HME controllate e C CN sei cellule knockdown il quinto giorno mostrano che le cellule knockdown mancano di organizzazione. Il giorno 15, le cellule di controllo vengono arrestate dalla crescita con ASIN o strutture differenziate e lume ben definito divergente dalle cellule knockdown, che presentano un fenotipo ramificato e tubulare invasivo. La colorazione immunofluorescente mostra la perdita di espressione della laminina v alfa sei integrina e dell'ECA herrina, indicando rispettivamente la rottura della membrana basale, la perdita della polarità basale e il contatto cellulare con le cellule.

Nelle cellule maligne, le cellule di controllo mostrano uno strato intatto attorno all'espressione basale asinina dell'alfa sei integrina espressione apicale di GM one 30 e eca. Qui alla giunzione cellulare, il fenotipo maligno delle cellule HME knockdown CCN six è stato invertito con il trattamento esogeno di linee cellulari mammarie ricombinanti CCN 6 proteine due altamente metastatiche, alcune 1 49 e M-D-A-M-B 2 31. Sono stati trattati con inibitori della map chinasi P 38, SB 2 0 3 8 50 e SB 2 0 2 1 90, che hanno ridotto il comportamento maligno.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come far crescere le cellule mammarie in coltura 3D e utilizzare efficacemente la crescita simile al sino su matrigel come lettura per differenziare i fenotipi benigni da quelli maligni delle cellule mammarie.