Neonatale Pial elettroporazione Surface

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di etichettare e manipolare geneticamente i progenitori neurali della superficie della buccia. Ciò si ottiene inserendo prima una pipetta di vetro riempita con una soluzione di DNA al plasma nella regione della superficie della buccia. Il secondo passo consiste nell'iniettare il DNA nello spazio meningeo, sovrastante la superficie della buccia.

Successivamente, gli elettrodi sono orientati in modo da erogare in modo appropriato corrente alla superficie di pelatura. Il passo finale è che il DNA viene elettroporicato nei progenitori della superficie della buccia mediante l'applicazione di corrente. In definitiva, questo metodo può essere combinato con altre tecniche per mostrare la storia naturale e i determinanti molecolari della superficie della buccia, della proliferazione dei progenitori neurali, della migrazione e/o della differenziazione.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasduzione virale, sono che l'elettroporazione è più sicura, più flessibile e non richiede la creazione di particelle virali o imballaggi. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali neurali e progenitrici, come ad esempio qual è il contributo di questi progenitori della superficie della buccia ai tessuti, all'istogenesi e alla funzione del circuito neurale. Per iniziare, utilizzare un estrattore per pipette per formare pipette da tubi capillari di vetro, una volta tirata, tagliare la punta con forbici affilate.

Successivamente, preparare una soluzione madre verde veloce all'1% utilizzando acqua filtrata priva di nucleasi. Dopo aver diluito il tampone EDTA di interesse DNA libero da endotossine, combinarlo nelle proporzioni appropriate alla soluzione verde veloce all'1%. Utilizzando una pipetta standard, posizionare la quantità desiderata di miscela plasmidica da iniettare su un pezzo di pellicola di cera di paraffina come riferimento.

Successivamente, utilizzando un micro iniettore, inserire con cautela la pipetta di vetro assemblata nella provetta contenente la miscela plasmidica. Evitare di toccare la punta con i bordi del tubo per evitare rotture. Aspirare la soluzione nella pipetta riportando lentamente la manopola di trasferimento.

Una volta caricato un volume sufficiente, premere in avanti fino a quando la pressione non ritorna alla posizione neutra di zero. Hector Pascals. Quindi, posizionare la punta accanto all'iniezione di riferimento e utilizzare il pedale del micro iniettore per espellere un volume.

Regolare la pressione fino a quando la quantità non è uguale al volume di riferimento precedentemente pipettizzato. Dopo aver calibrato il volume di iniezione, recuperare gli animali per l'iniezione di plasmidi. Una volta confermata la profondità dell'anestesia, tenere il cucciolo usando il pollice e l'indice della mano meno dominante.

Usa la mano dominante per mirare alla regione desiderata, gli emisferi corticali e altre strutture superficiali come i collicoli superiori dovrebbero essere facilmente visibili. Una volta identificata la posizione corretta, inserire la pipetta oltre la pelle e il cranio. Facendo attenzione ad evitare le arterie cerebrali.

Per colpire la superficie della buccia interrompere immediatamente l'avanzamento della pipetta Non appena il cranio è stato penetrato con la punta della pipetta nella posizione corretta, iniettare la soluzione plasmidica utilizzando il pedale del micro iniettore Dopo l'iniezione, rimuovere con cautela la pipetta. Evitare che la punta si secchi e si ostruisca tra un'iniezione e l'altra inserendola nelle goccioline di prova situate sul film di paraffina. Ripetere questi passaggi fino a quando tutti i cuccioli non vengono iniettati per aumentare la conduttanza e prevenire la bruciatura della pelle.

Coprire le pinzette al platino da tre millimetri con gel per elettroporazione. Quindi, regola le impostazioni elettroelettriche per le iniezioni nella corteccia. Posizionare la sonda caricata negativamente sull'area iniettata e la sonda caricata positivamente attorno alla regione controlaterale sotto l'occhio.

L'orientamento dell'elettrodo deve essere compreso tra 45 e 60 gradi rispetto alla linea mediana. Utilizzare il pedale per attivare la corrente e tenere in posizione le pinzette TRO per tre o cinque impulsi. A seconda dell'età e del peso del cucciolo, gli impulsi dovrebbero indirizzare il DNA nelle cellule della superficie della buccia sottostanti.

Il polo negativo può essere spostato sopra l'area di iniezione. Tra un impulso e l'altro o è possibile utilizzare un elettrodo più grande per aumentare l'area elettroelettrica subito dopo l'elettroporazione, pulire accuratamente il gel dai cuccioli e posizionarli sotto una lampada riscaldante per circa cinque minuti. I cuccioli perderanno acutamente il loro mignolo rossastro naturale nei minuti successivi all'elettroporazione a causa della cianosi.

Osservare i cuccioli per il recupero del colore naturale e l'inizio del normale movimento prima di rimetterli nelle loro gabbie o iniezioni nel colon superiore. Individua la regione target appena dietro e lateralmente a Lambda e all'incirca sulla linea mediana, seguendo gli stessi passaggi appena dimostrati. Con iniezioni riuscite, la miscela plasmidica riempie naturalmente i contorni del colus superiore.

Quando l'elettroutensile funziona dopo iniezioni di colus superiore, posizionare la sonda caricata negativamente dell'elettrodo sull'area iniettata e la sonda caricata positivamente intorno all'occhio, al muso o al mento. In questo caso, l'orientamento dell'elettrodo è a un angolo compreso tra 25 e 40 gradi rispetto alla linea mediana. Questa immagine mostra la corteccia laterale dorsale dopo l'elettroporazione di plasmidi reporter fluorescenti che esprimono il trifoglio marcato con membrana in verde e il tag bfp.

Due proteine nucleari mostrate qui in rosso pseudocolore. Estesi dendriti si trovano in questo interneurone corticale circa due mesi dopo l'elettroporazione. Le cellule EGFP positive sono BRDU positive, indicando che stavano proliferando durante la procedura di elettroporazione.

Quando si tenta questa tecnica, è importante concentrarsi sul corretto targeting della superficie della buccia al fine di evitare l'interruzione della corteccia sottostante e/o del sistema vascolare.