Ricostruzione di 3-Dimensional Volume Istologia e la sua applicazione per studiare mouse ghiandole mammarie

L'obiettivo generale del seguente video è presentare un approccio di registrazione delle immagini per l'istologia tridimensionale e la ricostruzione volumetrica allo studio delle modifiche nella macrostruttura cellulare della mammella. A tale scopo, le ghiandole mammarie vengono asportate da topi tre giorni dopo l'inizio della lattazione, sia di tipo selvatico sia privi del fattore di crescita simile all'insulina binding protein sette, topi null per IGF BP sette. Le ghiandole vengono quindi processate e incluse in blocchi di paraffina per la sezionatura.

Successivamente vengono acquisite immagini ottiche della superficie del blocco di tessuto e il blocco viene sezionato. Vengono catturate immagini dei sezioni e, mediante un software personalizzato, ciascun sezione viene allineata all'immagine corrispondente della superficie del blocco per ricostruire il volume istologico della ghiandola mammaria. I dati ottenuti evidenziano le differenze di dimensione tra ghiandole mutanti e di tipo selvatico.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia confocale tridimensionale a doppio passaggio, è che fornisce informazioni su un'estensione spaziale molto maggiore. Questo metodo può inoltre essere utilizzato per indagare e validare nuove tecniche e algoritmi nell'imaging medico volumetrico e nelle terapie, oltre a consentire l'analisi tridimensionale ad alta risoluzione di diversi organi. Il volume di istologia ricostruito rappresenta una rappresentazione affidabile del campione in esame, senza errori di registrazione propagati.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo notato che i topi nulli per IGF P seven hanno dimensioni di nidiata più ridotte e non sono in grado di sostenere più nidiate di grandi dimensioni, quindi abbiamo deciso di analizzare la struttura delle loro ghiandole mammarie. Una volta che il tessuto è stato incluso in paraffina, utilizzare un microtomo rotatorio per sagomare il blocco fino alla rimozione dell'eccesso di paraffina. Successivamente, utilizzando una fresatrice verticale, praticare fori di un millimetro in almeno due angoli del blocco di paraffina perpendicolarmente alla cassetta, quindi montare il blocco di tessuto sul microtomo rotatorio.

Successivamente, per configurare il sistema di imaging della superficie del blocco davanti al microtomo, posizionare una fotocamera con un obiettivo tele a un leggero angolo rispetto alla superficie del blocco di tessuto. La fotocamera deve essere collegata a un computer posizionato davanti al microtomo. Quindi, posizionare una sorgente luminosa davanti al blocco in modo che la fotocamera catturi il riflesso della luce proveniente dal blocco.

Regolare l'angolazione della telecamera finché il tessuto sulla superficie del blocco non risulti facilmente distinguibile dalla paraffina circostante. Acquisire un'immagine ottica della superficie del blocco. Successivamente, utilizzando il microtomo, tagliare nastri di quattro sezioni, spesse cinque micron.

Trasferire i nastri in un bagno di acqua fredda, separare le sezioni del nastro, quindi prelevare la seconda e la quarta sezione dall'acqua fredda e posizionarle su un vetrino. Trasferirle in un bagno di acqua calda per rimuovere le grinze. La scelta della seconda e della quarta sezione garantisce un intervallo di cinque micron tra le sezioni.

Dopo averli stirati, riposizionare le sezioni sui vetrini microscopici prelevandoli con una spatola. Come in precedenza, si noti che il taglio, il montaggio e la stiratura delle sezioni possono causare alcune distorsioni, come strappi, pieghe, restringimenti ed espansioni. Questi artefatti complicano la registrazione delle sezioni istologiche.

Colorare i preparati con ematossilina ed eosina (h e d) utilizzando uno strainer automatico. Quindi coprire i vetrini con un coprioggetti automatico e digitalizzare i vetrini mediante uno scanner digitale di istologia a una risoluzione di interesse. Per questo protocollo, l'ingrandimento è 20 x e la risoluzione è 0,47 micrometri.

Questa sezione del video fornisce una panoramica del processo di registrazione delle immagini, che viene eseguito utilizzando un software personalizzato sviluppato nel nostro laboratorio in combinazione con MATLAB c plus plus. Utilizzando ITK, iniziare sottocampionando le immagini di istologia fino alla risoluzione delle immagini della superficie del blocco. Questo ridurrà le immagini di istologia di un fattore di 0,026.

Successivamente, per la segmentazione delle immagini e la selezione dei punti, aprire alcune immagini della superficie del blocco in MATLAB e utilizzare lo strumento di selezione dati per misurare i valori dei pixel dei fori di registrazione. Utilizzare il valore medio dei pixel come soglia fissa per segmentare i fori di registrazione. Per rimuovere i segmenti aggiuntivi, utilizzare la circolarità e l'area degli oggetti segmentati per mantenere i fori ed eliminare i segmenti extra.

Successivamente, per ciascuna ghiandola mammaria, selezionare un'immagine della superficie del blocco come riferimento. Allineare i centri dei fori di registrazione delle restanti immagini della superficie del blocco ai centri dei fori di registrazione dell'immagine di riferimento. Quindi, utilizzando le trasformazioni ottenute per i fori di registrazione, allineare manualmente le immagini della superficie del blocco; per le immagini allineate, delimitare o estrarre il tessuto dallo sfondo per le sezioni h e d.

Utilizzare la tecnica di sogliatura OSU per segmentare le immagini dallo sfondo e creare maschere binarie delle immagini di istologia. Successivamente, utilizzando l'istogramma degli oggetti etichettati, identificare e selezionare l'oggetto di dimensione maggiore in ciascuna maschera. Estrarre i punti del contorno larghi un pixel sia dalle maschere di istologia che da quelle della superficie del blocco.

Successivamente, utilizzare un algoritmo basato sui descrittori di Fourier per trovare la trasformazione rigida iniziale tra i punti del contorno delle immagini istologiche e le corrispondenti immagini della superficie del blocco. Questa trasformazione iniziale comprende i fattori di traslazione, rotazione e scala. Trasformare ogni immagine istologica mediante la trasformazione iniziale ottenuta nel passaggio precedente.

Per affinare la registrazione rigida, rimuovere le sezioni dei bordi ad alta curvatura dal contorno istologico utilizzando un filtro di tipo "rolling ball". Successivamente, selezionare casualmente 500 punti distribuiti uniformemente tra i punti rimanenti del contorno istologico. Trasformare i punti del contorno istologico mediante la trasformazione iniziale ottenuta dai descrittori di Fourier.

Utilizzare i punti del contorno della sezione e l'algoritmo dei punti più vicini iterativi per trovare la trasformazione rigida tra i punti del contorno della sezione e l'istologia. Punti del contorno casuali. Quindi trasformare le immagini istologiche ottenute dal passaggio precedente per creare un'immagine visiva del volume istologico nel software di visualizzazione 3D.

Nel laboratorio Me vis, scegliere i moduli, selezionare varie opzioni e aggiungere il modulo per la composizione 3D da file 2D. Quindi scegliere immagine dal menu e aggiungere il modulo di conversione delle proprietà dell'immagine. Infine, aggiungere un modulo di visualizzazione 3D dai moduli per visualizzatori 3D.

Fare doppio clic su componi 3D da file 2D per caricare le immagini e fare clic su crea 3D. Regolare la dimensione del voxel facendo doppio clic su conversione proprietà immagine e impostare la dimensione del voxel a 0.018 0.018 0.01. Visualizzare il volume facendo doppio clic su visualizza 3D.

Infine, visualizzare la serie di immagini a un ingrandimento di cinque volte seguendo i passaggi descritti nel documento allegato. Per caratterizzare meglio la carenza del topo nullo per I-G-F-B-P sette, è stata eseguita la ricostruzione tridimensionale delle ghiandole mammarie come descritto in questo documento. Queste figure mostrano i volumi di istologia ricostruiti delle ghiandole mammarie di tipo selvatico e nulle.

Si noti che la ghiandola mutante a destra è più corta e più stretta rispetto al tipo selvatico a sinistra, ma ha una profondità pressoché identica: 1,06 millimetri per la ghiandola di tipo selvatico e 1,02 millimetri per la ghiandola nulla. Inoltre, si osservi che le ghiandole di tipo selvatico a sinistra presentano poco tessuto stromale, indicato dalla colorazione rosa dell'eosina, mentre le ghiandole nulle a destra appaiono prevalentemente costituite da tessuto stromale. Qui, la colorazione con ematossilina, che identifica le cellule nucleate, mostra che la ghiandola nulla mantiene la sua densità, mentre la ghiandola di tipo selvatico sembra contenere principalmente strutture ghiandolari.

Per indagare ulteriormente, qui sono state allineate immagini ad alta risoluzione dell'area del linfonodo. Si osservano grandi strutture che sarebbero state riempite di latte. Al contrario, la ghiandola priva di I-G-F-B-P sette presenta poche strutture ben sviluppate.

Inoltre, queste strutture sono affollate da cellule simili a fibroblasti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una ricostruzione tridimensionale di un organo attraverso il ripristino di sezioni seriali di scansioni. Bene. Ora, nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di assegnare nomi coerenti ai vetrini e alle scansioni, poiché il loro numero sarà elevato, e l'organizzazione sequenziale è la chiave del successo nell'applicazione di questa procedura.

Altri metodi, come l'immunohistochemia per marcatori specifici di cellule e malattie, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: come la vascolarizzazione penetra in un tumore?