Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di monitorare l'interazione di due proteine espresse in foglie di tabacco intatte. Ciò si ottiene progettando costrutti appropriati, fondendo i due geni di interesse per scindere le proteine fluorescenti e trasformando questi costrutti in agrobatteri. In una seconda fase, le colture di agrobatteri vengono mescolate e iniettate nelle foglie di tabacco, il che porta all'espressione delle proteine e a un segnale fluorescente ricostituito.

Se le proteine si avvicinano molto spesso, quindi, vengono analizzate al microscopio foglie intere o protoplasti isolati. Si ottengono risultati che mostrano interazioni proteina-proteina in base al segnale fluorescente emesso rilevato dalla microscopia a fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunoprecipitazione del cuore o il lievito all'ibrido è che l'interazione proteina-proteina può essere monitorata direttamente nella cellula vegetale vivente.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia vegetale, come la formazione di complessi proteici in vari compartimenti cellulari. Per iniziare questa procedura, coltivare gli agrobatteri da utilizzare per la trasformazione delle foglie di tabacco. Inoculare 10 millilitri di terreno LB contenente gli antibiotici appropriati con 50 microlitri di coltura madre di glicerolo AG L one contenente il plasmide di interesse in una provetta sterile da 50 millilitri.

Incubare a 28 gradi Celsius per almeno 24 ore, agitando a 190 RPM fino a quando la coltura raggiunge un OD 600 compreso tra 1,0 e 2,0 il giorno successivo. Centrifugare i batteri a 3000 volte G per 15 minuti. Dopo aver scartato il surnatante resus, sospendere il pellet in un mezzo di infiltrazione appena prodotto e regolare la sospensione su un OD 600 di 1,0.

Incubare le cellule di agrobatteri in uno shaker a soffitto per due ore al buio a temperatura ambiente per l'infiltrazione delle foglie di tabacco. Scegli diverse foglie più vecchie di una pianta di tabacco di tre settimane. Mescolare volumi uguali.

Tre millilitri ciascuno degli agrobatteri che trasportano i costrutti di interesse. Riempi una siringa da cinque millilitri senza ago con la miscela di sospensione cellulare per infiltrare la sospensione cellulare nelle foglie di tabacco. Premere con cura la siringa sul lato inferiore delle foglie in più punti, innaffiare le piante e lasciarle coperte e protette dalla luce per due giorni.

Per isolare i protoplasti da una foglia infiltrata, per prima cosa, posizionare la foglia in una capsula di Petri e aggiungere una soluzione enzimatica appena preparata. Usando una nuova lama di rasoio, taglia la foglia in pezzi di circa 0,5 centimetri quadrati. Quindi, trasferisci i pezzi di foglia con la soluzione enzimatica nel vuoto.

Pallone di infiltrazione. Aspirare l'infiltrato per circa 20 secondi fino a quando non fuoriescono bolle d'aria dalle foglie. Rilasciare l'aspirapolvere con molta attenzione.

Agitare il pallone per 90 minuti a 40 giri/min al buio a temperatura ambiente dopo 90 minuti. Rilasciare i protoplasti agitando per un minuto a 90 giri/min. Filtrare la soluzione attraverso una garza in una provetta da centrifuga a fondo tondo da 15 millilitri.

Sovrapporre la soluzione di protoplasti con due millilitri di tampone FPCN e centrifugare per 10 minuti a 70 volte G con lenta accelerazione e decelerazione a temperatura ambiente. I protoplasti intatti si accumuleranno all'interfaccia tra la soluzione enzimatica e l'FPCN utilizzando un ampio orifizio e una punta di pipetta da un millilitro per trasferire i protoplasti intatti in una nuova provetta da centrifuga. Per il successo di questa procedura, utilizzare sempre punte di orifizio bianche per evitare la rottura dei protoplasti intatti.

Riempire la provetta con la centrifuga tampone W five per due minuti a 100 volte G con accelerazione e decelerazione lente. Per pellettare i protoplasti, rimuovere con cura il surnatante e risospendere il pellet. In circa 200 microlitri di W cinque tampone, a seconda della quantità di protoplasti.

Per preparare un campione di protoplasti per la microscopia a scansione laser di prima battuta, due piccole strisce di sigillante a circa due centimetri di distanza l'una dall'altra su un vetrino da microscopio. Posizionare 20 microlitri della soluzione di protoplasti tra le strisce e posizionare con cura un vetro di copertura sopra. Le strisce sigillanti impediranno ai protoplasti di essere schiacciati dal vetro di copertura.

Per preparare un campione totale di foglie per la microscopia a scansione laser, tagliare un pezzo di un centimetro dalla foglia e posizionarlo su un vetrino da microscopio con il lato inferiore della foglia rivolto verso l'alto. Aggiungere circa 30 microlitri di acqua. Posizionare un vetro di copertura sopra e fissarlo saldamente con del nastro adesivo su entrambi i lati.

L'imaging viene eseguito con un microscopio a scansione laser confocale MICCA tipo TCS SP five per l'ingrandimento. Utilizzare un obiettivo con una magnitudine di 63 x con glicerolo come mezzo di imaging, utilizzare il software fluorescente avanzato della suite di applicazioni Leica per la valutazione. Impostare il laser Argonne al 30% e la potenza del laser a 488 nanometri a un'intensità del 18% Per monitorarlo segnale a 515 nanometri, impostare la larghezza di banda di emissione del primo rivelatore PMT da 495 a 550 nanometri.

Per monitorare l'autofluorescenza della clorofilla. Impostare una seconda larghezza di banda di emissione del rivelatore PMT da 650 a 705 nanometri. Per monitorare il segnale M cherry, utilizzare il laser HENI 5 61.

Impostare l'intensità del laser al 18% e una terza larghezza di banda di emissione del rivelatore PMT da 587 a 610 nanometri. Assicurarsi che le immagini da tutti i canali del rivelatore PMT siano state scattate con le stesse impostazioni di guadagno. Il guadagno dovrebbe essere compreso tra 800 e 900 per escludere i segnali di fondo.

Acquisisci immagini in questo formato, larghezza e altezza di 1024 x 1024 pixel con una velocità di scansione di 100 hertz. Per gli impilamenti Z, utilizzare una distanza massima di 0,5 micron tra ogni impilamento. In questo studio, il metodo BFC è stato utilizzato per monitorare l'interazione del chaperone molecolare citosolico HSP 90 con le proteine di aggancio della membrana TPR seven e a 64.

Come mostrato in questo schema, Venere è accoppiata alla parte citosolica del TPR sette, che risiede nel reticolo endoplasmatico, o al 64, che risiede nell'involucro esterno del cloroplasto. Hs.P 90 è N fuso terminalmente con SCFP consentendo l'interazione dei domini TPR del talk 64 e del TPR seven Con l'HSP 90 C, Terminus, il solo SCFP è espresso nel citosol come controllo negativo per verificare la localizzazione del complesso proteico TPR seven HS P 90. Il TPR sette e l'HS P 90 sono stati cotrasformati con un marcatore ER.

La fluorescenza è stata monitorata nelle foglie intatte come controllo. Il solo SCFP è stato espresso insieme al TPR sette e al marcatore ER. In tutte le immagini mostrate, la barra della scala rappresenta 10 micron.

I pannelli a sinistra mostrano la fluorescenza ricostituita in verde monitorata a 515 nanometri. L'indicatore ER appare in rosso. Nei pannelli centrali, la sovrapposizione di entrambi i segnali è mostrata nei pannelli di destra.

È stato monitorato un segnale ricostituito per TPR 7 insieme a HS P 90 sovrapponendosi al marcatore ER che appare in giallo. Al contrario, non è stato monitorato alcun segnale per il TPR sette e il controllo negativo come CFP. Nell'esempio successivo, la proteina cloroplasta tox 64 è stata co-espressa con HS P 90 come controllo.

La Tox 64 è stata co-espressa con il solo SCFP. Come in precedenza, la fluorescenza ricostituita in verde è stata monitorata a 515 nanometri. I pannelli centrali mostrano l'autofluorescenza della clorofilla monitorata a 480 nanometri.

In rosso la sovrapposizione di entrambi i segnali è mostrata nei pannelli di destra. La fluorescenza ricostituita è stata osservata nelle cellule coex che esprimono tox 64 e HSP 90, ma non nelle cellule. Coex esprime solo tox 64 e SCFP.

Poiché l'esatta localizzazione di tox 64 e HSP 90 è difficile da determinare in immagini microscopiche di intere foglie. I protoplasti sono stati isolati da foglie di tabacco infiltrate per la microscopia a fluorescenza. Come in precedenza, la fluorescenza ricostituita è stata monitorata a 515 nanometri, l'autofluorescenza della clorofilla è stata monitorata a 480 nanometri e sono state create immagini di sovrapposizione, come mostrato in questa immagine di sovrapposizione, a 64 e HSP 90 può essere rilevato come strutture a forma di anello che circondano il cloroplasto Off.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare i tuoi costrutti, trasformare le foglie di tabacco e come visualizzare al meglio il segnale fluorescente che mostra l'interazione delle tue due proteine di interesse.