Name: Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Scopri come misurare lo stress ossidativo in embrioni di zebrafish vivi con metodi qualitativi e quantitativi. Questa tecnica consente il rilevamento di ROS in tessuti interi e singole cellule.

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Il supporto nel laboratorio Massimo Santoro proviene da HFSP, Marie Curie Action, Telethon e AIRC. Si ringraziano Dafne Gays ed Emiliano Panieri per la lettura critica del manoscritto.

1. Preparazione di strumenti e soluzioni di lavoro <ol><li> Preparare la soluzione di acqua pesce. Ottenere una soluzione stock sciogliendo 2 g di &#39;Ocean istantanea&#39; sali marini in 50 ml di acqua distillata. Aggiungere 1,5 ml di brodo di pesce di acqua a 1 L di acqua distillata per preparare pronto a utilizzare l&#39;acqua del pesce (/ sali marini ml 60 mcg concentrazione finale). Autoclave pronto all&#39;uso pesci d&#39;acqua prima dell&#39;uso. Questa soluzione viene utilizzata come mezzo zebrafish. </li><li> Preparare metilcellulosa per il montaggio degli embrioni. Sciogliere 1.5 g di metilcellulosa in 50 ml di acqua sterile pesce. Facilitare la dissoluzione utilizzando un magnete su una piastra di agitazione. La completa dissoluzione della polvere può richiedere diverse ore. Controllare la soluzione per chiarezza e aliquote in piccoli tubi. Conservare a -20 ° C per mesi e scongelare le aliquote a uso. Centrifugare la metilcellulosa a 950 xg per 5 minuti prima di utilizzare. Evitare cicli di congelamento-scongelamento di aliquote. </li><li> Preparare 50 ml di tricaine / etil 3-amminobenzoato msale ethanesulphonate (soluzione) sciogliendo 200 mg di tricaine in 100 ml di acqua e aggiustare il pH a 7,0 con Tris-HCl 1 M (pH 9). Conservare questo stock a 4 ° C per non più di 30 giorni. ATTENZIONE: tricaine è tossico. Utilizzare secondo le appropriate linee guida di trattamento. </li><li> Indurre stress ossidativo in embrioni di zebrafish <ol><li> Preparare una soluzione ossidante per l&#39;induzione dello stress ossidativo generico: Marca 50 ml di soluzione ossidante con l&#39;aggiunta di H 2 O Soluzione 2 stock (perossido di idrogeno; 100 mm) per l&#39;acqua il pesce. Usare H 2 O 2 di una concentrazione finale tra 2 mM e 100 mM. Preparare questa soluzione poco prima dell&#39;uso. La soluzione ossidante può essere applicato sia a montare tutto ROS rilevamento e monocellulari ROS metodi di rilevamento. Non conservare questa soluzione. ATTENZIONE: H 2 O 2 è pericoloso e nocivo per inalazione e ingestione. Il contatto con materiale combustibile può provocare un incendio. Maneggiare sotto cappa aspirante e usura pers appropriatedispositivi di protezione onal. </li><li> Preparare una soluzione ossidante per l&#39;induzione dello stress ossidativo dei mitocondri-derivati: ottenere una soluzione stock ossidante (5 mm), sciogliendo 3,9 mg di rotenone in 2 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Conservare questa soluzione a temperatura ambiente al buio. <ol><li> Sciogliere soluzione stock rotenone a 10 ml di acqua i pesci per fare una soluzione pronta all&#39;uso. Utilizzare rotenone ad una concentrazione compresa tra 5-50 micron. Non utilizzare rotenone a concentrazioni superiori a 100 micron. A concentrazioni appropriate, questa soluzione ossidante può essere applicato sia a montare tutto ROS rilevamento e monocellulari ROS metodi di rilevamento. ATTENZIONE: Rotenone è tossico e pericoloso. Manipolare secondo adeguate prudenza. </li></ol></li><li> Indurre stress ossidativo gene knock-down: knock-down dell&#39;espressione genica nrf2a in embrioni di zebrafish da morpholino microiniezione come precedentemente riportato da Timme-Laragy A. et al, 2012 38.. </li><li> Indurre oxidative stress dopo il danno tissutale: generare un margine ferita alla pinna caudale di embrioni di zebrafish a 72 HPF come precedentemente descritto da 2009 39 Niethammer et al.. </li></ol></li><li> Preparare 5 ml di soluzione ROS-rilevazione per singola cella metodo di ROS-rilevamento: <ol><li> Soluzione per il rilevamento ROS generale: sciogliere la sonda molecolare ROS-sensitive generico in HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks), al fine di preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2,5-10 micron). Questa soluzione deve essere preparata poco prima dell&#39;uso. </li><li> Soluzione per il rilevamento specifico ROS indotta dai mitocondri: Poco prima dell&#39;uso, sciogliere un mitocondriale sonda ROS-sensibile con DMSO fare un soluzione stock 5 mm. Sciogliere soluzione di riserva in HBSS per preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2,5-10 micron). NOTA: Evitare la luce e l&#39;ossigeno l&#39;esposizione di soluzioni di lavoro ROS di rilevamento e le rispettive soluzioni stock. Proteggere il tubo dalla luce utilizzandoun foglio di alluminio. Non conservare o di riutilizzo sonde disciolti in HBSS. Conservare le soluzioni madre a -20 ° C per un mese. ATTENZIONE: Maneggiare le sonde molecolari e DMSO sotto una cappa aspirante in accordo con le linee guida appropriate. </li></ol></li><li> Preparare 5 ml di soluzione ROS di rilevamento per l&#39;intero metodo di montaggio ROS-rilevamento: Sciogliere la soluzione generica sonda magazzino ROS-sensitive (stabilizzato in DMSO) in HBSS per preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2.5-5 micron). Evitare la luce e l&#39;esposizione all&#39;ossigeno. Proteggere il tubo dalla luce. Preparare questa soluzione prima dell&#39;uso. Non conservare o ri-utilizzare questa soluzione. ATTENZIONE: Maneggiare sonde molecolari sotto una cappa aspirante in accordo con le linee guida appropriate. </li><li> Fai 25 ml di Soluzione di arresto con l&#39;aggiunta di 10 ml di siero fetale bovino a 15 ml di PBS 1x. Mantenere soluzione sterile. Conservare questa soluzione a 4 ° C. Questa soluzione è necessaria solo per la singola cella - metodo di rilevazione ROS. </li><li> Impostare l&#39;incubatore d&#39;aria zebrafish a 28 &amp;# 176; C. </li><li> Impostare la centrifuga a 4 ° C per il metodo di rilevamento ROS singola cella. </li></ol> 2. L&#39;accoppiamento di pesci adulti e selezione di embrioni di zebrafish <ol><li> Set-up adulto coppia zebrafish attraversa secondo protocolli standard 40. Selezionare la linea transgenica appropriato in conformità con le specifiche esigenze sperimentali. </li><li> Raccogliere le uova e metterli in un piatto di 90 mm con terreno di pesci d&#39;acqua / embrione. Conservare le uova a 28 ° C fino embrioni svilupparsi e crescere allo stadio desiderato di sviluppo (ad esempio, 48 HPF, 72 hpf; hpf: ore dopo la fecondazione). </li><li> Schermo per lo sviluppo di embrioni. Escludere tutte le uova non fecondate o embrioni sottosviluppati. </li><li> Anestetizzare gli embrioni con l&#39;aggiunta di 1 ml di tricaine (soluzione) in 50 ml di acqua i pesci. </li><li> Selezionare embrioni fluorescenti Tg sotto uno stereomicroscopio. </li></ol> 3. Trattamento di embrioni con ossidante agente <ol><li> Utilizzare almeno 30 embrioni tra 48 hpf e 72 HPF per ogni condizione diversa. Lavare embrioni due volte con acqua pesce fresco per rimuovere tricaine. </li><li> Suddiviso embrioni fluorescenti in tre piatti. Mettere non più di 30 embrioni / piatto. </li><li> Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 10 ml della soluzione ossidante o 10 ml di acqua pesce come soluzione di controllo. </li><li> Incubare gli embrioni per 10 minuti a 1 ora a 28 ° C. Il periodo di incubazione dipende dal livello di stress ossidativo essere indotta in tessuti specifici. Brevi periodi sono i migliori come le cellule colpite da stress ossidativo progressivamente subiscono la morte delle cellule. </li><li> Trasferimento degli embrioni in un nuovo piatto contenente HBSS ed embrioni di lavaggio agitando. Pre-HBSS caldo a 28 ° C. </li></ol> 4. Intero monte ROS Metodo di rilevazione <ol><li> Raccogliere embrioni dopo il trattamento ossidante e mettere non più di 10 embrioni in un piccolo tubo. Risciacquare con HBSS il più possibile. Proteggere il tubo da luce utilizzando un foglio di alluminio. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di ROS rilevamento perogni provetta. </li><li> Incubare embrioni al buio per 15 minuti a 28 ° C per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Durante il tempo di incubazione preparare un vetrino per tutta l&#39;analisi embrione. Mettete 300 ml di metilcellulosa su una &quot;depressione&quot; vetrino e stenderlo sulla superficie del vetro con un puntale. Evitare le bolle mentre si rilascia il metilcellulosa. </li><li> Al termine del periodo di incubazione, rimuovere immediatamente la soluzione ROS rilevamento e lavare due volte con 2 ml di HBSS. Lavare gli embrioni capovolgendo la provetta diverse volte. Non pipetta o vortice. </li><li> Aspirare embrioni superiore in una pipetta Pasteur di vetro. Posizione embrioni vicino all&#39;apertura della pipetta e delicatamente espellere nel metilcellulosa. Orientare gli embrioni adeguatamente con un filo di nylon fine. </li><li> Confrontare la fluorescenza di embrioni di controllo con embrioni trattati. In alternativa, fissare parametri del stereomicroscopio a fluorescenza o un microscopio confocale in modo che tutti gli embrioni vengono esposte utilizzando lo stessoImpostazioni di imaging. </li></ol> 5. Single Cell Method ROS rilevamento <ol><li> Inizia dal punto: 3.5. Assicurarsi di avere almeno 35 embrioni per ogni condizione. </li><li> Trasferire gli embrioni in un nuovo piatto. Rimuovere l&#39;acqua i pesci, per quanto possibile. Aggiungere 10 ml di ghiacciata PBS 1x e 400 ml di inibitori della proteasi Cocktail. Dechorionate manuale embrioni con una pinza e rimuovere il sacco vitellino con un ago sottile. Nota: la rimozione sacco vitellino assicura campioni puliti per la successiva analisi FACS. Questo passaggio può essere evitato secondo strumento FACS. </li><li> Trasferimento de-yolked embrioni in una piastra a 24 pozzetti multiwell (15 embrioni / pozzetto) e rimuovere tutti i pesci d&#39;acqua. </li><li> Aggiungere 300 ml di HBSS, 30 microlitri collagenasi P, 50 microlitri tripsina-EDTA in ciascun pozzetto. </li><li> Omogeneizzare embrioni pipettando gentilmente su e giù con un puntale stretto (1.000 ml). </li><li> Incubare a 28 ° C per 20 min e omogeneizzare campioni pipettando ogni 5 min. </li><li> Controllare DISR tessutouption osservando un&#39;aliquota di omogenato al microscopio composto. Facilitare sospensione singola cella pipettando. Non incubare gli embrioni per più di 30 min. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 200 ml di soluzione di arresto. Mescolare pipettando delicatamente. </li><li> Trasferire sospensione di cellule in una provetta pre-raffreddata con fondo stretto. Tenere la provetta in ghiaccio ed evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 250 xga 4 ° C. </li><li> Rimuovere la fase superiore e risospendere le cellule con ghiaccio freddo HBSS pipettando delicatamente. </li><li> Contare le celle e assicurarsi di avere lo stesso numero di cellule in tutti i campioni. Non utilizzare meno di 2 x 10 6 cellule. </li><li> Celle di centrifugazione per 5 minuti a 250 xg a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet con 1 ml di ghiaccio raffreddato HBSS contenente la sonda ROS-sensitive. </li><li> Incubare la provetta a temperatura ambiente per 3 minuti al buio. Tempo di incubazione variare a seconda del livello di stress ossidativo e di tegli sensibilità della sonda. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta FACS. Tenere le provette su ghiaccio ed evitare l&#39;esposizione alla luce prima analisi FACS. </li><li> Ordinare le celle con un cell sorter fluorescenza-attivato (FACS). Lunghezze d&#39;onda impostato conformemente fluorescenza Tg tessuto (ad esempio, GFP) e gli spettri di eccitazione / emissione della sonda molecolare utilizzato per il rilevamento ROS (ad esempio, sonde specifiche mitocondriali ROS-sensibili, generici sonde sensibili ROS). </li><li> Per ogni condizione, misurare tutti i campioni all&#39;interno della stessa sessione sperimentale, applicando le stesse impostazioni FACS. Calcolare la percentuale di cellule fluorescenti come media di diverse repliche biologiche. Analizzare almeno due repliche per ogni condizione. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Fasi critiche La procedura per la rilevazione dello stress ossidativo in embrioni di zebrafish qui descritti comprende due metodi differenti. L&#39;intero metodo di montaggio ROS rilevamento è principalmente un test qualitativo per ROS-rilevamento, mentre il metodo ROS rilevamento singola cella consente misurazioni quantitative più specifici (Figura 1). Entrambi i metodi offrono un modo rapido e semplice per valutare in vivo ROS-rilevazione sugli embrioni di zebrafish...

Lo stress ossidativo è specificamente definita come una condizione che deriva da uno stato redox cellulare sbilanciato. Le reazioni redox complesse che si verificano normalmente all&#39;interno delle cellule determinano il redox-stato cellulare. Reazioni redox comprendono tutte le reazioni chimiche che consistono nel trasferimento di elettroni tra atomi di molecole biologiche che producono riduzione e ossidazione di molecole (ad esempio reazioni redox). Queste reazioni sono catalizzate da specie attivata elettronicamente (cioè le specie pro-ossidanti), caratterizzati da una instabilità strutturale estremo e l&#39;attivazione spontanea di elettroni sbilanciati che scambiano con biomolecole limitrofi. Queste reazioni irregolari risultano in danni al DNA, proteine ​​carbossilazione, e l&#39;ossidazione dei lipidi, e alla fine portano alla morte delle cellule 1. Aumento dei livelli di stress ossidativo sono stati associati con l&#39;invecchiamento e la progressione di diversi stati patologici 2. Lo stress ossidativo èstato segnalato per essere responsabile di alterazioni vascolari nel diabete e le malattie cardiovascolari 3,4. Esso svolge anche un ruolo fondamentale nella degenerazione neuronale nella malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson 5. Inoltre, lo stress ossidativo è stato dimostrato come un fattore critico nel governo progressione del cancro ed eventi metastatici 6,7. Inoltre, le risposte infiammatorie e immunitarie possono suscitare e sostenere ulteriormente lo stress ossidativo 8. In cellule viventi, specie pro-ossidative sono derivati ​​da ossigeno (ROS, specie reattive dell&#39;ossigeno) o di azoto (RNS; specie reattive). ROS includono il radicale idrossile, l&#39;anione superossido (OH.) (O 2 -), e il perossido di idrogeno (H 2 O 2). Il primario RNS è l&#39;ossido di azoto (NO).. Una serie di specie reattive secondarie può essere generato da interazioni spontanee between ROS e RNS o metalli liberi ioni 9. Ad esempio, l&#39;anione superossido reagisce con l&#39;ossido di azoto per formare peroxynitrate (ONOO -), mentre H 2 O 2 reagisce con Fe 2 + genera radicali idrossilici. ROS e RNS, grazie alla loro capacità di reagire con diverse biomolecole, sono considerati una minaccia pericolosa per il mantenimento dello stato fisiologico redox 10. Per mantenere le cellule stato redox sono dotati di una serie di disintossicante molecole antiossidanti ed enzimi. La superossido dismutasi (SOD), catalasi, glutatione perossidasi e Peroxiredoxins costituiscono essenzialmente l&#39;antiossidante enzimatico-arsenale che fornisce protezione cellulare da specie pro-ossidanti compreso H 2 O 2, OH e Oono -. 11. Anche molecole anti-ossidanti come la vitamina C ed E, polifenoli e CoenzymeQ10 (CoQ10) sono di importanza critica per placare ROS e la loro de pericolosarivati ​​12,13. Tuttavia, una eccessiva produzione di ROS e RNS, o una disfunzione del sistema antiossidante, sposta la redox-stato cellulare verso lo stress ossidativo 14. Oltre alla loro connotazione negativa, ROS può svolgere vari ruoli fisiologici in cellule di diversa origine. Cellule normalmente producono ROS come molecole di segnalazione per mediare eventi biologici normali, come la difesa ospite e ferita riparazione 15-17. Specie reattive sono normalmente prodotti in cellule da enzimi intracellulari come NOx (NADPH) e XO (xantina ossidasi) in risposta a fattori di segnalazione, fattori di crescita e le fluttuazioni dei livelli di calcio intracellulare 18,19. E &#39;stato riportato che i ROS differenzialmente può modulare l&#39;attività di importanti fattori nucleari come p53 o componenti cellulari come l&#39;ATM-chinasi, il principale regolatore della risposta al danno del DNA 20. Analogamente ROS influenzano fortemente segnalazione cellulare mediando the ossidazione e inattivazione di proteina tirosina fosfatasi (PTP), che sono stabiliti come regolatori critici di trasduzione del segnale 21. Inoltre, le metodologie di proteomica basata dimostrano che RNS sono anche responsabili di specifiche modificazioni delle proteine ​​e alterazioni della segnalazione molecolare. RNS reagiscono con i gruppi tiolo cisteina li modificano in S-nitrothiols (SNO) e innescando meccanismi molecolari concomitanti con stati patologici come le malattie infiammatorie e autoimmuni 22,23. Da esperimenti di coltura cellulare solo parzialmente riproducono la moltitudine di fattori che agiscono in vivo, è di grande interesse per eseguire studi redox in modelli animali 24,25. Per ottenere ciò, il zebrafish è stato considerato un modello animale vertebrato adatto per studiare la dinamica di stress ossidativo 26. Lo zebrafish è un nuovo modello di sistema che concede numerosi vantaggi di studiare eventi cellulari e genetici durante vertebrato development e la malattia. Grandi cluster di embrioni possono essere generate e disponibili settimanale per esigenze sperimentali. Inoltre, la straordinaria chiarezza ottica di embrioni di zebrafish, nonché le loro piccole dimensioni, permette l&#39;imaging singola cellula e l&#39;inseguimento dinamico in un insieme di organismi 27. Nell&#39;ultimo decennio, un numero considerevole di zebrafish mutanti sono stati generati per modellare condizioni patologiche umane come il cancro e malattie genetiche 28-31. Ancora più importante, una moltitudine di linee transgeniche è stata prodotta per consentire ampie possibilità di manipolazioni genetiche e biologiche 32. Ad esempio, le linee transgeniche zebrafish tessuto-specifici sono regolarmente utilizzati per studi in vivo. Queste linee esprimono una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore selezionato, offrendo la possibilità di identificare le singole cellule in vivo, così come la struttura anatomica di comprendere. Diversi studi tossicologici hanno già utilizzato tegli Zebrafish per valutare l&#39;effetto in vivo delle sostanze chimiche sulla omeostasi redox, suggerendo l&#39;idoneità di questo vertebrato come modello animale per il campo della scoperta di nuovi farmaci e stress ossidativo 33-35. Anche se alcuni sonde fluorescenti sono stati testati per monitorare lo stress ossidativo in larve di zebrafish 36,37, non ci sono test stabiliti per rilevare e misurare i livelli di stress ossidativo nei tessuti zebrafish e cellule viventi. Qui si descrive un procedimento per la quantificazione in vivo di stress ossidativo in cellule di embrioni di zebrafish vivente. Strumenti di imaging, FACS ordinamento, sonde fluorescenti e le condizioni pro-ossidative sono tutti combinati per generare un semplice test per l&#39;individuazione e la quantificazione delle specie ossidanti in embrioni e tessuti di zebrafish.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>NON CONSERVARE LE DILUIZIONI</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hank 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di sale marino per acquari oceanici istantanei</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Sonda cgenerica sensibile ai ROS: CellROX Deep Red Reagent</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Sonda specifica per i mitocondri sensibile ai ROS: MitoSOX&nbsp;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td><td>sciogliere un flaconcino con 13 &mu; l di DMSO</td></tr><tr><td>Idroetidina</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Preparare 5 mM di soluzione madre in DMSO.</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870; 3-benzil-7-(2-benzossazolil)tio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pirimidina</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>sciogliere la polvere in DMSO; diluire in acqua</td></tr><tr><td>di pesce Ioduro di propidio&nbsp;</td><td>Sonde molecolari (Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-amminoactinomicina D (7-AAD)&nbsp;</td><td>Sonde molecolari (Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Rif</td><td>: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)</td></tr><tr><td>Collagenasi P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>Sciogliere la polvere a 100 mg/ml in HBSS sterile. Conservare le aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Compresse complete per inibitori della proteasi</td><td>ROCHE</td><td></td><td>Sciogliere una compressa in 1 ml di acqua</td></tr><tr><td>0,5% di tripsina-EDTA (10x), senza rosso fenolo</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>Preparare 1x soluzione di lavoro prima dell'uso</td></tr><tr><td>Microscopio composto&nbsp;</td><td>Stereomicroscopio ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con illuminazione fluorescente</td><td>Fotocamera Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr> Software <tr><td></td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>per l'acquisizione di immagini a fluorescenza</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare attivato da fluorescenza</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Provette Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>FACS&nbsp;</td><td>Piastra</td><td></td> multipozzetto BD 342065<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri sterilizzate e non trattate 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi dello stress ossidativo in embrioni di zebrafish

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Alti livelli di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) possono causare un cambiamento di stato redox cellulare verso condizione di stress ossidativo. Questa situazione provoca ossidazione di molecole (lipidi, DNA, proteine) e porta alla morte delle cellule. Lo stress ossidativo influenza anche la progressione di diverse condizioni patologiche come il diabete, retinopatie, neurodegenerazione, e cancro. Quindi, è importante definire strumenti per studiare le condizioni di stress ossidativo non solo a livello di singole cellule, ma anche nel contesto di organismi interi. Qui, si considera l&#39;embrione zebrafish come un utile sistema in vivo tali studi e presentare un protocollo per misurare in vivo stress ossidativo. Approfittando di sonde fluorescenti ROS e linee fluorescenti transgeniche zebrafish, sviluppiamo due metodi differenti per misurare lo stress ossidativo in vivo: i) un &quot;metodo ROS-detection intero embrione&quot; per la misura qualitativa dello stress ossidativo e ii) uno &quot;unicellulare metodo di rilevazione ROS &quot;per misure quantitative di stress ossidativo. Qui, dimostriamo l&#39;efficacia di queste procedure, aumentando lo stress ossidativo nei tessuti da agenti ossidanti e metodi fisiologici o genetici. Questo protocollo è suscettibile per schermi genetiche in avanti e vi aiuterà relazioni indirizzo di causa-effetto di ROS in modelli animali di patologie legate allo stress ossidativo come disturbi neurologici e cancro.

Applicando il metodo descritto qui, possiamo facilmente misurare e rilevare lo stress ossidativo (e livelli di ROS) nei tessuti embrionali di zebrafish. Dopo aver attraversato zebrafish adulto, uova vengono raccolte e permesso di sviluppare a 28 ° C per 72 ore dopo la fecondazione (HPF). Al fine di indurre stress ossidativo, proponiamo due diversi approcci: 1) Il trattamento degli embrioni con forti reagenti pro-ossidanti o 2) promuovere la formazione di ROS dopo la lesione del tessuto. Nel ...

Qui riportiamo un protocollo per misurare lo stress ossidativo negli embrioni viventi di zebrafish. Questa procedura consente di rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sia nei tessuti embrionali interi che nelle popolazioni di singole cellule. Questo protocollo realizzerà analisi sia qualitative che quantitative.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare qualitativamente e quantitativamente lo stress ossidativo in embrioni vivi di pesce zebra. Questo viene ottenuto aggiungendo una soluzione ossidante a embrioni preparati per l'induzione dello stress ossidativo, oppure creando un margine di ferita nella pinna caudale dell'embrione. Gli embrioni vengono quindi sottoposti a rilevamento dello stress ossidativo mediante un metodo a singola cellula o mediante un metodo in toto.Successivamente, i preparati vengono incubati con una sonda rivelatrice di Ross. I risultati possono mostrare la quantità di stress ossidativo e il livello di Ross in base alla microscopia confocale di preparati in toto o all'analisi citofluorimetrica di singole cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunofluorescenza per i marcatori di stress ossidativo, è che consente il rilevamento diretto nel contesto di un organismo vivente e la quantificazione a livello di singoli tessuti.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca di base, ad esempio esplorando le condizioni di stress ossidativo nel contesto di uno stato patologico. Le persone alle prime armi potrebbero incontrare difficoltà a causa di danni accidentali ai tessuti, poiché le sonde molecolari grezze e sensibili potrebbero rappresentare una fonte imprevista di acidità. Inoltre, poiché livelli elevati di stress ossidativo devono portare alla morte cellulare, mentre livelli troppo bassi potrebbero risultare difficili da rilevare, questi problemi si manifesteranno soltanto durante la preparazione della soluzione per indurre lo stress ossidativo nei mitocondri, composta da rot enone in DMSO, che deve essere preparata utilizzando una soluzione madre di rot enone a una concentrazione compresa tra cinque e 50 micromolare, e mai superiore a 100 micromolare, poiché il rot enone è tossico e pericoloso.Prestare attenzione alle precauzioni indicate. La soluzione del sonda per il rilevamento di hole Mount Ross non deve essere esposta a luce o ossigeno durante la preparazione e deve essere preparata al momento per il metodo di rilevamento di Ross in singola cellula. È necessario preparare una soluzione di arresto di FBS in PBS e mantenerla a quattro gradi Celsius.Altri passaggi preparatori includono l'impostazione dell'incubatrice aerea per zebrafish a 28 gradi Celsius e il raffreddamento della centrifuga a quattro gradi Celsius per il metodo della singola cellula. Vengono eseguiti l'incrocio dei zebrafish, la raccolta degli embrioni e l'anestesia. Utilizzando metodologia standard, raccogliere gli embrioni di interesse tra le 48 e le 72 ore dopo la fecondazione.Dopo aver anestetizzato gli embrioni, rimuovere l'anestetico con due lavaggi, quindi caricare gli embrioni in tre piatti con non più di 30 per piatto per il rilevamento grezzo delle singole cellule. Raccogliere almeno 35 embrioni per condizione in più piatti. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di soluzione ossidante o, come controllo negativo, [inserire qui il controllo appropriato].Applicare 10 millilitri di acqua, quindi attendere da 10 a 60 minuti mentre gli embrioni incubano a 28 gradi Celsius. Riscaldare inoltre l'HBSS a 28 gradi Celsius per il lavaggio. Al termine dell'incubazione, trasferire gli embrioni in una nuova piastra con HBSS caldo e agitare delicatamente.Procedere quindi con la rilevazione di Ross in preparato intero o a singola cellula. Un'opzione più fisiologica consiste nel generare stress dopo un danno tissutale utilizzando la tecnica di ferita alla pinna caudale descritta da NI Tomer e colleghi. Dopo il trattamento con ossidante, trasferire gruppi di fino a 10 embrioni in provette piccole.Sciacquarli abbondantemente con HBSS e proteggerli dalla luce avvolgendoli con della stagnola. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione di rilevamento grezza in ogni provetta e incubare le provette per 15 minuti a 28 gradi Celsius durante l'incubazione. Preparare un vetrino che contenga sia la condizione di controllo che quella sperimentale.Coprire un vetrino con cavità con 300 microlitri di metilcellulosa. Non formare bolle durante l'espulsione della metilcellulosa. Dopo l'incubazione degli embrioni, sostituire rapidamente la soluzione nei tubi con due millilitri di HBSS e capovolgere i tubi più volte per lavare gli embrioni.Quindi aspirare gli embrioni nella punta di una micropipetta e rilasciarli delicatamente sul vetrino trattato. Orientare gli embrioni utilizzando un sottile filo di nylon e procedere con l'analisi al microscopio fluorescente o confocale. Assicurarsi di analizzare tutti gli embrioni con le stesse impostazioni.Trasferire gli embrioni dal lavaggio con HBSS in una nuova piastra, rimuovendo la maggior quantità possibile di soluzione. A questo punto, decorticare manualmente gli embrioni. Questo passaggio è effettivamente necessario per dissociare gli embrioni in singole cellule.Successivamente, trasferire gli embrioni in una piastra a 24 pozzetti, inserendo 15 embrioni in ciascun pozzetto. Riempire in modo ottimale tre pozzetti per ogni condizione. Successivamente, rimuovere tutta la soluzione e sostituirla con 300 microlitri di HBSS, 30 microlitri di collagenasi p e 50 microlitri di tripsina EDTA.Utilizzando una punta per pipetta da un millilitro, omogeneizzare gli embrioni con il tritatutto. Una volta preparati tutti i pozzetti, trasferire la piastra a 28 gradi Celsius per almeno 20 minuti ogni cinque minuti, quindi eseguire la triturazione dei campioni per garantire un buon omogeneizzazione. Inoltre, mettere alcuni tubi microcentrifuga sul ghiaccio per raccogliere i tessuti quando sono pronti.Dopo 20 minuti, prelevare un campione e verificare al microscopio che il tessuto sia stato dissociato in una sospensione di singole cellule. In caso contrario, proseguire l'incubazione per un massimo di 30 minuti in totale. Quando il tessuto è pronto, arrestare la reazione aggiungendo ulteriori 200 microlitri di soluzione di arresto.Mescolare questo con TRI utilizzando una punta da un millilitro. Successivamente, trasferire il contenuto di ogni pozzetto in una provetta microcentrifuga preraffreddata e mantenere queste provette sul ghiaccio al riparo dalla luce. Centrifugare quindi i campioni a 250 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.E quindi rimuovere il soprannatante per aspirazione. Ri-sospendere il pellet cellulare in HBSS freddo con una leggera agitazione e verificare che la sospensione contenga almeno 2 milioni di cellule. Successivamente, ri-sospendere le cellule in un millilitro di soluzione grezza del sonda sensibile.Incubarle a temperatura ambiente e al buio per circa tre minuti. Regolare empiricamente il tempo di incubazione. Successivamente, trasferire le cellule in provette da centrifuga protette dalla luce.Procedere con le analisi tramite fax per rilevare il marcatore transgenico. Fluorescenza e fluorescenza della sonda Ross durante l'analisi. Calcolare sempre i livelli di perdita come aumenti rispetto ai campioni di controllo al fine di normalizzare la fluorescenza di fondo.È stato utilizzato tutto il rilevamento di Mount Ross per esaminare l'accumulo di perossido di idrogeno in una sede di lesione. Sono state confrontate code integre e danneggiate dopo 20 minuti di trattamento con ossidante. È stato rilevato un segnale non specifico in entrambe le condizioni.Lo stesso esperimento con il pretrattamento degli embrioni per ridurre i livelli di perossido di idrogeno. L'uso dell'inibitore OX VAs 28 70 ha rivelato che i segnali rilevati erano effettivamente dipendenti dall'accumulo di Ross rot. Gli embrioni trattati noti sono stati inoltre esaminati mediante montaggio intero.Con un ingrandimento elevato, era possibile identificare le regioni anatomiche. Tale risultato è stato ottenuto da Ross, come indicato dal conteggio della fluorescenza delle cellule positive a Ross mediante fax, eseguito per il rilevamento di Ross a livello di singola cellula. Questa analisi è stata condotta escludendo le cellule morte. Controllo.Le cellule senza trattamento sono state analizzate anche. Il confronto di questi risultati ha reso molto semplice la quantificazione dell'accumulo di Ross. Il saggio si rivela eccellente per testare un qualsiasi numero di manipolazioni sperimentali.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti se effettuata correttamente. Non dimenticare che lavorare con sonde molecolari può essere estremamente pericoloso e richiede precauzione. L'uso di guanti dovrebbe essere sempre adottato durante l'esecuzione di questa procedura.

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