Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca

L'obiettivo generale del seguente esperimento è il monitoraggio in vitro di aggregati cardiaci pulsanti derivati da cellule staminali embrionali umane, in tempo reale tridimensionale e con elevata risoluzione spaziale. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando ed espandendo le cellule staminali embrionali fino a quando formano corpi embrionari. Successivamente, gli aggregati pulsanti vengono dissezionati e seminati su filtri porosi in POLITETRAFLUORETILENE o PTFE, che permettono di mantenerli a lungo termine in condizioni di aria.

Colture liquide contenenti aggregati vengono quindi marcate con nanoparticelle armoniche al fine di eseguire microscopia multiphotonica in tempo reale. I risultati ottenuti permettono l'analisi dell'elongazione spaziale e della frequenza delle contrazioni cardiache a scala microscopica. Il principale vantaggio di queste nanoparticelle è quindi che è possibile utilizzare qualsiasi lunghezza d'onda, in particolare l'infrarosso, consentendo di penetrare più in profondità nei tessuti, ed esse sono inoltre molto stabili nel tempo.

Pertanto, possiamo monitorare i nostri processi a lungo termine su ampie finestre temporali. Questo metodo di coltura di cellule staminali può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della contrazione funzionale dei cardiomiociti in tre dimensioni, in particolare riguardo alla maturazione cardiaca e all'ingegneria tissutale.

Coloro che si avvicinano per la prima volta a questo metodo devono essere consapevoli che la procedura di marcatura con nanoparticelle armoniche può essere utilizzata esclusivamente per la microscopia a fotoni multipli e non può essere trasferita ad altri tipi di sistemi di imaging. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di utilizzare nanoparticelle armoniche nel 2005. Queste nanoparticelle presentano vantaggi rispetto ai coloranti fluorescenti e ai punti quantici.

Di fatto, il loro segnale non si attenua nel tempo e può essere utilizzato per monitorare campioni in via di sviluppo per lunghi periodi. La dimostrazione visiva della preparazione del campione è fondamentale per l'efficienza e la riproducibilità delle diverse fasi, in particolare durante la sperimentazione di farmaci, e potrebbe essere applicata anche a diversi tessuti o malattie. Modellizzazione dei tessuti.

Dopo aver coltivato ed espanso le cellule staminali embrionali umane o ESC secondo il protocollo descritto nel testo e averle incubate con collagenasi calda per quattro volte per 10 minuti, raccogliere i frammenti di colonia in due millilitri di mezzo di differenziamento fresco o DM e centrifugare a 115 × g per tre minuti. Coltivare i frammenti di colonia in sospensione in piastre a sei pozzetti con superficie ultra bassa adesiva per quattro giorni, in modo che possano formare corpi embrionali o EB.

Quindi piastrare gli EBS appena formati su piastre da 24 pozzetti rivestite con gelatina 0,1% per 15-30 giorni, fino alla comparsa di ammassi pulsanti. Rimuovere il PBS e, utilizzando acutus, dissociare le colonie in singole cellule dopo la centrifugazione e la risospensione, sospensando le cellule in mezzo DM e piastrando due millilitri per pozzetto. Incubare nella camera a 37 gradi Celsius per un giorno.

Raccogliere gli EBS appena formati e piastrarne tre per pozzetto su piastre da 24 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1% dopo due-quattro settimane di coltura. Identificare i gruppi di cardiomiociti contrattili e, utilizzando una pipetta di vetro affilata e allungata, dissezionarli manualmente. Depositare quattro filtri in PTFE per inserto e posizionarli ciascuno in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Dopo aver aggiunto un millilitro di DM in ciascun pozzetto, posizionare un cluster battente dissezionato su ciascun filtro in PTFE. Per etichettare i cluster, trasferire i filtri in PTFE con i cluster battenti in una piastra di vetro da 3,5 centimetri con fondo in vetro. Aggiungere un millilitro di nanoparticelle per la generazione di armonica secondaria a 50 microgrammi per millilitro e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius per eseguire l’imaging ottico non lineare.

Dopo aver trasferito gli HEB marcati o i cluster cardiaci in pulsazione in una camera per imaging, utilizzare un'illuminazione a campo ampio con luce bianca per identificare le strutture di interesse all'interno degli EBS differenziati o nei cluster attivamente contrattili. Eseguire una scansione tridimensionale rapida a bassa risoluzione per ricostruire la morfologia complessiva del cluster cardiaco e selezionare un piano immagine all'interno del volume del cluster contenente diverse nanoparticelle visibili di seconda armonica da monitorare in tempo reale. Le contrazioni del cluster cardiaco impostano lo scanner ottico del microscopio alla velocità massima, consentendo l'acquisizione di immagini bidimensionali a frequenza multi-hertz.

Analizzare le immagini utilizzando il software MATLAB seguendo il protocollo descritto nel testo, come dimostrato qui, prima di valutare l'attività contrattile. La caratterizzazione della risposta ottica non lineare dei filtri in PTFE viene eseguita per garantire che la fluorescenza del substrato nudo ai fotoni sia molto debole e non possa impedire la misurazione dei campioni biologici rilevanti e dell'emissione da parte di elementi isolati. Le nanoparticelle di generazione di armoniche di secondo ordine possono essere facilmente acquisite mediante imaging attraverso il substrato in modalità di rilevamento epi.

In questa figura, le nanostrutture a generazione di armonica secondaria marcate che evidenziano le strutture cardiache e le EBS sono mostrate nella lama. I colori rosso, giallo e verde corrispondono all'autofluorescenza del NADH, mentre i punti blu intensi di generazione di armonica secondaria derivano da nanostrutture isolate a generazione di armonica secondaria. Si noti il buon contrasto ottico e la marcatura relativamente scarsa rispetto ai punti quantici o alle nanostrutture a conversione ascendente.

Questa figura illustra una vista in sezione di un aggregato cardiaco pulsante marcato con nanoparticelle a generazione di armoniche di secondo ordine. Come mostrato in questo filmato, le strutture tridimensionali vengono registrate a elevata velocità per monitorare il pattern di contrazione nella seconda cellula. Le nanoparticelle a generazione di armoniche si aggregano per mantenere un'elevata velocità di acquisizione necessaria a risolvere il movimento delle nanoparticelle.

La sensibilità complessiva di acquisizione non è risultata sufficiente per registrare la autofluorescenza cellulare con emissione armonica secondaria derivante dalla generazione di armonica secondaria. L'analisi dell'immagine delle nanoparticelle effettuata sui fotogrammi del filmato indica che all'interno dello stesso ammasso cardiaco gli spostamenti sono dell'ordine di pochi micrometri e la frequenza è costante per il movimento delle nanoparticelle in e fuori dal piano della generazione di armonica secondaria. Una volta padroneggiata la tecnica di preparazione delle cellule, la dissezione dell'ammasso ottimale, la coltura all'interfaccia aria-liquido e la schiusa possono essere completate in 24-36 ore se eseguite correttamente.

In particolare con questa tecnica, è necessario evitare contatti con l'aria aperta per prevenire contaminazioni. Seguendo questa procedura, è possibile applicare altri metodi come registrazioni elettrofisiologiche mediante array di elettrodi multipli al fine di rispondere a ulteriori domande scientifiche, ad esempio correlare i profili del potenziale d'azione con la frequenza di contrazione in tre dimensioni. La nostra nuova tecnica, basata sul rilevamento del segnale non lineare mediante nanoparticelle armoniche, può essere ulteriormente sviluppata per studi in vivo poiché le lunghezze d'onda utilizzate per l'imaging consentono una maggiore penetrazione nei tessuti.

Uno sviluppo possibile potrebbe essere seguire l'integrazione di strutture derivate da cellule staminali per applicazioni nella medicina rigenerativa.