Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca

L'obiettivo generale del seguente esperimento è il monitoraggio in vitro di cluster di beading cardiaco derivati da cellule staminali embrionali umane in 3D in tempo reale e ad alta risoluzione spaziale. Ciò si ottiene coltivando ed espandendo prima le cellule staminali embrionali fino a formare i corpi di Embry. Successivamente, i gruppi di battitura vengono sezionati e placcati su filtri porosi in POLITETRAFLUOROETILENE o PTFE, che ne consentono il mantenimento come aria a lungo termine.

Le colture liquide e i cluster di battitura vengono marcati con nanoparticelle armoniche per eseguire la microscopia multifotone in tempo reale. I risultati ottenuti consentono l'analisi dell'allungamento spaziale e della frequenza delle contrazioni cardiache su scala microscopica. Quindi il vantaggio principale di queste nanoparticelle è che puoi usare qualsiasi lunghezza d'onda, specialmente l'infrarosso, in modo da poter andare più in profondità nei tessuti e sono anche molto stabili nel tempo.

In questo modo possiamo monitorare i nostri processi a lungo termine su lunghi periodi di tempo. Questo metodo di coltura di cellule staminali può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della contrazione funzionale dei cardiomiociti in tre dimensioni. In particolare, la maturazione cardiaca e l'ingegneria tissutale.

I nuovi metodi di malattia dovrebbero essere consapevoli che la procedura di marcatura con nanoparticelle armoniche può essere utilizzata solo per la microscopia multifotone e non può essere trasferita ad altri tipi di sistemi di imaging. Abbiamo avuto l'idea di utilizzare le nanoparticelle armoniche per la prima volta nel 2005. Queste nanoparticelle presentano vantaggi rispetto ai coloranti fluorescenti e ai punti quantici.

Infatti, il loro segnale non si affievolisce nel tempo e possono essere utilizzati per monitorare lo sviluppo di campioni per lunghi periodi di tempo. La dimostrazione visiva della preparazione del campione è fondamentale per l'efficienza e la riproducibilità delle diverse fasi, in particolare quando si eseguono test farmacologici, e potrebbe anche essere applicata a diversi tessuti o malattie. Modellazione tissutale.

Dopo aver coltivato ed espanso le cellule staminali embrionali umane o ESC secondo il protocollo di testo e averle incubate con collagenasi calda, quattro per 10 minuti, raccogliere i frammenti di colonia in due millilitri di differenziazione fresca, terreno o DM e centrifugare a 115 volte la gravità per tre minuti. Cultura, la colonia si frammenta in sospensione in attacchi ultra bassi. Piastre a sei pozzetti per quattro giorni per consentire loro di formare corpi embrionali o ebs.

Quindi impiattare l'EBS appena formato su piastre a 24 pozzetti rivestite di gelatina allo 0,1% per 15-30 giorni fino alla comparsa di grappoli battenti. Rimuovere il PBS e, utilizzando l'acutus, dissociare le colonie in singole cellule dopo la centrifugazione e risus, sospendendo le cellule in piastra media DM due millilitri per agro. Pulire in camera e incubare a 37 gradi Celsius per un giorno.

Raccogliere l'EBS di nuova formazione e piastrellarle tre per pozzetto su piastre da 24 pozzetti rivestite di gelatina allo 0,1% dopo due-quattro settimane di coltura. Identificare i gruppi di cardiomiociti che battono e, utilizzando una pipetta di pasta allungata e tagliata in modo netto, sezionarli manualmente. Depositare quattro filtri in PTFE per inserto e posizionarli in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Dopo aver aggiunto un millilitro di SS in ciascuno, aggiungere un cluster di battitura sezionato su ciascun filtro in PTFE. Per etichettare i grappoli, trasferire i filtri in PTFE con i grappoli battenti in un piatto di vetro da 3,5 centimetri. Aggiungere un millilitro di nanoparticelle di generazione di seconda armonica a 50 microgrammi per millilitro e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius per eseguire l'imaging ottico non lineare.

Dopo aver trasferito gli HEB marcati o i cluster di battimento cardiaco in una camera di imaging, utilizzare l'imaging ad ampio campo con illuminazione a luce bianca per identificare le strutture di interesse all'interno di EBS differenziati o cluster di battimento attivi. Esegui una scansione tridimensionale veloce a bassa risoluzione per ricostruire la morfologia complessiva del cluster cardiaco e seleziona un piano dell'immagine all'interno del volume del cluster con diverse nanoparticelle visibili di generazione di seconda armonica da monitorare in tempo reale. Le contrazioni del cluster cardiaco impostano lo scanner ottico del microscopio nella modalità più veloce, consentendo l'acquisizione multi hertz di immagini bidimensionali.

Analizzare le immagini utilizzando il software MATLAB secondo il protocollo di testo come dimostrato qui prima di valutare l'attività di battitura. La caratterizzazione della risposta ottica non lineare dei filtri in PTFE viene eseguita per garantire che il substrato nudo alla fluorescenza dei fotoni sia molto debole e non possa impedire la misurazione dei campioni biologici rilevanti e l'emissione da isolati. Le nanoparticelle di seconda armonica possono essere facilmente acquisite mediante imaging attraverso il substrato in modalità di rilevamento epi.

In questa figura, le nanoparticelle di seconda armonica di generazione marcate con strutture cardiache e EBS sono visualizzate a lama. I colori rosso, giallo e verde corrispondono all'autofluorescenza del NADH mentre le macchie blu intenso della seconda armonica derivano da nanoparticelle isolate di generazione della seconda armonica. Si noti il buon contrasto ottico e l'etichettatura relativamente scarsa rispetto ai punti quantici o alle nanoparticelle di conversione verso l'alto.

Questa figura illustra una vista a fette di un cluster di battito cardiaco marcato con nanoparticelle di seconda generazione armonica. Come mostrato in questo filmato, le strutture 3D vengono registrate ad alta velocità per monitorare il modello di contrazione nella seconda cella. Le nanoparticelle di generazione armonica si aggregano per mantenere un'elevata velocità di acquisizione per la risoluzione del movimento NP.

La sensibilità complessiva dell'acquisizione non era sufficiente per registrare l'autofluorescenza cellulare con emissione di seconda armonica dalla generazione di seconda armonica. L'analisi delle immagini delle nanoparticelle eseguita sui fotogrammi dei film indica che all'interno dello stesso cluster cardiaco gli spostamenti sono dell'ordine di pochi micrometri e la frequenza è costante per l'interno e l'esterno del movimento delle nanoparticelle di generazione di seconda armonica. Una volta padroneggiata la tecnica di preparazione delle cellule, la dissezione a grappolo, la coltura del liquido d'aria e l'agnello possono essere eseguiti in 24-36 ore se eseguiti correttamente.

Soprattutto con questa tecnica, è necessario evitare i contatti all'aria aperta per evitare contaminazioni. Seguendo questa procedura, è possibile applicare altri metodi come le registrazioni elettrofisiologiche utilizzando più array di elettrodi per rispondere a ulteriori domande come la correlazione dei profili del potenziale d'azione con la frequenza di battimento in tre dimensioni. La nostra nuova tecnica basata sulla rilevazione del segnale non lineare da parte di nanoparticelle armoniche può essere ulteriormente sviluppata per gli studi in vivo che infettano le lunghezze d'onda utilizzate per l'imaging consentono una penetrazione più profonda nei tessuti.

Un possibile sviluppo potrebbe essere quello di seguire l'integrazione di strutture derivate da cellule staminali per applicazioni di medicina rigenerativa.