Name: Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri il monitoraggio in tempo reale di cluster cardiaci derivati da cellule staminali embrionali umane mediante nanoparticelle armoniche e microscopia multiphoton. Questo metodo avanzato consente analisi ad alta risoluzione delle contrazioni cardiache.

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Gli autori desiderano ringraziare il finanziamento parziale del progetto di ricerca FP7 NAMDIATREAM europea (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) e il progetto INTERREG IV Francia-Svizzera NAOMI.

1. Cultura e Espansione del CES umano <ol><li> Preparare il mezzo di propagazione delle cellule (chiamata PM) contenente Knockout DMEM integrato con il 20% Knockout siero, 1% MEM non-aminoacidi essenziali, 1% di L-glutammina 200 mm, 1% penicillina-streptomicina e 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo. </li><li> Scongelare ESC umane (hESC) in 8 ml di PM medio e centrifugare le 5 min a 115 xg per scartare DMSO-integrato medio di congelamento. </li><li> Aggiungere 1 ml di PM mezzo contenente 10 mM roccia inibitore per impedire l&#39;apoptosi e migliorare la sopravvivenza cellulare dopo lo scongelamento (solo 24 ore di incubazione). </li><li> Aggiungere fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) al PM alla concentrazione desiderata (4-10 ng / ml) per il mantenimento della pluripotenza. </li><li> Piatto il hESC sul umana irradiati prepuzio cellule di alimentazione (γHFF) (Figura 1A), precedentemente placcato ad una concentrazione di 2 x 10 4 cellule / cm 2. </li><li> Cambiare medio giornaliero e, se necessario, rimuovere parti di colonies iniziando a differenziarsi per aspirazione usando una forma allungata taglio deciso pipetta Pasteur. </li><li> Una volta a settimana, colonie passaggio enzimaticamente: <ol><li> Rimuovere medie e lavare le colonie con 2 ml di PBS. </li><li> Rimuovere PBS e incubare con 0.5 ml per pozzetto di caldo collagenasi IV a 1 mg / ml per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Raccogliere i frammenti colonia in 2 ml nuovo PM e centrifugare a 115 xg per 3 min. </li></ol></li><li> In alternativa, le colonie possono essere diversi passaggi meccanicamente mediante raschiatura: <ol><li> Rimuovere medie e lavare le colonie con 2 ml di PBS. </li><li> Raschiare manualmente colonie utilizzando lo strumento raschietto rullo StemPro EZPassage (Figura 1B). </li><li> Raccogliere frammenti colonia e poi centrifugare per 3 min a 115 xg per rimuovere il surnatante. </li><li> Frammenti piastra su γHFF o li elaborano per la differenziazione in corpi embrionali (EBS). </li></ol></li></ol> 2. ESC Differenziazione umanoProtocollo <ol><li> Preparare il terreno di differenziamento (DM) utilizzando Knockout DMEM supplementato con siero Hyclone 2%, 1,0% MEM non-aminoacidi essenziali, 1,0% di L-glutammina 200 mm, 1% penicillina-streptomicina, 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo. </li><li> Rimuovere medie e lavare le colonie con 2 ml di PBS. </li><li> La formazione EB di frammenti colonia in sospensione: <ol><li> Rimuovere PBS e incubare con 0.5 ml per pozzetto di caldo collagenasi IV a 1 mg / ml per 10 min a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Raccogliere i frammenti colonia in 2 ml nuovo DM e centrifugare a 115 xg per 3 min. </li><li> Li coltura in sospensione in ultra-bassa allegato 6 pozzetti (2 ml per pozzetto) per 4 giorni (Figura 1C). </li><li> Raccogliere e piastra EBS neoformati su 0,1% piastre da 24 pozzetti rivestiti di gelatina (circa 3 EBs / pozzetto) (Figura 1D). </li></ol></li><li> In alternativa, forzata aggregazione di singole cellule nel EBs usando la piastra Aggrewell: <ol><li> Rimuovere PBS edissociare le colonie nelle singole cellule utilizzando accutase (0,5 ml / pozzetto). </li><li> Centrifugare le cellule e risospendere in DM a 1.2 x 10 6 / ml. </li><li> Aggiungere 2 ml per camera Aggrewell per 1 giorno (Figura 1B &#39;). </li><li> Raccogliere EBs neoformati (Figura 1C &#39;) e piatto su 0,1% piastre da 24 pozzetti rivestiti di gelatina (circa 3 EBs / pozzetto). </li><li> Cambiare DM ogni 2-3 giorni fino alla comparsa di battere gruppi di cardiomiociti (15-30 giorni). </li></ol></li></ol> 3. Culture 3D aria-liquido di battere cluster e di etichettatura con HNPS <ol><li> Identificare e analizzare manualmente grappoli di battere cardiomiociti (Fig. 1D), di solito compaiono dopo 2-4 settimane di cultura, con una forma allungata drasticamente tagliato pipetta Pasteur. </li><li> Deposito 4 filtri in PTFE per inserto che verranno messi su una piastra da 6 pozzetti (Figura 1F). </li><li> Aggiungere 1 ml di terreno DM in cima each bene. </li><li> Aggiungi un cluster sezionato batte su ogni filtro PTFE (Figura 1E), massimo 4/well, cioè 24 aggregati per piastra (Figura 1F &#39;). </li><li> Cambiare medio DM ogni 2-3 giorni. </li><li> Per etichettare i cluster, rimuovere il filtro PTFE contenente il cluster pestaggio e metterlo su 3,5 centimetri di vetro piatto fondo (170 micron di spessore). </li><li> Aggiungere 1 ml di HNP ad una concentrazione di 50 ug / ml per 30 min. </li></ol> 4. Imaging ottico non lineare <ol><li> Preparazione del campione. Dopo l&#39;etichettatura HNP (vedi punto 3.6), trasferire sia intere che differenziano primi HeBS o cluster battito cardiaco (sezionati su comparsa di contrazione), su filtri in PTFE su un piatto fondo di vetro di spessore 170 micron compatibile con la distanza di lavoro di obiettivi di apertura numerici elevati. In alternativa, applicare un rivestimento in diretta di battere cluster per il piatto fondo di vetro pre-rivestite con 0,1% di gelatina. </li><li> Campioni di trasferimento ad unall-in-one microscopio dotato di camera di incubazione assicurare temperatura stabile, umidità e CO 2 controllo su periodi di tempo prolungati. </li><li> Ispezione iniziale, immagine dopo che il campione attraverso l&#39;imaging a grande campo sotto illuminazione a luce bianca per identificare strutture di interesse all&#39;interno EBs dissociati o cluster battitori attivi che saranno selezionati per ulteriori accertamenti. </li><li> Se autofluorescenza cellulare da NADH e SH da HNPS devono essere acquisite simultaneamente, impostare una lunghezza d&#39;onda di eccitazione laser più corta (cioè 720 nm) per abbinare l&#39;assorbimento molecolare. Utilizzare una stretta filtro passa-banda spettrale centrato a metà della lunghezza d&#39;onda di eccitazione (cioè, λ = 360 ± 10 nm) per rilevare SH, e un altro per rilevare autofluorescenza. </li><li> Innanzitutto eseguire, bassa risoluzione veloce, scansione tridimensionale per ricostruire la morfologia complessiva del cluster cardiaca e selezionare un piano dell&#39;immagine all&#39;interno del volume cluster con vari visibile HNPs. </li><li> Se necessario, modificare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione liberamente abbinare meglio le proprietà ottiche del campione o per evitare photobleaching, danni fotografia e all&#39;immagine più in profondità i tessuti con una lunghezza d&#39;onda IR (ad esempio, 790 nm) e sostituire il secondo filtro armonico di conseguenza (ad esempio, 395 nm ). Ottimizzare le impostazioni del pre-compressore impulso laser alla lunghezza d&#39;onda di lavoro di scelta massimizzando il secondo segnale armonico di HNPS depositati sul campione. </li><li> Per monitorare in tempo reale le contrazioni cardiache del cluster, impostare lo scanner ottico microscopio in modo più veloce come modo risonante, consentendo l&#39;acquisizione ad alta velocità di immagini bidimensionali. </li><li> Scegliere le impostazioni come miglior compromesso tra contrasto dell&#39;immagine e velocità di acquisizione, come ad esempio: <ul type="disc"><li> Media Scan: 4 </li><li> Pixel tempo di sosta: 0.1 msec </li><li> Tasso Image: 3.75 fotogrammi al secondo (fps) </li></ul></li><li> Potenza laser viene regolata in base alla focale punto sizzare e velocità di scansione. 50 mW (misurata all&#39;ingresso dell&#39;obiettivo) è un valore tipico per 0,1 msec pixel tempo di sosta e il piano APO 20X NA 0.75 obiettivo preservare la vitalità cellulare. </li></ol> 5. Image Analysis <ol><li> Procedura di calibrazione assiale. Selezionare un singolo HNP depositato su un substrato nudo. Regolare il fuoco (cioè la posizione assiale della nanoparticella) per massimizzare l&#39;intensità SH. Variare in modo controllato la posizione assiale della fase microscopio avere la curva di taratura relativa intensità SH in funzione del HNP disassato rispetto al piano focale. L&#39;output di questa procedura di calibrazione per il 0,75 dell&#39;obiettivo Piano APO 20X NA è riportato in Figura 4C. </li><li> Selezionare HNPS presenti in tutti i fotogrammi video e determinare i loro movimenti periodici. Questa procedura può essere facilmente automatizzato, ad esempio mediante un codice personalizzato in cerca di massimo segnale macchie di intensità in una regione definita di interesse ecollegandoli tra i diversi fotogrammi (un esempio di codice scritto in Matlab R2009 b utilizzando la funzione &#39;puntelli regione &quot;del Toolbox Image Processing è presentato). </li><li> Valutare la quantificazione dei out-of-plane spostamenti, associati HNPS non continuo rintracciabili muove lungo l&#39;asse ottico, convertendo le loro modulazioni di intensità per tutto differenti cornici in spostamento assiale utilizzando la curva di taratura nella Fase 5.1. Si noti che questa procedura permette di accedere ai movimenti assiali, ma non può essere utilizzata per determinare la direzione assoluta (verso l&#39;alto o verso il basso). </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;applicazione delle nanotecnologie alla ricerca sulle cellule staminali è un settore relativamente nuovo, ma in rapida espansione. Come sottolineato da vari articoli di rassegna sull&#39;argomento, l&#39;uso di nanoparticelle può essere applicato per realizzare diversi compiti di ricerca, che vanno dalla cella di inseguimento (sia in vitro che in vivo), alla consegna intracellulare di proteine ​​e geni, non ultimo la creazione di ambienti cellulari biomimetici per preferenziale stimolazione / inibizione de...

Sistemi di microscopia non lineari, grazie alle loro intrinseche capacità di sezionamento tre dimensioni, hanno sempre innescato la richiesta di fluorofori foto-stabile con bande di assorbimento a due fotoni nel vicino infrarosso. Solo negli ultimi due anni, per completare lo sviluppo di etichette a base di fluorescenza (coloranti, quantum dots, la conversione di nanoparticelle), una metodologia di imaging diverso ha sfruttato l&#39;uso di una nuova famiglia di nanoparticelle intrinsecamente non lineari come etichette, cioè nanoparticelle armonica (HNPS) che sono stati specificamente sviluppati per microscopia multi-fotone. Queste etichette, basati su cristalli noncentrosymmetric inorganici, esercitano contrasto ottico generando la SH della frequenza di eccitazione: per esempio convertendo una frazione di luce di eccitazione pulsata vicino infrarosso (λ = 800 nm) in luce blu visibile (λ / 2 = 400 nm) . Diversi autori nel recente passato hanno testato diversi materiali, tra cui iodato di ferro Fe (IO <sub&gt; 3) 3 1, niobato di potassio (KNbO 3) 2, il niobato di litio (LiNbO 3) 3, titanato di bario (batio 3) 4,5, potassio titanile fosfato (KTiOPO4, KTP) 6-8, e ossido di zinco (ZnO ) 5,9,10. Rispetto alle sonde fluorescenti, HNPS possiedono una serie di caratteristiche interessanti, come la completa assenza di candeggio e lampeggiante, bande di emissione strette, di eccitazione lunghezza d&#39;onda sintonizzabilità (da raggi ultravioletti a infrarossi), la capacità di reperimento di orientamento, e la risposta ottica coerente. Queste proprietà uniche sono state recentemente spiegato in due Opinione documenti completi 11,12. La possibilità di lavorare nella regione spettrale dell&#39;infrarosso, che aumenta la profondità di imaging minimizzando dispersione e l&#39;assorbimento, anche limita drasticamente foto campione degradazione 13,14. Inoltre, il segnale photo-stabile infinitamente garantito da HNPS li rende ideali per sonde di monitoraggio cella a lungo termine, che is particolarmente attraente per le applicazioni di medicina rigenerativa 15. In questo esperimento visualizzato, dettagli del protocollo sono previste per l&#39;etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane (hESC) con HNPS unfunctionalized. La sintesi e la preparazione di sospensioni colloidali è dettagliato in una precedente pubblicazione e riferimenti ivi 16 ed è oltre la portata di questo lavoro. Metodologie di indagine hESC mediante microscopia multi-fotone e la loro differenziazione in gruppi cardiaci (mantenuti culture aria-liquido lungo termine) sono presentati. ESC umana può essere lasciato per differenziare entro cosiddetti corpi embrionali (EBS) in due modi diversi, sia per la formazione di frammenti EB colonie in sospensione o, in alternativa, l&#39;aggregazione di singole cellule nel EBs utilizzando la piastra Aggrewell forzati, come illustrato nella Figura 1A . Coltura battendo ammassi di cellule cardiache in politetrafluoroetilene (PTFE) filtri porosi facilitates loro mantenimento a lungo termine per ulteriori studi (per esempio misurazioni elettrofisiologiche dei potenziali d&#39;azione). La sorgente di eccitazione del microscopio a scansione dovrebbe essere in grado di fornire impulsi ultracorti (con durata dell&#39;impulso minore di 300 fsec al campione) per raggiungere la potenza di picco necessaria per effettuare l&#39;imaging seconda armonica di HNPS. Per esempio, il fsec-source più utilizzato per l&#39;imaging sono accordabili Ti: zaffiro laser. In alternativa, altri laser ultraveloci possono essere impiegati, ad esempio, erbio ione 17, cromo forsterite 18 Ti: zaffiro pompato infrarossi oscillatori parametrici ottici. Il microscopio può essere dotata di un obiettivo con preferibilmente una piuttosto alta apertura numerica. Molto importante, prima della misura, e ogni volta che l&#39;obiettivo viene sostituito, è obbligatorio per minimizzare la dispersione presenti nel set-up (lenti) ottimizzando le impostazioni dell&#39;impulso laser pre-compressore al lavorolunghezza d&#39;onda di scelta. Questo procedimento, descritto nel protocollo, assicura che l&#39;impulso laser è il più vicino possibile alla trasformazione durata limitata (cioè più breve possibile) in corrispondenza del piano focale e massimizza la risposta di esempio non lineare. L&#39;obiettivo dell&#39;analisi dell&#39;immagine descritto alla fine del protocollo è di identificare e tracciare in movimenti 3D HNPS associati alle contrazioni ritmiche di battere cluster cardiaci. Inseguimento nanoparticelle nel piano dell&#39;immagine è semplicemente realizzato identificando le loro posizioni in fotogrammi di film successivi. Per estrarre le informazioni sul movimento assiale, una prima taratura della risposta intensità lineare in funzione dello spostamento assiale è obbligatoria. Si noti che per misurazioni a lungo termine, un controllo interferometrico attivo della posizione assiale campione è necessario per mantenere la validità della curva di calibrazione in presenza di derive termiche e / o meccaniche. I HNPS utilizzati qui per traccellule e battendo all&#39;interno degli aggregati sono basati su ossido di niobato di potassio (KNbO 3), ma altri nanomateriali lineari disponibili sono esaminati in dettaglio nel lavoro di Staedler et al 16. Le efficienze ottici non lineari della maggior parte dei nanomateriali esaminati finora sono molto simili. La scelta per KNbO 3 era essenzialmente motivata dalla buona stabilità della soluzione colloidale e la sua buona biocompatibilità, testato su diverse linee cellulari umane anche a concentrazione piuttosto elevata e lunghi tempi di esposizione 16. Data la novità del nanomateriale impiegato per questo lavoro, le principali caratteristiche del HNPS rispetto a / luminescenti bio-marcatori fluorescenti sono mostrati in una breve animazione computer originale realizzato dagli autori.

<table><tbody><tr><td>Incubatore per microscopio</td><td>OKO LAB</td><td>UNO package (stadio superiore)</td><td>37 gradi C, 5% CO2, idratato</td></tr><tr><td>Microscopio multifotone</td><td>Nikon</td><td>AR1-MP</td><td></td></tr><tr><td>Scansione rapida, quattro rivelatori descanneti non fotomoltiplicatori Filtri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SHG e autofluorescenza</td><td>Semrock</td><td>FF01-360/12-25</td><td></td></tr><tr><td>FF01-395/11-25&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FF02-485/20-25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiettivi per microscopio</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 10X</td><td></td><td></td><td>NA 0.30, WD 16 mm</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo 20X</td><td></td><td></td><td>NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td></tr><tr><td>CFI Apo 40X</td><td></td><td></td><td>NA 1.25, WD 0.18 mm &lambda; S, inibitore di Rhock del rivestimento nano-cristallino</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Siero knockout&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>1140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina 200 mM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Strumento raschiatore a rullo&nbsp;</td><td>StemPro EZPassage, Invitrogen</td><td>23181-010</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>S11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Aggrewell&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td></td></tr><tr><td>Siero Hyclone&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti&nbsp;</td><td>Piastre Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>a 24 pozzetti&nbsp;</td><td>Nunclon</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Filtri in politetrafluoroetilene (PTFE)</td><td>Inserti Millipore</td><td>NA76/25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr></tbody></table>

harmonic nanoparticelle for regenerative ricerca

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In questo esperimento visualizzato, dettagli del protocollo sono previste per l&#39;etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane (hESC) con nanoparticelle di generazione di armoniche secondo (HNPS). Questi ultimi sono una nuova famiglia di sonde recentemente introdotte per l&#39;etichettatura di campioni biologici per l&#39;imaging multi-fotone. HNPS sono in grado di raddoppiare la frequenza della luce di eccitazione dal processo ottica non lineare di generazione di seconda armonica senza alcuna restrizione sulla lunghezza d&#39;onda di eccitazione. Multi-fotone metodologie per la differenziazione hESC nei cluster cardiaci (mantenuti culture aria-liquido lungo termine) basato sono presentati in dettaglio. In particolare, viene mostrata la prova su come massimizzare l&#39;intenso seconda armonica (SH) emissione di HNPS isolati durante il monitoraggio 3D di battere tessuto cardiaco in 3D. L&#39;analisi delle immagini risultanti per recuperare modelli 3D displacement è anche dettagliata.

Prima di valutare l&#39;attività di battitura da confocale, è stata eseguita una accurata caratterizzazione della risposta ottica non lineare dei filtri in PTFE, da soli o in presenza di HNPS ad alta concentrazione (1 mg / ml). Si è assicurato che: i) il substrato nudo due fotoni di fluorescenza eccitata è molto debole e non può impedire misurazione relativi campioni biologici, e ii) l&#39;emissione SH da HNPS isolato può essere facilmente acquisita da immagini attraverso il substrato in modo epi-rilevamento (Fi...

Dettagli del protocollo sono previste per l&#39;etichettatura di cellule staminali embrionali umane in vitro con la seconda nanoparticelle generano armoniche. Metodologie di indagine hESC mediante microscopia multi-fotone e la loro differenziazione in gruppi cardiache sono anche presentati.

Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è il monitoraggio in vitro di aggregati cardiaci pulsanti derivati da cellule staminali embrionali umane, in tempo reale tridimensionale e con elevata risoluzione spaziale. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando ed espandendo le cellule staminali embrionali fino a quando formano corpi embrionari. Successivamente, gli aggregati pulsanti vengono dissezionati e seminati su filtri porosi in POLITETRAFLUORETILENE o PTFE, che permettono di mantenerli a lungo termine in condizioni di aria.Colture liquide contenenti aggregati vengono quindi marcate con nanoparticelle armoniche al fine di eseguire microscopia multiphotonica in tempo reale. I risultati ottenuti permettono l'analisi dell'elongazione spaziale e della frequenza delle contrazioni cardiache a scala microscopica. Il principale vantaggio di queste nanoparticelle è quindi che è possibile utilizzare qualsiasi lunghezza d'onda, in particolare l'infrarosso, consentendo di penetrare più in profondità nei tessuti, ed esse sono inoltre molto stabili nel tempo.Pertanto, possiamo monitorare i nostri processi a lungo termine su ampie finestre temporali. Questo metodo di coltura di cellule staminali può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della contrazione funzionale dei cardiomiociti in tre dimensioni, in particolare riguardo alla maturazione cardiaca e all'ingegneria tissutale.Coloro che si avvicinano per la prima volta a questo metodo devono essere consapevoli che la procedura di marcatura con nanoparticelle armoniche può essere utilizzata esclusivamente per la microscopia a fotoni multipli e non può essere trasferita ad altri tipi di sistemi di imaging. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di utilizzare nanoparticelle armoniche nel 2005. Queste nanoparticelle presentano vantaggi rispetto ai coloranti fluorescenti e ai punti quantici.Di fatto, il loro segnale non si attenua nel tempo e può essere utilizzato per monitorare campioni in via di sviluppo per lunghi periodi. La dimostrazione visiva della preparazione del campione è fondamentale per l'efficienza e la riproducibilità delle diverse fasi, in particolare durante la sperimentazione di farmaci, e potrebbe essere applicata anche a diversi tessuti o malattie. Modellizzazione dei tessuti.Dopo aver coltivato ed espanso le cellule staminali embrionali umane o ESC secondo il protocollo descritto nel testo e averle incubate con collagenasi calda per quattro volte per 10 minuti, raccogliere i frammenti di colonia in due millilitri di mezzo di differenziamento fresco o DM e centrifugare a 115 × g per tre minuti. Coltivare i frammenti di colonia in sospensione in piastre a sei pozzetti con superficie ultra bassa adesiva per quattro giorni, in modo che possano formare corpi embrionali o EB.Quindi piastrare gli EBS appena formati su piastre da 24 pozzetti rivestite con gelatina 0,1% per 15-30 giorni, fino alla comparsa di ammassi pulsanti. Rimuovere il PBS e, utilizzando acutus, dissociare le colonie in singole cellule dopo la centrifugazione e la risospensione, sospensando le cellule in mezzo DM e piastrando due millilitri per pozzetto. Incubare nella camera a 37 gradi Celsius per un giorno.Raccogliere gli EBS appena formati e piastrarne tre per pozzetto su piastre da 24 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1% dopo due-quattro settimane di coltura. Identificare i gruppi di cardiomiociti contrattili e, utilizzando una pipetta di vetro affilata e allungata, dissezionarli manualmente. Depositare quattro filtri in PTFE per inserto e posizionarli ciascuno in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Dopo aver aggiunto un millilitro di DM in ciascun pozzetto, posizionare un cluster battente dissezionato su ciascun filtro in PTFE. Per etichettare i cluster, trasferire i filtri in PTFE con i cluster battenti in una piastra di vetro da 3,5 centimetri con fondo in vetro. Aggiungere un millilitro di nanoparticelle per la generazione di armonica secondaria a 50 microgrammi per millilitro e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius per eseguire l’imaging ottico non lineare.Dopo aver trasferito gli HEB marcati o i cluster cardiaci in pulsazione in una camera per imaging, utilizzare un'illuminazione a campo ampio con luce bianca per identificare le strutture di interesse all'interno degli EBS differenziati o nei cluster attivamente contrattili. Eseguire una scansione tridimensionale rapida a bassa risoluzione per ricostruire la morfologia complessiva del cluster cardiaco e selezionare un piano immagine all'interno del volume del cluster contenente diverse nanoparticelle visibili di seconda armonica da monitorare in tempo reale. Le contrazioni del cluster cardiaco impostano lo scanner ottico del microscopio alla velocità massima, consentendo l'acquisizione di immagini bidimensionali a frequenza multi-hertz.Analizzare le immagini utilizzando il software MATLAB seguendo il protocollo descritto nel testo, come dimostrato qui, prima di valutare l'attività contrattile. La caratterizzazione della risposta ottica non lineare dei filtri in PTFE viene eseguita per garantire che la fluorescenza del substrato nudo ai fotoni sia molto debole e non possa impedire la misurazione dei campioni biologici rilevanti e dell'emissione da parte di elementi isolati. Le nanoparticelle di generazione di armoniche di secondo ordine possono essere facilmente acquisite mediante imaging attraverso il substrato in modalità di rilevamento epi.In questa figura, le nanostrutture a generazione di armonica secondaria marcate che evidenziano le strutture cardiache e le EBS sono mostrate nella lama. I colori rosso, giallo e verde corrispondono all'autofluorescenza del NADH, mentre i punti blu intensi di generazione di armonica secondaria derivano da nanostrutture isolate a generazione di armonica secondaria. Si noti il buon contrasto ottico e la marcatura relativamente scarsa rispetto ai punti quantici o alle nanostrutture a conversione ascendente.Questa figura illustra una vista in sezione di un aggregato cardiaco pulsante marcato con nanoparticelle a generazione di armoniche di secondo ordine. Come mostrato in questo filmato, le strutture tridimensionali vengono registrate a elevata velocità per monitorare il pattern di contrazione nella seconda cellula. Le nanoparticelle a generazione di armoniche si aggregano per mantenere un'elevata velocità di acquisizione necessaria a risolvere il movimento delle nanoparticelle.La sensibilità complessiva di acquisizione non è risultata sufficiente per registrare la autofluorescenza cellulare con emissione armonica secondaria derivante dalla generazione di armonica secondaria. L'analisi dell'immagine delle nanoparticelle effettuata sui fotogrammi del filmato indica che all'interno dello stesso ammasso cardiaco gli spostamenti sono dell'ordine di pochi micrometri e la frequenza è costante per il movimento delle nanoparticelle in e fuori dal piano della generazione di armonica secondaria. Una volta padroneggiata la tecnica di preparazione delle cellule, la dissezione dell'ammasso ottimale, la coltura all'interfaccia aria-liquido e la schiusa possono essere completate in 24-36 ore se eseguite correttamente.In particolare con questa tecnica, è necessario evitare contatti con l'aria aperta per prevenire contaminazioni. Seguendo questa procedura, è possibile applicare altri metodi come registrazioni elettrofisiologiche mediante array di elettrodi multipli al fine di rispondere a ulteriori domande scientifiche, ad esempio correlare i profili del potenziale d'azione con la frequenza di contrazione in tre dimensioni. La nostra nuova tecnica, basata sul rilevamento del segnale non lineare mediante nanoparticelle armoniche, può essere ulteriormente sviluppata per studi in vivo poiché le lunghezze d'onda utilizzate per l'imaging consentono una maggiore penetrazione nei tessuti.Uno sviluppo possibile potrebbe essere seguire l'integrazione di strutture derivate da cellule staminali per applicazioni nella medicina rigenerativa.

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