Name: Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T18:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Scopri un protocollo per valutare la rigenerazione vascolare nel sistema nervoso centrale utilizzando un modello murino di retinopatia da ossigeno. Questo metodo aiuta a studiare meccanismi di crescita dei vasi sanguigni dopo lesioni ischemiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PS detiene una Canada Research Chair in biologia delle cellule della retina e la Alcon Research Institute di New Investigator Award. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Canadian Institutes of Health Research (221.478), la Canadian Diabetes Association (OG-3-11-3329-PS), le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (418.637) e The Foundation Fighting Blindness Canada. Il sostegno è stato fornito anche dal Reseau de Recherche en Santé de la Vision du Québec.

Dichiarazione etica: Tutto sperimentazione animale rispetta le linee guida per la cura degli animali, istituito dall&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research e del Consiglio canadese delle Animal Care. 1. Ossigeno indotta retinopatia (OIR) <ol><li> Data di nascita di cuccioli di topo come P0 Record. </li><li> Registrare tutti i pesi degli animali al momento dell&#39;entrata in O 2 al fine di garantire un adeguato intervallo di peso. Nota: Per C57BL / 6 topi a P17, il peso corporeo deve essere compresa tra 5 e 7,5 g per NV massimo 32. Al fine di mantenere la coerenza ambientale, si raccomanda di utilizzare cucciolata il controllo (per i topi geneticamente modificati, così come i topi ricevere trattamenti sperimentali). Nel valutare gli effetti di un vettore virale, si deve considerare tropismo del virus e consentire un tempo sufficiente per la piena espressione dei transgeni viralmente-consegnati. Rapidamente esprimere viralevettori quali 3 lentivirus terza generazione 24, 25, 33 sono raccomandati. </li><li> Cuccioli posto del mouse a P7 (C57BL / 6 o desiderato deformazione) e una CD1 promozione madre in una camera di ossigeno a 75% O 2 per 5 giorni 27. Umidità ambiente e la temperatura sono stati mantenuti costanti per tutto O 2 esposizione. Nota: Strutture di ricerca equipaggiati con una sorgente centrale di O 2 sono ideali e limitano la sostituzione ingombrante di O 2 serbatoi vuoti. Se si lavora con transgenici o knockout topi, è importante garantire che il controllo e topi sperimentali sono acquisiti dal medesimo fornitore di limitare derive genetiche entro gli stessi ceppi 30, 29. </li><li> A P12, togliere i topi dalla camera di ossigeno e tornare animali ambient O 2. </li></ol> 2. Iniezione intravitreale per la consegna dei composti al Retina interna (WhEffetti en Valutare di un composto farmacologico o proteina ricombinante) <ol><li> A P14, anestetizzare i topi con il 2% isoflurano in ossigeno 2 L / min (o di protezione degli animali comitato approvato anestetico di scelta). Al fine di verificare l&#39;efficacia dell&#39;anestesia, in sequenza pizzicare la coda, piede posteriore e l&#39;orecchio con una pinza. </li><li> Posizionare il mouse sulla pancia. </li><li> Usando una siringa sterile 10 microlitri con ago tirato vetro smussato, eseguire una iniezione di un volume massimo di 1 ml di soluzione contenente il composto in fase di studio o veicolo (soluzione fisiologica) al limbus posteriore dell&#39;occhio, con un 45 ° angolo evitando la lente. Nota: Il vetro-ago tirato è attaccato alla siringa con una goccia di resina epossidica. </li><li> Applicare una goccia di lubrificante pomata oftalmica (idealmente con antibiotico) con un tampone per l&#39;occhio del mouse. </li><li> Ritorno il mouse torna alla gabbia con la promozione madre. I topi sono poi accuratamente controllati fino a quando recoperto e completamente ambulatoriale. </li></ol> 3. Valutazione della nave Perfusione e Barrier Function (Integrity) di angiografia con fluoresceina <ol><li> Anestetizzare i topi con il 2% isoflurano in ossigeno 2 L / min (o di protezione degli animali comitato approvato anestetico di scelta). Al fine di verificare l&#39;efficacia dell&#39;anestesia, in sequenza pizzicare la coda, piede posteriore e l&#39;orecchio con una pinza. Nota: Questo è in genere eseguita a P17 quando viene valutata la rigenerazione. Carry out anche l&#39;analisi a P19 e P21 per determinare se l&#39;integrità vascolare è conservato nel tempo. </li><li> Una volta anestetizzato, pesare il mouse. </li><li> Effettuare una incisione addominale mediana con le forbici dissezione. Nota: gli strumenti per dissezione devono essere regolarmente controllati e affilate. </li><li> Tagliare costole lateralmente e sollevare la gabbia toracica con l&#39;ausilio di pinze. Nota: È necessario tagliare lateralmente come possibile per evitare danni al cuore. </li><li> Dopo la rimozione peripHeral tessuto dal cuore, bloccare il aorta discendente con una pinza emostatica. </li><li> Iniettare lentamente fluoresceina destrano al ventricolo sinistro utilizzando un ago G 25. Nota: Se la funzione di barriera vascolare è indagato, 70 kDa fluoresceina destrano è impiegato come sarà fuoriuscire delle navi quando integrità imbarcazione è compromessa. Se l&#39;investigatore vuole lanciare vasi sanguigni, viene utilizzato 2 MDa fluoresceina destrano. Passaggi critici: 1) Per garantire una ripartizione omogenea, centrifuga fluoresceina destrano e iniettare il surnatante, 2) Al fine di prevenire la vasocostrizione, iniettare soluzione di fluoresceina destrano riscaldato, 3) Il suo tempo di circolazione non dovrebbe eccesso di 4 min. </li><li> Decapitare topi 2 minuti dopo l&#39;iniezione con le forbici operativi. </li></ol> 4. Enucleazione e la fissazione degli occhi Nota: Nel valutare i tassi di rigenerazione vascolare, in primo luogo raccogliere retine in P12 e, in aggiunta a P14 e P17. Aumentare il numero di punto temporale campionatos per la determinazione più accurata dei tassi di rivascolarizzazione 24. <ol><li> Inclinare la testa del mouse e posizionarlo su un fianco. </li><li> Togliere la pelle e le palpebre che coprono gli occhi con le forbici dissezione. </li><li> Posizionare pinze curve sotto l&#39;occhio e tirare delicatamente fino al nervo ottico è reciso. </li><li> Girare la testa del topo sull&#39;altro lato ed eseguire gli stessi passi (passi 4.2 e 4.3). </li><li> Per garantire una migliore penetrazione del fissativo, perforare un foro nella camera anteriore dell&#39;occhio utilizzando 30 ago G. </li><li> Trasferire occhi in una provetta contenente 4% paraformaldeide (PFA) e fissare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere e lavare gli occhi PFA 4 volte con una soluzione di PBS ghiacciato. </li></ol> 5. Dissezione della retina <ol><li> Mettere gli occhi di topo in una capsula di Petri contenente PBS freddo e di eseguire la dissezione delle retine sotto uno stereomicroscopio. </li><li> Rimuovere il grasso in / tessuto circostante l&#39;occhio con micro-dissezione scissors. </li><li> Tagliare la cornea con le forbici micro-dissezione. </li><li> Utilizzando due coppie di pinze, minuziosamente sbucciare la sclera lontano dalla periferia verso il nervo ottico e scartare. </li><li> Stringere la lente (sfera biancastra sotto la cornea) con una pinza ed estrarlo dalla tazza occhio. Utilizzare un paio di pinze come supporto, e l&#39;altra per afferrare e sollevare con attenzione e rimuovere la lente. </li><li> Staccare i vasi hyaloid dal lato interno della retina con piccoli pennelli (dimensione 0) e pinze. </li><li> Rimuovere fasci di navi hyaloid collegati al disco ottico utilizzando una pinza. </li><li> Trasferimento sezionato retine a 2 tubi ml microcentrifuga contenenti PBS e posto sul ghiaccio prima di avviare la procedura di colorazione. </li></ol> 6. Retina vascolare colorazione <ol><li> Incubare retine sezionato notte con delicata agitazione a 4 ° C in una soluzione di fluorescenza accoppiata isolectin B4 (rodamina-lectina o altro) in PBS contenente 1 mM CaCl 2 </sub&gt; (a 1:100 diluizione di una soluzione B4 2 mg / ml isolectin raccomandata). Durante l&#39;intera procedura di colorazione, tubi coprire con un foglio di alluminio o un foglio opaco al riparo dalla luce. </li><li> Il giorno seguente, rimuovere la soluzione colorante e lavare retine 3x in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. </li></ol> 7. Preparazione della retina Flatmounts <ol><li> Trasferire retine, fotorecettori rivolto verso il basso, su un vetrino da microscopio e fare quattro profonde incisioni radiali equidistanti con un bisturi chirurgico per dividere la retina in quattro quadranti di uguale dimensione. Durante le incisioni, rinforzare la retina con una spazzola in modo che non si muove. </li><li> Utilizzando due spazzole imbevute di PBS, appiattire con attenzione la quadranti fotorecettore lato verso il basso e immergere la retina in mezzo di montaggio per impedire fotometabolismo. Poi posizionare accuratamente un coprioggetto sulla superficie della retina montata senza applicare pressione e fare in modo che le bolle d&#39;aria non si accumulano sotto il vetrino. &lt;/ Li&gt; </ol> 8. Imaging e quantificazione dei Vasoobliteration (VO) e neovascolarizzazione (NV), come descritto in precedenza 31 <ol><li> Prendere immagini di retine intere montato con un microscopio a epifluorescenza con un ingrandimento di 10X. </li><li> Aprire l&#39;immagine retinica in software di editing fotografico, cucire insieme e misurare l&#39;area retinica totale, e la zona avascolare. Area può essere espressa in pixel. </li><li> Determinare misura di VO dividendo il numero di pixel nella zona avascolare per il numero di pixel nell&#39;area retinica totale. </li><li> Determinare misura di NV dividendo il numero di pixel di NV per il numero di pixel per la regione retinica totale come descritto 31. </li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+mechanisms+of+nerve+and+blood+vessel+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring.</a> Nature. 436, 193-200 (2005).</li>
<li>Eichmann, A., Thomas, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Parallels+between+Neural+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular Parallels between Neural and Vascular Development.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).</li>
<li>Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+vascular+development%3A+lessons+from+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Guidance of vascular development: lessons from the nervous system.</a> Circ Res. 104, 428-441 (2009).</li>
<li>Stefater Iii, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+angiogenesis+by+a+non-canonical+Wnt-Flt1+pathway+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells.</a> Nature. 474, 511-515 (2011).</li>
<li>Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+microglia+in+retinal+blood+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Potential role of microglia in retinal blood vessel formation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).</li>
<li>Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurovascular+link+in+health+and+disease%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Neuron. 71, 406-424 (2011).</li>
<li>Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+molecular+genetics+and+pathology+of+hereditary+small+vessel+diseases+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).</li>
<li>Brun, A., Englund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+white+matter+disorder+in+dementia+of+the+Alzheimer+type%3A+a+pathoanatomical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study.</a> Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).</li>
<li>Prat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+multiple+sclerosis+lymphocytes+through+brain+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium.</a> Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).</li>
<li>Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gray+matter+perfusion+correlates+with+disease+severity+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS.</a> Neurology. 74, 821-827 (2010).</li>
<li>Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy.</a> N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).</li>
<li>Hartnett, M. E., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+management+of+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and management of retinopathy of prematurity.</a> N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).</li>
<li>Sapieha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinopathy+of+prematurity%3A+understanding+ischemic+retinal+vasculopathies+at+an+extreme+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life.</a> J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).</li>
<li>Chen, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Retinopathy of prematurity.</a> Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).</li>
<li>Cheung, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy+and+systemic+vascular+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy and systemic vascular complications.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).</li>
<li>Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+the+eyes+of+a+child%3A+understanding+retinopathy+through+ROP+the+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).</li>
<li>Caballero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+vascular+damage+can+be+repaired+by+healthy%2C+but+not+diabetic%2C+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells.</a> Diabetes. 56, 960-967 (2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+STAT3+activation+inhibits+retinal+vascularization+by+down-regulating+local+erythropoietin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression.</a> Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).</li>
<li>Ritter, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+progenitors+differentiate+into+microglia+and+promote+vascular+repair+in+a+model+of+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy.</a> J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).</li>
<li>Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+NAD%28P%29H+oxidase+reduces+apoptosis+and+avascular+retina+in+an+animal+model+of+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity.</a> Mol Vis. 13, 840-853 (2007).</li>
<li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+dietary+intake+of+omega-3-polyunsaturated+fatty+acids+reduces+pathological+retinal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis.</a> Nat Med. 13, 868-873 (2007).</li>
<li>Banin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T2-TrpRS+inhibits+preretinal+neovascularization+and+enhances+physiological+vascular+regrowth+in+OIR+as+assessed+by+a+new+method+of+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).</li>
<li>Dorrell, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+retinal+astrocytes+normalizes+revascularization+and+prevents+vascular+pathology+associated+with+oxygen-induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy.</a> Glia. 58, 43-54 (2010).</li>
<li>Joyal, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+neurons+prevent+vascular+regeneration+of+neural+tissue+by+secreting+semaphorin+3A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A.</a> Blood. 117, 6024-6035 (2011).</li>
<li>Binet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+ER+Stress+Impedes+Myeloid-Cell-Induced+Vascular+Regeneration+through+IRE1alpha+Degradation+of+Netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1.</a> Cell Metab. 17, 353-371 (2013).</li>
<li>Fukushima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sema3E-PlexinD1+signaling+selectively+suppresses+disoriented+angiogenesis+in+ischemic+retinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice.</a> J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+retinal+vaso-obliteration+and+neovascularisation+in+the+oxygen-induced+retinopathy+%28OIR%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).</li>
<li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%3A+a+model+of+vessel+loss%2C+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+retina+as+an+angiogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The mouse retina as an angiogenesis model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+quantification+of+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Computer-aided quantification of retinal neovascularization.</a> Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Weight+Gain+Modifies+Severity+and+Functional+Outcome+of+Oxygen-Induced+Proliferative+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy.</a> Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).</li>
<li>Cerani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-Derived+Semaphorin+3A+is+an+Early+Inducer+of+Vascular+Permeability+in+Diabetic+Retinopathy+via+Neuropilin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1.</a> Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).</li>
<li>Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyeing+central+neurons+in+vascular+growth+and+reparative+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis.</a> Blood. 120, 2182-2194 (2012).</li>
<li>Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+manifestations+of+postnatal+hyperoxia+on+the+retinal+structure+and+function+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).</li>
<li>Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+oxygen+and+light+on+the+structure+and+function+of+the+neonatal+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina.</a> Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).</li>
<li>Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis%2C+angiogenesis%2C+and+MRI+indices+of+functional+recovery+from+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke.</a> Stroke. 38, 827-831 (2007).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+improved+cerebral+blood+flow+in+the+ischemic+boundary+area+detected+by+MRI+after+administration+of+sildenafil+to+rats+with+embolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke.</a> Brain Res. 1132, 185-192 (2007).</li>
<li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy%3A+from+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).</li>
<li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).</li>
<li>Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+selection+for+different+mtDNA+genotypes+in+heteroplasmic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice.</a> Nat Genet. 16, 93-95 (1997).</li>
<li>Mattapallil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rd8+mutation+of+the+Crb1+gene+is+present+in+vendor+lines+of+C57BL%2F6N+mice+and+embryonic+stem+cells%2C+and+confounds+ocular+induced+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmolog.%2C+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes.</a> Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qual è il modo più efficace per stimolare la crescita di nuovi vasi sani in tessuto nervoso ischemico? È terapeuticamente valida per interferire e accelerare naturalmente ricrescita vascolare? In patologie neuro-ischemica, quali retinopatie ischemiche o ictus, la degenerazione vascolare è associata a una ridotta funzione neuronale 35-38. Quindi, per contrastare il pregiudizio presto, ripristinando regionale micro-circolazione durante il segmento immediato / precoce della malattia può rivelarsi utile. In un co...

Nel corso dello sviluppo del sistema nervoso centrale, nervi, cellule immunitarie e vasi sanguigni istituire reti notevolmente accoppiati per garantire un&#39;adeguata perfusione tissutale e consentire la trasmissione delle informazioni sensoriali 1-5. La ripartizione dei sistemi vascolari risultati dell&#39;ossigenazione tessutale insufficiente e fornitura metabolica compromesso ed è sempre più riconosciuto come un fattore importante per la patogenesi delle malattie neurodegenerative 6. Dropout vascolare e il deterioramento dell&#39;unità neurovascolare all&#39;interno del cervello, per esempio, è associato con demenza vascolare, lesioni vascolari della materia bianca del cervello 7 e il morbo di Alzheimer con stenosi delle arteriole e piccole imbarcazioni 8. Inoltre, alterata funzione barriera vascolare è pensato per contribuire sclerosi multipla 9 e sclerosi laterale amiotrofica 10. Di rilevanza diretta per il modello retinica descritto in questo protocollo, accecantemalattie come la retinopatia diabetica 11 e retinopatia della prematurità 12, 13 sono caratterizzati da una fase precoce degenerazione vascolare. Lo stress ischemico conseguente sulla retina neurovascolare innesca una seconda fase di eccessiva e patologica neovascolarizzazione che probabilmente nasce come risposta compensatoria a ripristinare ossigeno e fornitura di energia 14-16. Una strategia attraente per superare lo stress ischemico che è fondamentale per la progressione della malattia è ripristinare reti vascolari funzionali specificamente nelle zone ischemiche del neuro-retina (figure 2 e 3). Provocando una risposta angiogenica controllata può venire attraverso come contro-intuitivo per una condizione in cui i trattamenti anti-angiogenici come anti-VEGF sono considerati trattamenti adattati. Eppure, la prova della validità di questo approccio è il montaggio. Ad esempio, aumentando &quot;fisiologica-like&quot; ricrescita vascolare in ischemretinopatie ic è stato elegantemente dimostrata attraverso l&#39;introduzione di cellule precursori endoteliali 17, l&#39;inibizione del VEGF Müller-cell espresso down-regulation indotta da altri fattori angiogenici 18, iniezione di progenitori mieloidi 19, l&#39;inibizione della NADPH ossidasi apoptosi indotta 20, aumentando la dieta ω-3 acidi grassi polinsaturi assunzione di acido 21, il trattamento con un frammento carbossi-terminale del triptofano tRNA sintetasi 22, e somministrazione diretta di VEGF o FGF-2 per la protezione delle cellule gliali 23. Inoltre, abbiamo dimostrato che la modulazione classici spunti di orientamento neuronali quali Semaforine o netrins in retinopatie ischemiche accelera la rigenerazione vascolare dei vasi sani all&#39;interno della retina e di conseguenza riduce angiogenesi patologica 24, 25. Di rilevanza clinica diretta, molti degli studi sugli animali di cui sopra forniscono la prova che la promozione re vascolaregenerazione durante la prima fase ischemica delle retinopatie può ridurre significativamente vista minacciando neovascolarizzazione retinica pre-19, 23, 24, 26, probabilmente attraverso la riduzione degli oneri ischemica. L&#39;elaborazione di strategie terapeutiche che stimolano la rigenerazione dei vasi funzionali rimane una sfida significativa per biologi vascolari. Qui si descrive un sistema sperimentale che utilizza il modello murino di ossigeno indotta retinopatia (OIR) per esplorare le strategie per modulare la ricrescita vascolare all&#39;interno della retina. Sviluppato da Smith et al. Nel 1994 27, questo modello funge da proxy per retinopatie proliferative umane e consiste nell&#39;esporre cuccioli di topo P7 al 75% O 2 fino a P12 e successivamente re-introdurre i cuccioli di ambiente della stanza O 2-tensione (Figura 1). Questo paradigma imita vagamente uno scenario in cui un neonato prematuro è ventilatocon O 2. L&#39;esposizione dei cuccioli di topo all&#39;iperossia provoca la degenerazione dei capillari retinici e microcircolo, e produce una superficie riproducibile di vaso-obliterazione (VO) in genere valutato caso di uscita dal O 2 a P12, anche se zona VO massima è raggiunta a 48 ore (P9) dopo esposizione a O 2 28. Nel topo, le zone VO avascolari rigenerano spontaneamente nel corso della settimana successiva reintroduzione di aria ambiente ed eventualmente zone VO sono completamente ri-vascolarizzati (Figura 2). Reintroduzione di aria ambiente di topi sottoposti a OIR provoca anche neovascolarizzazione pre-retinica (NV) (massimo a P17) che è in genere valutata per determinare l&#39;efficacia di paradigmi di trattamento anti-angiogenici. Nella sua forma più pura, il modello OIR fornisce uno strumento altamente riproducibile e quantificabile per valutare la degenerazione vascolare indotta da ossigeno e determinare l&#39;entità del distruttiva neovascolarizzazione pre-retinica 29-31. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Diversi paradigmi di trattamento esplorative che modulano la rigenerazione vascolare del SNC può essere studiato utilizzando il modello OIR compreso l&#39;uso di composti farmacologici, terapia genica, delezione genica e altro ancora. La propensione di un determinato approccio di influenzare la ricrescita vascolare è valutata graduale nella finestra tra P12 (VO massimo dopo l&#39;uscita da iperossia) e P17 (NV massima). Valutazione del risultato del trattamento su NV patologica può essere rapidamente e facilmente determinato in parallelo ed è stato accuratamente descritto da Stahl e colleghi 30, 31. Qui forniamo una semplice procedura step-by-step per studiare la modulazione di rivascolarizzazione fisiologico all&#39;interno della retina neurale da composti farmacologici, potenziali terapie, vettori virali o di studiare l&#39;influenza dei geni candidati in transgenici o knockout mice.

<table><tbody><tr><td>Topi C57Bl/6 (possono essere utilizzati altri ceppi; la risposta angiogenica varia da un ceppo all'altro)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 madri che allattano</td><td>Fornitore di scelta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici operatorie dritte World</td><td>Precision Instruments</td><td>14192</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione dritte</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per gli occhi Vannas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8483</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per iris, curve, seghettate</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>Spazzole 362R misura 0</td><td>Dynasty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pieps #3; diritte</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338</td><td></td></tr><tr><td>lama chirurgica, misura 10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>RL-1102</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 Microscopio a fase invertita e fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ9.5 Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina isoticianato-destrano, 70000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of vascular rigenerazione nel snc utilizzo del retina mouse

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

La retina roditore è forse il sistema mammiferi più accessibile in cui indagare interazione neurovascolare all&#39;interno del sistema nervoso centrale (CNS). È sempre più riconosciuto che diverse malattie neurodegenerative come l&#39;Alzheimer, la sclerosi multipla e la sclerosi laterale amiotrofica presentano elementi di compromissione vascolare. Inoltre, le cause più importanti di cecità nella popolazione in età pediatrica e di lavoro (retinopatia della prematurità e la retinopatia diabetica, rispettivamente) sono caratterizzate da degenerazione vascolare e il fallimento di fisiologica ricrescita vascolare. Lo scopo di questo documento tecnico è quello di realizzare un protocollo dettagliato per studiare la rigenerazione vascolare CNS nella retina. Il metodo può essere impiegato per chiarire i meccanismi molecolari che portano al fallimento di crescita vascolare dopo la lesione ischemica. Inoltre, i potenziali modalità terapeutiche per accelerare e ripristinare plessi vascolari sani possono essere esplorati. Giudizio richiederlod utilizzando l&#39;approccio descritto può prevedere vie terapeutiche per retinopatie ischemiche come quella del diabete o prematurità ed eventualmente beneficiare di altri disturbi vascolari del sistema nervoso centrale.

Il modello OIR è ampiamente utilizzato per studiare indotta da ossigeno degenerazione vascolare e neovascolarizzazione patologica indotta da ischemia nella retina ed è stato fondamentale nello sviluppo di attualmente impiegati trattamenti antiangiogenici per le malattie oculari 27, 29, 30. I risultati ottenuti con questo modello possono essere liberamente estrapolati per retinopatie ischemiche come la retinopatia diabetica proliferativa e la retinopatia della prematurità 30. <p class="jove_cont...

La retina roditore è da tempo riconosciuta come finestra accessibile al cervello. In questa nota tecnica fornendo un protocollo che utilizza il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno per studiare i meccanismi che portano al fallimento di rigenerazione vascolare nel sistema nervoso centrale dopo lesione ischemica. Il sistema descritto può anche essere sfruttata per esplorare le strategie per promuovere la ricrescita dei vasi sanguigni funzionali all&#39;interno della retina e del SNC.

Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

L'obiettivo generale di questa procedura è esplorare strategie per favorire la rigenerazione di vasi sanguigni funzionali nella retina e nel sistema nervoso centrale dopo un danno ischemico. Questo viene raggiunto utilizzando innanzitutto un modello murino di retinopatia indotta dall'ossigeno. Successivamente, composti vengono somministrati all'occhio mediante iniezioni intravitreali.La perfusione del vaso e la funzione di barriera vengono quindi verificate mediante angiografia con fluoresceina. L'ultimo passaggio consiste nell'estrarre l'occhio e isolare la retina. Successivamente, la retina viene colorata, montata e sottoposta a imaging.Infine, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per valutare i tassi di rigenerazione vascolare dopo trattamenti intravitreali o in topi con modificazioni genetiche. La tecnica che presentiamo offre un sistema altamente riproducibile e semplice per valutare la rigenerazione vascolare all'interno del sistema nervoso centrale. Si basa sul modello di retinopatia indotta dall'ossigeno di Smith e può risultare molto utile nella progettazione di strategie terapeutiche per correggere l'ischemia nel sistema nervoso centrale.Questo metodo può

assessment-of-vascular-regeneration-in-the-cns-using-the-mouse-retina

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocoltura di neuroni gangliari retinici di ratto assotomizzati con glia inguainante olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assonale adulta. J. Vis. Exp. (2020).Questo video dimostra l'imaging e la quantificazione della rigenerazione assonale in neuroni gangliari retinici di ratto axotomizzati (RGN) co-coltivati con cellule gliali di rivestimento olfattivo umano immortalizzate. Gli RGN sono immunomarcati, con soma rossi e assoni verdi. Le immagini...

Imaging e quantificazione della rigenerazione assonale nei neuroni del ganglio retinico di ratto assotomizzati

La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in...

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Questo video illustra un metodo, utilizzando un clinico 3 scanner T, per contrasto-enhanced RM del mouse ingenua proiezione visiva e per studi ripetitivi e longitudinali in vivo di degenerazione del nervo ottico associati a lesioni acute ottico schiacciamento del nervo e la degenerazione del nervo ottico cronica topi knock-out (p50 KO).

In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

Gli strumenti utilizzati per visualizzare la rigenerazione vascolare richiedono metodi per contrastare gli alberi vascolari. Questo film ha dimostrato una delicata tecnica di iniezione utilizzata per ottenere un contrasto ottimale degli alberi vascolari e illustra i potenziali benefici derivanti da un'analisi dettagliata del campione risultante utilizzando μCT e sezioni istologiche seriali.

Visualizzazione dei Vascolare e parenchimale rigenerazione dopo il 70% epatectomia parziale in topi normali

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione e la colorazione con immunofluorescenza dei supporti piatti retinici dei topi e l'analisi. Anche l'uso della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) per i cuccioli di topo e l'elaborazione delle immagini sono descritti in dettaglio.

Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Questo articolo descrive un saggio di colorazione lectina ben consolidato e riproducibile per l'intero monte di preparati retinici e i protocolli necessari per la misurazione quantitativa di parametri vascolari frequentemente alterati nelle retinopatie proliferative e non proliferative.

Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Qui, presentiamo tre protocolli di analisi dei dati per l'angiografia fluoresceina (FA) e le immagini di tomografia a coerenza ottica (OCT) nello studio dell'occlusione venosa retinica (RVO).

In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

Questo protocollo descrive un modo semplice ed economico per quantificare l'attività del cis-elementi normativi (ad esempio, enhancer / promoter), nel vivere retine del mouse tramite elettroporazione espianto. Preparazione di analisi del DNA, la dissezione della retina, elettroporazione, cultura espianto della retina, e post-fissazione e la quantificazione sono descritti.

Quantificare le attività di Cis-Regolamentazione Elementi nella retina di topo Elettroporazione Espianto

In questo articolo introduciamo veloce micro-ionoforesi di neurotrasmettitori come tecnica per studiare l'integrazione di segnali post-sinaptici con elevata precisione spaziale e temporale.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

Scopri un protocollo per valutare la rigenerazione vascolare nel sistema nervoso centrale utilizzando un modello murino di retinopatia da ossigeno. Questo metodo aiuta a studiare meccanismi di crescita dei vasi sanguigni dopo lesioni ischemiche.

Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

Esplora altri video