Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire l'iniezione di cellule muoiono, o DNA in cuori di topo embrionali. Al fine di studiare il grasso cellulare o di manipolare localmente l'espressione genica, ciò si ottiene sezionando prima gli embrioni di un topo gravido ed esponendo il cuore embrionale. Successivamente, il colorante o le cellule del DNA vengono iniettati nella regione di interesse mirata nel cuore.

Quindi, dopo che l'embrione è stato incubato, il cuore viene rimosso e posto in coltura. Infine, il destino delle cellule iniettate o marcate viene determinato tramite microscopia. In definitiva, il destino delle cellule iniettate, marcate o geneticamente modificate viene monitorato mediante microscopia confocale o microscopia a luce ed epifluorescenza, rivelando l'importanza funzionale di geni e cellule specifici durante lo sviluppo cardiaco.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la transgenesi nel topo, è che possiamo iniettare localmente e accuratamente cellule di laboratorio o modificare geneticamente in vivo. Ciò consente l'indagine di queste cellule nell'ambiente appropriato. A dimostrare questa procedura saremo io ed Emily Aar, una dottoranda di un laboratorio.

Dopo aver preparato l'attrezzatura, i reagenti e le soluzioni, secondo il protocollo di testo, raccogliere gli embrioni E 9.5 ed E 10.5 da una topolina gravida soppressa utilizzando prima il 70% di etanolo per sterilizzare il torace, praticare un'incisione ventrale sulla linea mediana per aprire l'addome e recuperare il corno uterino prima di trasferirlo in PBS a temperatura ambiente. Dopo altri due lavaggi in PBS, trasferirlo in una piastra di Petri riempita di silicone. Con M 16 medium, utilizzare spilli per insetti per fissare il corno uterino allo strato di silicone in modo che il lato vascolarizzato dell'utero sia sottostante.

Quindi usa una pinza fine per tagliare la superficie dell'utero e tappare il deciduo a un millimetro sotto la superficie. Allargare le pareti della decidua e recuperare delicatamente l'embrione nel sacco vitellino. Conservarlo in M 16, a temperatura media a 37 gradi Celsius prima dell'iniezione cellulare per eseguire le iniezioni.

Per prima cosa, utilizzare una siringa Hamilton per riempire una pipetta di vetro dal retro con DNA o cellule e agitare la pipetta per rimuovere le bolle. Sulla punta, posizionare la pipetta sul supporto per microiniezione e impostare l'iniettore in base alle seguenti impostazioni. Quindi, appunta l'embrione sul fondo di silicone attraverso il sacco vitellino senza toccare l'embrione vero e proprio.

Quindi identifica la regione del cuore e apri il sacco appena sopra questa regione. Aggiungi quattro perni attorno all'embrione per evitare qualsiasi movimento durante l'iniezione di cellule. Utilizzando il micromanipolatore impostato su manuale, posizionare lentamente la punta della pipetta con un angolo di 45 gradi sopra il pericardio, appena sopra la regione del cuore da iniettare.

Spostare la pipetta nella regione di interesse, attivare l'iniezione ed estrarre la pipetta il più rapidamente possibile. Assicurarsi che il cuore batta correttamente dopo l'iniezione di DNA o cellule Utilizzando il protocollo di iniezione descritto in questo video per studiare la transizione da epiteliale a mesenchima ed E 9,5 A VC explan è stato iniettato con un S-H-R-N-A che sottoregola una proteina necessaria per la transizione mesenchimale endoteliale delle cellule endocardiche. L'embrione di controllo è stato iniettato con un vettore dorsale vuoto, allo stesso modo, le cellule endoteliali prevalvolari derivate da cellule HUES che esprimono GFP sotto il controllo del promotore SOX nove sono state iniettate nell'A VC a E 10.5, seguite da 48 ore di coltura cardiaca espiantata.

Queste cellule acquisiscono marcatori di EMT, come la periostina, simili alle cellule endocardiche endogene. Gli approcci ex vivo qui dimostrati sono relativamente facili, ma limitati a un follow-up massimo a breve termine da 48 a 72 ore. Tuttavia, la procedura di iniezione ecoguidata descritta nel protocollo di testo fornisce un approccio tecnicamente più impegnativo, ma con l'opzione di un lungo follow-up in utero anche postnatale.

Qui viene mostrata l'iniezione in utero di coloranti o vettori virali per marcare le cellule in specifiche regioni cardiache. Con questo metodo, è possibile ottenere una marcatura specifica delle cellule epicardiche con coloranti fluorescenti o virus e il metodo può essere ampliato con cellule o iniettabili alternativi. Seguendo questa procedura è possibile eseguire un metodo come la coltura bryo per rispondere a ulteriori domande come l'effetto a lungo termine di un gene, una molecola o la lettura di un lungo elenco, come la morfogenesi dei tessuti dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo cardiaco e della genetica. Ci permette di esplorare il mondo dei nuovi geni e di studiare il destino delle cellule umane nel giusto contesto embrionale. Questo è molto utile quando non è disponibile una linea di topi transgenici.