Terapia cellulare per insufficienza cardiaca nel ratto: Doppia Toracotomia per infarto miocardico e epicardico impianto di cellule e Biomatrix

Lo scopo di questa procedura è quello di eseguire una doppia toracotomia sui ratti al fine di eseguire la legatura coronarica e l'applicazione epicardica. Ciò si ottiene eseguendo prima una toracotomia nel quarto spazio intercostale. Successivamente, viene legata l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra o LAD.

Quindi una seconda toracotomia viene eseguita due settimane dopo nel quinto spazio intercostale. Infine, le cellule e la matrice vengono applicate sulla superficie del cuore pulsante infartuato. Infine, l'ecocardiografia viene eseguita per valutare la funzione cardiaca e l'istologia viene eseguita mediante misurazioni delle dimensioni dell'infarto.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la sternotomia è che si tratta di un approccio minimamente invasivo che dimostra che la procedura sarà e ine Lopez ha inviato collaboratori dal nostro laboratorio. Tutti gli animali sono stati trattati nel rispetto delle raccomandazioni della F-E-L-A-S-A e della legge svizzera sulla protezione degli animali. Dopo aver dissanguato un ratto e isolato e pulito le ossa del femore secondo il protocollo di testo, usa le forbici per tagliare entrambe le punte delle ossa.

Quindi, per lavare il midollo osseo, iniettare PBS sterile nel nucleo dell'osso e raccogliere il midollo in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare il midollo osseo raccolto per sette minuti a 300 volte G.Rimuovere il supinato con tre millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi. Sospendere il pellet, incubare la sospensione per un minuto a temperatura ambiente prima di centrifugare nuovamente per sette minuti a 300 volte G dopo la risposta.

Sospensione del pellet in terreno di coltura sterile. Aggiungere ulteriore terreno di coltura cellulare in un pallone di coltura da 150 millilitri e seminare le cellule il secondo giorno di incubazione. Cambiare il terreno per rimuovere le cellule non aderenti e continuare a sostituire il terreno ogni due giorni per due o tre settimane fino a raggiungere la densità cellulare desiderata.

Per eseguire la prima toracotomia T, iniziare pesando il ratto e impostare i parametri del ventilatore di conseguenza. Il deflusso di ventilazione viene definito automaticamente. Quindi radere la parte sinistra del torace, accendere un termoforo e impostarlo a 37 gradi Celsius.

Dopo aver anestetizzato il ratto secondo il protocollo di testo, eseguire un pizzicamento della punta o della coda prima di posizionare il ratto sul termoforo in posizione supina utilizzando un catetere IV calibro 14, intubare l'animale, quindi collegare il catetere per intubazione a un ventilatore per roditori. Programmato per 2,5 litri al minuto di ossigeno, 2,5% di fluoro, un volume corrente di due millilitri e una frequenza respiratoria di 90 respiri al minuto. Dopo aver preparato una siringa con buprenorfina 0,1 milligrammi per chilogrammo per via sottocutanea, iniettare un terzo della soluzione, quindi utilizzare la soluzione di betadina all'1% per disinfettare l'area.

Successivamente, incidere la pelle perpendicolarmente allo sterno del quarto spazio intercostale e separare i tre strati del muscolo toracico. Quindi aprire il quarto spazio intercostale tra le costole quattro e cinque. Usa un piccolo divaricatore per allargare le costole ed esporre il cuore.

Quindi aprire con cautela il pericardio e individuare l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra o LAD, e utilizzare una sutura 7.0 per legarla quattro millimetri sotto l'atrio. Quindi controlla il cambiamento di colore dell'area ischemica con tre punti di sutura zero posizionati approssimativamente e distalmente dallo sterno. Realizzare due punti da utilizzare per chiudere lo spazio intercostale.

Stringere la sutura distale. Clamp il tubo di scarico del ventilatore per due secondi per gonfiare il torace ed evitare lo pneumotorace. Quindi stringere la seconda sutura.

Riposiziona gli strati muscolari in posizione. Quindi utilizzare cinque punti di sutura zero per chiudere la pelle con la soluzione di betadina all'1%. Disinfettare la sutura e iniettare la soluzione di buprenorfina rimanente.

Spegnere il sistema di anestesia e rimuovere il catetere per intubazione. Tenere il ratto in una gabbia sotto una lampada calda per una o due ore prima di rimetterlo in un'unità IVC. Due settimane dopo la prima toracotomia, la guarigione è completa e una cicatrice è appena visibile.

Seguendo la procedura descritta in precedenza in questo video per preparare il ratto all'intervento chirurgico, incidere la pelle perpendicolarmente allo sterno nel quinto spazio intercostale. Separare i tre strati del muscolo e aprire il quinto spazio intercostale tra le costole cinque e sei. Usa un piccolo divaricatore per allargare le costole ed esporre il cuore.

Se c'è una certa aderenza, usa una pinza fine per alleviarla con cura. Quindi, individua l'area dell'infarto che appare come un'area pallida sotto la legatura. Se necessario, inserire un pezzo di sutura a sette zero di 10 centimetri all'apice e tirarlo delicatamente per visualizzare meglio il ventricolo sinistro.

Quindi applicare cellule e matrice sulla superficie dell'area ischemica del cuore. Dopo la pellettatura, quattro volte 10 alle sei cellule come indicato nel protocollo di testo, depositare la tavolozza sul cuore prima di utilizzare un sigillante di fibrina per coprirlo. Lo strato di colla fissa le cellule alla superficie del cuore.

Dopo aver rimosso il pezzo di sutura dalla posizione dell'apice, gli strati muscolari tornano in posizione suturano e disinfettano l'animale. Come dimostrato in precedenza nel video, come mostrato qui. Dopo l'intervento chirurgico, gli animali hanno perso peso e si sono ripresi rapidamente prima di aumentare di peso indipendentemente dal trattamento applicato Come dimostrato in questo grafico di Kaplan, il tasso di sopravvivenza è elevato dopo la prima toracotomia a T, gli animali trattati con fibrina e/o cellule hanno dimostrato tassi di sopravvivenza inferiori rispetto ad altri gruppi, come si vede in questo grafico.

Tuttavia, i tassi di sopravvivenza globale sono rimasti alti dopo un secondo. La toracotomia e la funzione cardiaca del trattamento sono state valutate mediante ecocardiografia. Queste immagini rappresentative in modalità M per animali sani e infartuati illustrano che la contrattilità della parete ventricolare sinistra è stata abolita due settimane dopo la legatura LAD, l'accorciamento frazionario è stato registrato due settimane dopo la lazione LAD su un totale di 104 animali.

La distribuzione di frequenza mostra metodi ragionevolmente riproducibili con un coefficiente di variazione del 17%Questa figura rappresenta graficamente la funzione cardiaca mediante la frazione di eiezione misurata due e sei settimane dopo la lazione LAD La funzione cardiaca continua a diminuire durante questo periodo di tempo. Anche il rimodellamento cardiaco si verifica durante questo periodo ed è qui rappresentato da un aumento dei volumi di LV registrati sia nella sorella che nella diastole. Infine, la colorazione dorata sulle sezioni cardiache ha rivelato che il tessuto fibrotico e infine una cicatrice transmurale si sono sviluppate sei settimane dopo la legatura LAD. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30-40 minuti se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una doppia toracotomia minimamente invasiva.