Name: BEST: Barcode Enabled Sequencing di tetradi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Scopri il metodo BEST per l'analisi automatizzata di tetradi di lievito utilizzando il fluorescence-activated cell sorting. Questa tecnica migliora l'efficienza nella generazione di progenie ricombinanti mantenendo le informazioni di lignaggio.

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Questo lavoro è stato supportato da un NIH / NHGRI Genome Scholar / Facoltà Transition Award (K22 HG002908) di AMD e un partenariato strategico tra l&#39;Institute for Systems Biology e l&#39;Università di Lussemburgo. Le richieste di ceppi o plasmidi devono essere indirizzate al Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

1. Strain Costruzione e Caratterizzazione <ol><li> Costruire il ceppo diploide eterozigote per essere utilizzato in croce accoppiando ceppi aploidi e diploidi selezionando 2 o utilizzando un ceppo eterozigote naturale. I ceppi non deve ospitare GFP. </li><li> Verificare che il ceppo è in grado di crescere su YPD 2 + 200 mg / ml G418. </li><li> Verificare che il ceppo è in grado di sporulare. BEST è compatibile con i bassi sporulazione croci di efficienza, ma aumenta la frequenza bassa sporulazione FACS tempo di smistamento richiesto. <ol><li> Creare una cultura O / N del ceppo in 5 ml YPD e crescere con agitazione a 30 ° C. </li><li> Lavare 0,5 ml di coltura O / N tre volte con PBS (pH 7,4). </li><li> Agglomerare le cellule lavate, rimuovere il supernatante, e risospendere in 2 ml di mezzo di sporulazione 7. </li><li> Agitare cellule a RT e controllare quotidianamente per la formazione tetrade utilizzando un microscopio ottico a contrasto di fase con un obiettivo 40X. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Stimare la vitalità spore della croce da dissezione convenzionale 2,3 di un piccolo numero (~ 20) di tetradi. Redditività Spore in incroci tra diversi contesti di deformazione è molto variabile e imprevedibile. Tuttavia, a priori le aspettative di redditività spore possono essere utilizzati per valutare l&#39;efficienza di un BEST esperimento prima della manodopera-e costose misure di risparmio e di genotipizzazione dei ceppi. Pertanto, questo passaggio è altamente raccomandato. </li></ol> 2. Trasformazione di diploidi con Biblioteca di Barcoded plasmidi <ol><li> Inserire il plasmide codice a barre pCL2_BC nel ceppo diploide eterozigote utilizzando il protocollo trasformazione descritta in Gietz e Woods 8 con le seguenti modifiche. <ol><li> Dopo le cellule sono state incubate con la miscela trasformazione a 30 ° C per 20 minuti, aggiungere DMSO all&#39;8% del volume della miscela trasformazione. Aggiunta di DMSO è stato trovato per migliorare l&#39;efficienza di trasformazione in alcuni sfondi di deformazione 9. </li><li> Dopo lo shock passo calore, agglomerare le cellule con una breve centrifugazione, decantare la miscela di trasformazione, e lavare delicatamente le cellule in YPD. Poi, risospendere le cellule in 1 ml YPD e consentirne il recupero a temperatura ambiente per 3 ore senza agitazione. </li></ol></li><li> Selezionare trasformanti mediante placcatura sul YPD + G418 (200 mg / ml) piastre di agar. Per garantire una piscina complesso di codici a barre plasmide, raccogliere un gran numero di colonie, ad esempio 5 piastre con ~ 2.500 colonie per piastra. </li><li> Una volta che le colonie sono visibili (2-3 giorni di crescita a 30 ° C), piscina trasformanti da loro raschiando delicatamente la piastra in liquido YPD + G418 (200 mg / ml) + 15% di glicerolo. Vortex la sospensione cellulare, il trasferimento di una fiala crioconservazione, e congelare a -80 ° C. Fai un magazzino separato congelato per ogni piatto. Questi stock congelati servono come ceppi di partenza per Passo 3.1 e possono anche essere utilizzati per generare più tetradi in un momento successivo, se desiderato. </li&gt; </ol> 3. Sporulanti la Biblioteca di cellule trasformate ottenere Barcoded tetradi <ol><li> Ravvivare cellule dalle scorte congelate creati in 2.3 dalla crescita O / N in 5 ml YPD + G418 (200 mcg / ml) a 30 ° C con agitazione. </li><li> Lavare le cellule dalla O / N culture 3x in PBS (pH 7,4) e poi risospendere le cellule in sporulazione medio 7 più 200 mcg / ml G418. </li><li> Agitare culture sporulazione a RT e monitorare i progressi sporulazione tutti i giorni fino nuovi tetradi hanno smesso di formatura. </li><li> Una volta che la cultura contiene tetradi ben formate e relativamente pochi diadi, rimuovere le culture dall&#39;agitazione e lasciare a temperatura ambiente per almeno 7 giorni. Mentre alcuni ibridi possono essere suscettibili di sul piatto la digestione e la rottura appena tetradi si sono formate (valutata come descritto in 7.3), l&#39;incubazione supplementare (7-10 giorni nostri esperimenti) è essenziale per altre croci. Pertanto, questo passaggio è altamente raccomandato. </li></ol> 4. Stabilireil FACS Cancelli per Tetrad ordinamento Il meiotically espresso SPS2-GFP fusione sul plasmide pCL2_BC permette tetradi nella cultura sporulazione da rilevare e isolato dalla coltura mediante fluorescenza. Il seguente protocollo è stato sviluppato per un FACSAria II. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. FACS cancelli. Una serie di quattro porte sequenziali è utilizzato per isolare tetradi. I cancelli in (A) e (B) di ridurre il numero di ciuffi. Eventi fluorescenti vengono selezionati con il cancello in (C). L&#39;istogramma in (D) presenta due picchi. Eventi a picco sinistra sono principalmente tetradi (immagine riquadro a sinistra), e gli eventi nel picco destra sono generalmente tetradi con una gemma allegato (immagine riquadro a destra). Un cancello finale èapplicato a questo istogramma per selezionare gli eventi che sono per lo tetradi (barre rosse). Questa cifra è stata modificata da Ludlow, et al 1. <ol><li> Caricare la cultura sporulata su un sorter FACS e impostare due vincenti e scatter laterale cancelli in avanti per escludere detriti, cellule clumped, e più cellule per droplet (Figure 2A e 2B). </li><li> Ci dovrebbe essere una popolazione di cellule fluorescenti, che quando si utilizza il costrutto reporter SPS2-GFP includono diadi e tetradi 10. Porta la GFP vs FSC per includere questi eventi fluorescenti (Figura 2C). </li><li> A seconda del contesto ceppo può essere necessario includere un cancello supplementare per rimuovere i grumi che includono tetradi e altre cellule. Se questo è necessario, ispezionare un istogramma FSC degli eventi fluorescenti e specificare un cancello che comprende eventi con bassa FSC (Figura 2D, eventi gated sono in rosso). </li><li> Controllare l&#39;efficienza di t<html> egli gating regime di classificare ~ 1.500 tetradi su un vetrino da microscopio e contando la percentuale di tetradi ai non tetradi utilizzando un microscopio a contrasto di fase a 400X. La percentuale di tetradi può essere stimata con precisione contando solo ~ 200 eventi filtrate, ma classificare ~ 1500 riduce la quantità di tempo dedicato alla ricerca di cellule sul vetrino da microscopio. In alternativa, il rapporto di tetradi a non tetradi può essere valutata durante il Passo 4.5. </li><li> Controllare periodicamente che la selezionatrice viene accuratamente riporta il numero di eventi di classificare 25 tetradi su un vetrino da microscopio e dall&#39;esame delle cellule contenute nella gocciolina utilizzando un microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 400X. Ci dovrebbe essere di 25 tetradi nel droplet. Ripetere 3-4x valutare la varianza dello strumento FACS. </li></ol> 5. Ordinamento tetradi su una piastra di agar p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Posizionamento della piastra di agar sul sorter FACS. Per ordinare tetradi in una piccola goccia della soluzione zymolyase posta al centro di uno standard (circolare) piastra di agar, uno standard 100 mm (rettangolare) piastra a 96 pozzetti è prima posto sul piatto della cell sorter e sorter è programmato per depositare tetradi in una ben determinata (in questo caso D5). Poi, la piastra di agar circolare è posto sulla parte superiore della piastra a 96 pozzetti e orientato in modo che la goccia di zymolyase sia centrato sulla ben specificata. <ol><li> Riscaldare il numero desiderato di YPD + G418 (200 mcg / ml) piastre per almeno 1,5 ore in un incubatore a 37 ° C posizionato vicino al FACS sorter. </li><li> Una caratteristica fondamentale del protocollo ordinamento è la possibilità di indirizzare con precisione FACS ordinati tetradi a una posizione specifica su una piastra di agar contenente un pool di soluzione zymolyase. Per fare questo, inserire un &quot;landmark&quot; piastra a 96 pozzetti su tha automatizzato unità di deposizione delle cellule (ACDU), del sorter. Preparare un layout liste che ordinare 25 tetradi in un pozzetto di un formato a 96 pozzetti. Scegliere un pozzo vicino al centro della piastra, ad esempio ben D5. Figura 3 mostra una piastra di Petri e piastra a 96 pozzetti caricati su un cell sorter. Ordinamento 25 tetradi per piastra produce colonie ben separati. </li><li> Portare una pila di 10 piastre di agar dal termostato 37 ° C al sorter. </li><li> Prendere una piastra di agar e pipettare 25 ml di soluzione di zymolyase (1 mg / ml in 0,7 M sorbitolo) sul agar vicino al centro del piatto. Quindi, posizionare la piastra sulla piastra a 96 pozzetti punto di riferimento, allineando la goccia zymolyase sul bersaglio e dal punto 5.2, ad esempio, ben D5. </li><li> Avviare l&#39;ordinamento e depositare 25 tetradi al centro della goccia zymolyase sulla piastra di agar. Quindi, rimuovere e coprire la piastra. </li><li> Ripetere i punti 5.4 e 5.5 fino al 25 tetradi sono stati ordinati in goccioline zymolyase su ogni piatto nello stack. </li&gt; <li> Riportare la pila di piatti-tetrade contenente la 37 ° C incubatore. </li><li> Ripetere i passaggi 5.3 tramite 5.7 fino a quando tutti i piatti hanno tetradi. </li></ol> 6. Separazione Spore <ol><li> Incubare ogni pila di piastre di agar-tetrade contenente a 37 ° C per 1,5 ore. </li><li> Rimuovere le piastre dal termostato, aggiungere 15-25 perline sterile 3 millimetri di vetro per piastra, e agitare le piastre come una pila (o come due pile di 5 piastre) per 3-5 min. La migliore separazione spore è possibile spostando le piastre rigidamente da un lato all&#39;altro o davanti a dietro. Non spostare le piastre modo che il &quot;swirl&quot; perle intorno al bordo esterno della piastra. Lasciare le perline sulle piastre una volta terminato. </li><li> Posizionare la pila di piatti con perline a faccia in su in un incubatore a 30 ° C. Recuperare i piatti dello stack prossimi dal termostato a 37 ° C, e ripetere il passo 6.2. </li><li> Incubare le piastre O / N a 30 ° C. </li></ol> 7. Raccolta colonie <ol><li> Dopouna incubazione O / N a 30 ° C, piccole colonie avrebbero formato sulle piastre. Rimuovere con attenzione le piastre dal termostato senza disturbare le perline di vetro. </li><li> Rimuovere le perle di vetro con attenzione e invertendo rapidamente le piastre su un contenitore profondo. Il contenitore deve essere abbastanza in profondità per catturare le perline senza consentire loro di rimbalzare e colpire la piastra di agar. Toccando il fondo della piastra mentre è invertita può aiutare a muovere perline attaccati alla piastra. Queste sfere possono essere riutilizzati da lavaggio accurato con sapone, risciacquo con acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. </li><li> Contare il numero di colonie su ciascuna piastra e utilizzare il numero di colonie per stimare l&#39;efficienza della separazione e recupero spore. Ad esempio, 25 tetradi per piastra per un incrocio con vicino vitalità al 100% potrebbe produrre un totale di 100 colonie per piastra. </li><li> Dal piastre con un numero sufficiente di colonie (&gt; 65 per alta vitalità croci), le cellule di trasferimento di ogni colony in un pozzo separato di una piastra a 96 pozzetti contenente liquido YPD + G418. Inoltre, prendere nota di quali pozzi contengono colonie dalla stessa piastra di agar; questa informazione sarà utilizzato per aiutare il software assegnazione tetrade. </li><li> Utilizzare i 96-e piastre liquidi per seminare colture per la genotipizzazione e per il risparmio ceppi come azioni glicerolo congelati. Dettagli sul RAD-tag sequenziamento e l&#39;analisi di sequenza possono essere trovati in Ludlow et al 1. </li></ol>

<ol><li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+tetrad+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li>
<li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRose%2C+M+%22Methods+in+Yeast+Genetics+A+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1990).</li>
<li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+two+types+of+spore+germination%2C+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22C.R.+Trav.+Lab.+Carlsberg+Ser.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li>
<li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspore+bridges%3A+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li>
<li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li>
<li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li>
<li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li>
<li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+gene+conversion%3A+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Molti settori della ricerca genetica, che vanno dal carattere complesso di mappatura 11 per lo studio dei meccanismi sottostanti ricombinazione DNA 12, richiedono un numero estremamente elevato di progenie e alti volumi di sequenziamento del DNA. Tecniche che sposano il potere di approcci convenzionali con la capacità di high throughput sequenziamento del DNA hanno il potenziale per consentire studi che in precedenza erano intrattabile. Anche se molti high-throughput metodi di genetica del lievito sono stati applicati in modo efficace a problemi specifici, ognuno ha limitazioni che non raggiungono la vasta applicabilità dell&#39;analisi tetrade convenzionale. I migliori indirizzi a queste sfide utilizzando un approccio high-throughput unisce tetrade dissezione e genotipizzazione la progenie di incroci di lievito. In concomitanza con multiplex RAD-tag sequenziamento, BEST offre un modo economico per raccogliere informazioni genotipo per ogni ceppo progenie mantenendo rapporti tetrade per mezzo di codici a barre tetrade unici.0; Di tutti attualmente utilizzato metodi di high throughput, BEST ricapitola più strettamente le informazioni fornite da una croce lievito sezionato manualmente. BEST ha due caratteristiche principali. Il primo è l&#39;uso del FACS per isolare rapidamente tetradi distanti unsporulated cellule in coltura (protocollo passaggi 5-6). La capacità di isolare migliaia di eventi fluorescenti (tetradi) dà BEST suo più grande guadagno in velocità. Questa automazione fornisce una ancora maggiore vantaggio rispetto dissezione manuale per incroci con bassa efficienza sporulazione, a causa del maggior tempo necessario per identificare visivamente eventi rari. La seconda caratteristica fondamentale è l&#39;uso di un codice a barre molecolare molto complesso (Protocollo Fase 2) che viene trasmesso a ciascuna spora sorella di una tetrade. Poiché questi codici a barre possono essere utilizzati per computazionalmente ricostruire i rapporti tra tetrade spore che sono stati distribuiti a caso attraverso una piastra di agar, la necessità di manualmente celle di matrice in una griglia ordinata viene alleviata. Infine,perché il codice a barre molecolare e il gene reporter GFP-specific sporulazione sono fisicamente collegati (sullo stesso plasmide), solo tetradi che hanno mantenuto il codice a barre molecolare sono selezionati da FACS ordinamento. Ci sono due considerazioni che governano il periodo di tempo che le colture devono essere incubate in mezzo di sporulazione. In primo luogo, perché il giornalista specifico sporulazione (SPS2-GFP) è espresso all&#39;inizio del meiosi, da sola GFP non distingue completi tetradi 4 spore da cellule che non hanno completato la meiosi (cioè diadi). Mentre ulteriori gating FACS può diminuire il numero di fluorescenti, tetradi incomplete, il modo più semplice per ridurre questi eventi indesiderati è semplicemente monitorando la cultura sporulazione (punto 3.3) e procedere una volta nuovi tetradi hanno smesso di formatura. Nei nostri esperimenti, la frequenza delle diadi filtrate è inferiore all&#39;1%. In secondo luogo, per qualche croci ulteriore tempo trascorso in mezzo sporulazione a RT senza agitazione (punto 3.4) segnalemigliora significativamente la separazione delle tetradi dalle perle di vetro durante la placcatura ((Protocollo Fase 6). Infatti, questa fase è assolutamente necessaria per la rottura di alcune croci. Come tutti i metodi di high throughput, BEST è &quot;rumoroso&quot; di quanto l&#39;approccio convenzionale corrispondente. La modesta riduzione di efficienza del BEST rispetto ai tradizionali tetrade dissezione potrebbe risultare dalla combinazione di diversi fattori. Un fattore è l&#39;aumento della perdita di spore vitali in caso contrario, che potrebbero derivare da adesione alle perle di vetro durante la diffusione o aumentato di morte spore a causa delle sollecitazioni meccaniche del processo. Un secondo fattore potrebbe essere semplice perdita plasmide durante la meiosi. Un terzo fattore potrebbe essere un calo efficace in colonie utilizzabili derivanti da colonie con genotipi misti, si stima che circa il 5% delle colonie nel nostro pilota attraversa 1. È probabile che queste colonie rappresentano fallimenti di separazione spore sorella. Dato il rapido Fluorescence cernita e separazione spore consentire la raccolta di un numero enorme di tetradi, BEST è ben attrezzato per superare diminuzioni di efficienza su questa scala. Mentre future iterazioni di BEST potrebbe aumentare l&#39;efficienza vicina a quella del dissezione manuale, è forse più probabile che l&#39;attuale traiettoria esponenziale del DNA capacità sequenziamento sarà rapidamente compensare questo livello di perdita ceppo utilizzabile. Indipendentemente da ciò, la capacità di eseguire analisi tetrad sulla scala a cui può essere applicato BEST permetterà studi che sono attualmente irrealizzabile con metodi manuali.

Mappatura genetica meiosi, comunemente noto come analisi tetrade, è fondamentale per la genetica del lievito. In breve, due ceppi aploidi, ognuna contenente una sola copia di ciascun cromosoma, sono abbinati a formare un ceppo diploide eterozigote con due copie di ciascun cromosoma, uno da ciascun genitore. Starving cellule diploidi per l&#39;azoto induce meiosi (sporulazione), in cui i cromosomi duplicati, subiscono riarrangiamento, e si dividono in quattro cellule aploidi (spore o segreganti) con nuove combinazioni di alleli di ciascun genitore. Le quattro spore derivanti da una singola meiosi possono essere isolati da un processo manuale chiamato tetrade dissezione. Tetrade convenzionale dissezione 2,3 che è cambiato relativamente poco dopo la pubblicazione originale nel 1937 4, ha tre obiettivi. In primo luogo, le cellule che hanno subito la meiosi (tetradi) devono essere isolati da uno sfondo di cellule vegetative. In analisi convenzionale, questo viene realizzato da un ricercatore che, utilizzandoun microscopio, identifica visivamente tetradi su una piastra di agar e impiega un apparato micromanipolatore identificare visivamente tetradi su una piastra di agar e utilizzando un micromanipolatore per spostare il tetrade su una zona senza cellula della piastra. Successivamente, i quattro spore della tetrade devono essere fisicamente separati per evitare interspore accoppiamento. Le spore all&#39;interno di una tetrade sono tenuti insieme da entrambi un asco, il resto della parete cellulare della cellula diploide originale, e una serie di interspore ponti 5. Nell&#39;analisi tetrade convenzionale asco viene rimosso mediante digestione enzimatica, e un ricercatore utilizza il micromanipolatore per rompere i ponti interspore e prendere in giro a parte le spore. Infine, le singole spore sono disposte in un modello a griglia che mantiene il rapporto tra le spore, cioè tutti progenie in una fila di quattro sono spore sorelle della stessa tetrade originale. Un ricercatore lievito esperto in grado di completare il processo di dissezione 10 tetradi (un numero minimo generalmente accettatoa croce) in circa 15 min. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo tetrade di genotipizzazione high-throughput, che noi chiamiamo B arcode E nabled S equencing di T etrads (BEST) 1. BEST amplia gli attuali metodi di genetica high-throughput, consentendo la generazione e la genotipizzazione di un gran numero di discendenti che sono isolate, di genotipi, e mantenute come individui in un modo che permette i rapporti spore sorelle di tutti e quattro i prodotti meiotiche da recuperare. Ciò avviene utilizzando tre strategie principali (Figura 1). Il primo è l&#39;introduzione di un costrutto reporter di etichette che le cellule che hanno subito meiosi con GFP e permette loro di essere isolati da cellule fluorescenza-attivato (FACS). Seconda è l&#39;incorporazione di un codice a barre DNA altamente complesso (una stringa di 15 nucleotidi casuali) in una forma che si trasmette a tutti e quattro spore di un tetrade e può essere letto dal sequenziamento del DNA ricombinante della Progeny, e quindi identifica spore sorelle dalla stessa tetrade. Terzo è il passo genotipizzazione, e migliore è compatibile con numerose piattaforme di genotipizzazione che catturano sia un set di marcatori genomici così come il codice a barre specifico tetrade. Impieghiamo un sito-associata DNA tag sequenziamento restrizione (RAD-seq) 6 metodo che dirige il sequenziamento del genoma di specifici siti di restrizione 1, catturando in tal modo un consistente 2-3% del genoma dei ceppi progenie così come il codice a barre plasmide-borne . Il recupero dei rapporti tetrade insieme ai dati di genotipizzazione empiricamente derivata dalla croce permette l&#39;inferenza accurata delle informazioni mancanti, compreso lo stato di marcatori con bassa copertura sequenza e il genotipo completo di individui non vitali (e quindi non recuperabili). Qui, si descrive l&#39;applicazione del metodo nel microrganismo più comunemente usato per la mappatura meiotica, il lievito S. cerevisiae. Tuttavia, con sostituzioni minori di rea-specifico organismosignori, ad esempio, diverse proteine ​​specifiche per sporulazione fusi a GFP, il metodo dovrebbe essere facilmente trasferibile ad altri microrganismi, compresi gli organismi in cui la mappatura meiotic è significativamente più alta intensità di manodopera o attualmente intrattabile. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1. Metodo migliore. (A) Il plasmide pCL2_BC è un plasmide 2 micron con una fusione GFP-specific sporulazione, resistenza a G418, e un codice a barre casuale 15-mer. Costruzione del plasmide biblioteca è descritto in Ludlow et al 1. (B) Un pool di plasmidi barcode viene trasformato nel ceppo diploide da una croce. (C) trasformanti vengono poi coltivate su selezione e ~ 10.000 colonie trasformate sono raggruppati e sporulate. Durante la meiosi ogni spore di una tetrade eredita un copy del plasmide codice a barre. (D) tetradi sono separati dalle cellule unsporulated mediante FACS e raccolti su piastre di agar, dove vengono digeriti e interrotti per consentire a ciascun spore per formare una colonia. (E) Le colonie vengono poi raccolti in piastre a 96 pozzetti, caratterizzati fenotipicamente e genotipizzazione. Durante la genotipizzazione del codice a barre plasmide viene letto e utilizzato per identificare i quattro membri di ogni tetrade. Questa cifra è stata modificata da Ludlow et al 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>FACSAria II (Special Order unit)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Altri selezionatori cellulari dovrebbero lavorare per questa procedura. I fattori chiave sono: (1) un sistema laser/di rilevamento per il reporter fluorescente utilizzato (nel nostro caso un laser a 488 nm per eccitare l'EGFP), (2) la capacità di ordinare singoli eventi, (3) la capacità di ordinare su vetrini da microscopio per valutare la qualità dell'ordinamento e (4) la capacità di ordinare su piastre di Petri</td></tr><tr><td>Unità di deposizione cellulare automatizzata (per FACSAria II)</td><td>BD Biosciences</td><td>643155 (se acquistabile separatamente dallo strumento FACSAria)</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Biobusiness</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. Scientific</td><td></td><td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td></tr></tbody></table>

best: barcode enabled sequencing di tetradi

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Analisi Tetrad è uno strumento prezioso per la genetica del lievito, ma la natura manuale laborioso del processo ha ostacolato la sua applicazione su larga scala. Barcode Enabled Sequencing di tetradi (BEST) 1 sostituisce i processi manuali di isolamento, interrompendo e spaziatura tetradi. BEST isolati tetradi in virtù di una proteina di fusione GFP-specific sporulazione che consente fluorescenza-attivato cell sorting di tetradi direttamente su piastre di agar, dove l&#39;asco è digerito enzimaticamente e le spore sono interrotti e in modo casuale schierati dalla placcatura di perle di vetro. Le colonie aploidi vengono poi assegnati i rapporti spore sorelle, vale a dire informazioni sulle spore originati dalla stessa tetrade, utilizzando i codici a barre molecolare letti durante la genotipizzazione. Eliminando il collo di bottiglia della dissezione manuale, centinaia o addirittura migliaia di tetradi possono essere isolati in pochi minuti. Qui vi presentiamo una descrizione dettagliata delle procedure sperimentali necessari per eseguire meglio nel lievitoSaccharomyces cerevisiae, a partire da un ceppo diploide eterozigote attraverso l&#39;isolamento di colonie derivate dalla progenie meiotica aploide.

BEST può migliorare notevolmente la velocità con cui le spore di tetradi possono essere isolati. Come esempio di throughput questo metodo può fornire, un ricercatore ha eseguito i FACS cernita e separazione spore (Procedura 5.1 al 6.3) con 149 piastre di agar in 3 ore 1. Una resa equivalente (circa 3.725 tetradi) richiederebbe più di 90 ore di dissezione manuale. Tuttavia, come con molti metodi ad alto rendimento, l&#39;iterazione corrente del metodo ha una certa perdita di efficienza rispetto a dissezione manuale. Questa perdita manifesta come un ridotto numero di colonie recuperato rispetto alla previsione calcolata sulla base della vitalità spore della croce, determinata dalla dissezione manuale (passo 1.4). Supponendo che le cause della perdita di spore (Discussione) influiscono spore a caso, le stime possono essere fatte di quante colonie recuperati saranno membri di tetradi in cui sono stati recuperati 1, 2, 3, o 4 spore (Figura 4). Figura 4. Simulazione dell&#39;efficienza metodo a livello tetrade. Mancata recuperare con successo spore (come colonie) può essere dovuta a spore inviability, spore adesione alle perline di vetro, mancata separazione spore uni dagli altri, ecc La distribuzione binomiale è stato usato per calcolare la frazione attesa di tetradi (con almeno una spora recuperato con successo) producendo 4, 3, 2 o 1 colonie basati sulla proporzione di tutte spore recuperati con successo. Questo grafico può servire come indicazione di massima per il numero di ceppi che infine essere assemblati in 3 - o 4 - tetradi spore. Poiché il numero di colonie per piastra aumenta, anche il numero di tetradi completi recuperati. Nell&#39;esperimento descritto sopra, 25 tetradi da un incrocio con spore redditività vicina al 100% (come detfoderata da dissezione manuale) 1 sono stati piastrati su 149 piastre di agar. In questo esperimento, il numero massimo di colonie osservate per piastra era 80, indicando che 20 spore riuscito a formare colonie discrete. Il numero medio di colonie per piastra era 62. Colonie da 61 piastre contenenti 65 o più colonie sono stati raccolti e sequenziati. Dei 3.700 ceppi che hanno superato il controllo di qualità di sequenziamento, il 72% potrebbe essere computazionalmente assegnato in 3 - o 4 - tetradi spore.

Barcode Enabled Sequencing di tetradi (BEST) sostituisce i processi manuali di isolamento, interrompendo e spaziatura tetradi. BEST isolati tetradi da cellule fluorescenza-attivato smistamento su piastre di agar, separa le spore mediante agitazione con perle di vetro, e determina che le colonie disposte in modo casuale sono stati ricavati dallo stesso tetrade originale utilizzando codici a barre molecolare.

BEST: Barcode Enabled Sequencing di tetradi

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un elevato numero di progenie ricombinanti da un incrocio di lievito in modo da mantenere l'informazione su quali progenie derivano dallo stesso tetrad originale. Questo risultato si ottiene innanzitutto trasformando il ceppo diploide eterozigote da utilizzare nell'incrocio con una libreria di plasmidi contenente una barcodifica tetra-specifica e un reporter fluorescente specifico per la sporulazione. Il secondo passaggio consiste nel trasferire le cellule marcate con barcode nel mezzo di sporulazione.Questo permette la formazione delle tetradi e induce l'espressione del reporter fluorescente GFP nelle tetradi, ma non nelle cellule che non vanno incontro a sporulazione. Successivamente, un sorter a flusso separa le tetradi marcate fluorescentemente dalle altre cellule e le deposita direttamente in una piastra in agar, dove il rivestimento esterno delle tetradi viene digerito enzimaticamente. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare perle di vetro per separare e distribuire le spore delle tetradi digerite sulla superficie della piastra in agar, consentendo a ciascuna spora di formare una singola colonia.In definitiva, i ceppi ottenuti con questo metodo saranno sottoposti a genotipizzazione mediante un protocollo di sequenziamento del DNA ad alto rendimento e multiplex, che leggerà il codice a barre tetra-specifico di ciascun ceppo. I codici a barre vengono quindi utilizzati per identificare ciascuno dei quattro ceppi derivanti da un singolo evento meiotico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la dissezione manuale di aschi secchi mediante micro-manipolatore, è che un singolo ricercatore può isolare migliaia di progenie ricombinanti in sole poche ore.Le cellule di lievito diploidi utilizzate in questo studio sono state precedentemente trasformate con una libreria di plasmidi con codici a barre come descritto nel manoscritto allegato e conservate a meno 80 gradi Celsius per rivitalizzare le cellule dai ceppi congelati. Colturele per tutta la notte in cinque millilitri di YPD aggiungendo 200 microgrammi per millilitro di G quattro 18 a 30 gradi Celsius con agitazione nel giorno successivo. Lavare le cellule dalle colture notturne tre volte in PBS e quindi risospendere le cellule a un volume finale di due millilitri in mezzo di sporulazione, aggiungendo 200 microgrammi per millilitro.G quattro 18 Agitare le colture di sporulazione a temperatura ambiente. Monitorare quotidianamente l'avanzamento della sporulazione fino a quando la formazione di nuovi tetradi cessa. Tipicamente, ciò richiede da due a quattro giorni una volta che le colture contengono tetradi ben formati e relativamente pochi diadi.Rimuovere le colture dall'agitazione e lasciarle a temperatura ambiente per almeno sette giorni prima del sorting dei tetradi. L'aspetto più difficile di questa procedura è ottenere una buona separazione delle spore. Abbiamo riscontrato empiricamente che lasciare le colture in sporulazione a temperatura ambiente senza agitazione per almeno una settimana prima del sorting dei tetradi migliora notevolmente la separazione delle spore.I tetradi provenienti dalla coltura di sporulazione possono essere rilevati e isolati mediante citometria a flusso attivata da fluorescenza o fax, poiché i plasmidi con codice a barre nelle cellule diploidi portano anche una proteina di fusione GFP specifica per la sporulazione. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato per un fax aria due. Per iniziare questa procedura, caricare la coltura sporulata nel sorter fax e impostare due porte di scattering anteriore e laterale per escludere detriti, cellule aggregate e più cellule per goccia.Dovrebbe essere presente una popolazione di cellule fluorescenti, che, quando si utilizza il costrutto reporter PS due GFP, include diadi e tetradi; utilizzare un gating tra GFP e FSC per includere questi eventi fluorescenti. A seconda dello strain di partenza, potrebbe essere necessario aggiungere un ulteriore gating per rimuovere gli aggregati che includono tetradi e altre cellule. Esaminare un istogramma FSC degli eventi fluorescenti.In questo esempio, gli eventi nel picco di sinistra sono principalmente tetraspori, mentre gli eventi nel picco di destra sono generalmente tetraspori con un gemmulo attaccato; applicare una porta finale che includa gli eventi con un valore inferiore di FSC, che corrispondono principalmente a tetraspori, indicati dalle barre rosse. Verificare l'efficienza della strategia di selezione ordinando circa 1.500 tetraspori su un vetrino da microscopio e contando la proporzione di tetradi rispetto ai non tetradi. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 400 volte, la percentuale di tetradi può essere stimata con precisione contando solo circa 200 eventi ordinati, ma l'ordinamento di circa 1.500 eventi riduce il tempo necessario per cercare le cellule sul vetrino.Queste immagini in campo chiaro sono state acquisite con un ingrandimento di 600 volte. Mostrano esempi di tetradi a sinistra e di cellule non tetradiche a destra, dopo il sorting dei fatti. Controllare periodicamente che l'apparecchio di sorting riporti correttamente il numero di eventi, eseguendo il sorting di 25 tetradi su un vetrino da microscopio ed esaminando le cellule contenute nella goccia mediante microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 400 volte.Il campione deve contenere 25 tetradi nel droplet. Ripetere l'operazione tre o quattro volte per valutare la varianza dello strumento fax in quella serie di analisi. Preparare le piastre di agar per questa procedura riscaldando il numero desiderato di piastre YPD più G quattro 18 per almeno 1,5 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius posizionato vicino al fax sorter.Una caratteristica fondamentale del protocollo di selezione è la capacità di indirizzare con precisione i tetradi selezionati per fax a un'ubicazione specifica su una piastra di agar contenente una soluzione X. Per fare ciò, posizionare innanzitutto una piastra a 96 pozzetti di riferimento sull'unità automatizzata di deposizione cellulare del selezionatore. Successivamente, preparare un layout di selezione che permetta di inserire 25 tetradi in un singolo pozzetto di una piastra a 96.L'ordinamento in pozzetti con 25 tetre per piastra produce colonie ben separate. Scegliere un pozzetto vicino al centro della piastra. Ad esempio, il pozzetto D5.Portare una pila di 10 piastre di agar dal termostato a 37 gradi Celsius al dispositivo di selezione. Prendere una piastra di agar e pipettare 25 microlitri di soluzione zy sull'agar vicino al centro della piastra. Successivamente, posizionare la piastra sulla piastra a 96 pozzetti di riferimento, allineando la goccia X sul bersaglio.Bene, quello scelto in precedenza. Bene D cinque. Avviare il sortaggio e depositare 25 tetre al centro della goccia di zy sulla piastra di agar.Rimuovere e coprire la piastra. Ripetere il sorting per ogni piastra fino a quando 25 tetradi sono state ordinate in gocce di zamo su ciascuna piastra della pila. Restituire la pila di piastre contenenti tetra all'incubatrice a 37 gradi Celsius.Portare il successivo stack di 10 piastre al dispositivo di selezione e ripetere la procedura di ordinamento. Le spore possono essere separate dopo che le piastre di agar contenenti i tetradi sono state incubate a 37 gradi Celsius per 1,5 ore. Per iniziare questa procedura, aggiungere da 15 a 25 perline di vetro sterili da tre millimetri a ciascuna piastra e agitare le piastre in due stack da cinque piastre ciascuno per tre-cinque minuti.La migliore separazione delle spore si ottiene spostando rigidamente le piastre da un lato all'altro o da davanti a dietro. Non muovere le piastre in modo che le perline ruotino lungo il bordo esterno della piastra. Lasciare le perline sulle piastre al termine dell'operazione.Posizionare la pila di piastre con i dischetti rivolti verso l'alto in un incubatore a 30 gradi Celsius. Prelevare la pila successiva di piastre dall'incubatore a 37 gradi Celsius e ripetere la procedura di separazione delle spore utilizzando i dischetti. Incubare tutte le piastre durante la notte a 30 gradi Celsius il giorno successivo alla separazione delle spore.Rimuovere con attenzione le piastre dall'incubatrice a 30 gradi Celsius senza disturbare i granuli di vetro. Sulle piastre dovrebbero essersi formate delle piccole colonie. Rimuovere i granuli di vetro capovolgendo con cura e rapidamente le piastre sopra un contenitore profondo.Battere delicatamente la parte inferiore della piastra mentre è capovolta può aiutare a staccare le perle aderenti alla piastra. I contenitori devono essere abbastanza profondi da raccogliere le perle senza permettere loro di rimbalzare e colpire la piastra di agar. Contare il numero di colonie su ciascuna piastra e utilizzare questo valore per stimare l'efficienza della separazione e del recupero delle spore.Ad esempio, 25 tetradi per piastra per un incrocio con una viabilità vicina al 100% potrebbero produrre un totale di 100 colonie per piastra da piastre con un numero sufficiente di colonie, come ad esempio più di 65 per una viabilità elevata. Trasferire separatamente le cellule da ciascuna colonia in un pozzetto distinto di una piastra a 96 pozzetti contenente terreno liquido YPD più G four 18. Registrare inoltre quali pozzetti contengono colonie provenienti dalla stessa piastra di agar. Queste informazioni verranno utilizzate successivamente per facilitare l'assegnazione dei tetra. Il software Software best può migliorare notevolmente la velocità con cui vengono isolate le spore dai tetradi. Sebbene l'attuale iterazione del metodo presenti una certa perdita di efficienza rispetto alla dissezione manuale, la distribuzione binomiale è stata utilizzata per calcolare la frazione prevista di tetradi con almeno una spora recuperata con successo che produce 1, 2, 3 o quattro colonie, in base alla proporzione di tutte le spore recuperate con successo.Questo grafico può servire come una guida approssimativa al numero di ceppi che verranno infine assemblati in tetradi di tre o quattro spore, come osservato in questo caso. Il numero di tetradi complete recuperate aumenta all'aumentare del numero di colonie per piastra in questo studio. 25 raggi provenienti da incroci con vitalità delle spore vicina al 100%, determinata mediante dissezione manuale, sono stati seminati su 149 piastre di agar.Il numero massimo di colonie osservato per piastra è stato di 80, indicando che 20 spore non sono riuscite a formare colonie distinte. Il numero medio di colonie per piastra è stato di 62,4; da 61 piastre contenenti 65 colonie o più sono state raccolte e sottoposte a sequenziamento 354 colonie. Delle 3.700 ceppi che hanno superato il controllo di qualità del sequenziamento, 2.665, ovvero il 72%, sono stati assegnati computazionalmente a tre o quattro tetradi di spore. Una volta padroneggiato.Questa tecnica può essere utilizzata per elaborare più di mille tetradi all'ora. Tuttavia, per sessioni che superano le tre ore, sarà necessario un aiuto.

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