BEST: Barcode Enabled Sequencing di tetradi

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un elevato numero di progenie ricombinanti da un incrocio di lievito in modo da mantenere l'informazione su quali progenie derivano dallo stesso tetrad originale. Questo risultato si ottiene innanzitutto trasformando il ceppo diploide eterozigote da utilizzare nell'incrocio con una libreria di plasmidi contenente una barcodifica tetra-specifica e un reporter fluorescente specifico per la sporulazione. Il secondo passaggio consiste nel trasferire le cellule marcate con barcode nel mezzo di sporulazione.

Questo permette la formazione delle tetradi e induce l'espressione del reporter fluorescente GFP nelle tetradi, ma non nelle cellule che non vanno incontro a sporulazione. Successivamente, un sorter a flusso separa le tetradi marcate fluorescentemente dalle altre cellule e le deposita direttamente in una piastra in agar, dove il rivestimento esterno delle tetradi viene digerito enzimaticamente. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare perle di vetro per separare e distribuire le spore delle tetradi digerite sulla superficie della piastra in agar, consentendo a ciascuna spora di formare una singola colonia.

In definitiva, i ceppi ottenuti con questo metodo saranno sottoposti a genotipizzazione mediante un protocollo di sequenziamento del DNA ad alto rendimento e multiplex, che leggerà il codice a barre tetra-specifico di ciascun ceppo. I codici a barre vengono quindi utilizzati per identificare ciascuno dei quattro ceppi derivanti da un singolo evento meiotico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la dissezione manuale di aschi secchi mediante micro-manipolatore, è che un singolo ricercatore può isolare migliaia di progenie ricombinanti in sole poche ore.

Le cellule di lievito diploidi utilizzate in questo studio sono state precedentemente trasformate con una libreria di plasmidi con codici a barre come descritto nel manoscritto allegato e conservate a meno 80 gradi Celsius per rivitalizzare le cellule dai ceppi congelati. Colturele per tutta la notte in cinque millilitri di YPD aggiungendo 200 microgrammi per millilitro di G quattro 18 a 30 gradi Celsius con agitazione nel giorno successivo. Lavare le cellule dalle colture notturne tre volte in PBS e quindi risospendere le cellule a un volume finale di due millilitri in mezzo di sporulazione, aggiungendo 200 microgrammi per millilitro.

G quattro 18 Agitare le colture di sporulazione a temperatura ambiente. Monitorare quotidianamente l'avanzamento della sporulazione fino a quando la formazione di nuovi tetradi cessa. Tipicamente, ciò richiede da due a quattro giorni una volta che le colture contengono tetradi ben formati e relativamente pochi diadi.

Rimuovere le colture dall'agitazione e lasciarle a temperatura ambiente per almeno sette giorni prima del sorting dei tetradi. L'aspetto più difficile di questa procedura è ottenere una buona separazione delle spore. Abbiamo riscontrato empiricamente che lasciare le colture in sporulazione a temperatura ambiente senza agitazione per almeno una settimana prima del sorting dei tetradi migliora notevolmente la separazione delle spore.

I tetradi provenienti dalla coltura di sporulazione possono essere rilevati e isolati mediante citometria a flusso attivata da fluorescenza o fax, poiché i plasmidi con codice a barre nelle cellule diploidi portano anche una proteina di fusione GFP specifica per la sporulazione. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato per un fax aria due. Per iniziare questa procedura, caricare la coltura sporulata nel sorter fax e impostare due porte di scattering anteriore e laterale per escludere detriti, cellule aggregate e più cellule per goccia.

Dovrebbe essere presente una popolazione di cellule fluorescenti, che, quando si utilizza il costrutto reporter PS due GFP, include diadi e tetradi; utilizzare un gating tra GFP e FSC per includere questi eventi fluorescenti. A seconda dello strain di partenza, potrebbe essere necessario aggiungere un ulteriore gating per rimuovere gli aggregati che includono tetradi e altre cellule. Esaminare un istogramma FSC degli eventi fluorescenti.

In questo esempio, gli eventi nel picco di sinistra sono principalmente tetraspori, mentre gli eventi nel picco di destra sono generalmente tetraspori con un gemmulo attaccato; applicare una porta finale che includa gli eventi con un valore inferiore di FSC, che corrispondono principalmente a tetraspori, indicati dalle barre rosse. Verificare l'efficienza della strategia di selezione ordinando circa 1.500 tetraspori su un vetrino da microscopio e contando la proporzione di tetradi rispetto ai non tetradi. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 400 volte, la percentuale di tetradi può essere stimata con precisione contando solo circa 200 eventi ordinati, ma l'ordinamento di circa 1.500 eventi riduce il tempo necessario per cercare le cellule sul vetrino.

Queste immagini in campo chiaro sono state acquisite con un ingrandimento di 600 volte. Mostrano esempi di tetradi a sinistra e di cellule non tetradiche a destra, dopo il sorting dei fatti. Controllare periodicamente che l'apparecchio di sorting riporti correttamente il numero di eventi, eseguendo il sorting di 25 tetradi su un vetrino da microscopio ed esaminando le cellule contenute nella goccia mediante microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 400 volte.

Il campione deve contenere 25 tetradi nel droplet. Ripetere l'operazione tre o quattro volte per valutare la varianza dello strumento fax in quella serie di analisi. Preparare le piastre di agar per questa procedura riscaldando il numero desiderato di piastre YPD più G quattro 18 per almeno 1,5 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius posizionato vicino al fax sorter.

Una caratteristica fondamentale del protocollo di selezione è la capacità di indirizzare con precisione i tetradi selezionati per fax a un'ubicazione specifica su una piastra di agar contenente una soluzione X. Per fare ciò, posizionare innanzitutto una piastra a 96 pozzetti di riferimento sull'unità automatizzata di deposizione cellulare del selezionatore. Successivamente, preparare un layout di selezione che permetta di inserire 25 tetradi in un singolo pozzetto di una piastra a 96.

L'ordinamento in pozzetti con 25 tetre per piastra produce colonie ben separate. Scegliere un pozzetto vicino al centro della piastra. Ad esempio, il pozzetto D5.

Portare una pila di 10 piastre di agar dal termostato a 37 gradi Celsius al dispositivo di selezione. Prendere una piastra di agar e pipettare 25 microlitri di soluzione zy sull'agar vicino al centro della piastra. Successivamente, posizionare la piastra sulla piastra a 96 pozzetti di riferimento, allineando la goccia X sul bersaglio.

Bene, quello scelto in precedenza. Bene D cinque. Avviare il sortaggio e depositare 25 tetre al centro della goccia di zy sulla piastra di agar.

Rimuovere e coprire la piastra. Ripetere il sorting per ogni piastra fino a quando 25 tetradi sono state ordinate in gocce di zamo su ciascuna piastra della pila. Restituire la pila di piastre contenenti tetra all'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Portare il successivo stack di 10 piastre al dispositivo di selezione e ripetere la procedura di ordinamento. Le spore possono essere separate dopo che le piastre di agar contenenti i tetradi sono state incubate a 37 gradi Celsius per 1,5 ore. Per iniziare questa procedura, aggiungere da 15 a 25 perline di vetro sterili da tre millimetri a ciascuna piastra e agitare le piastre in due stack da cinque piastre ciascuno per tre-cinque minuti.

La migliore separazione delle spore si ottiene spostando rigidamente le piastre da un lato all'altro o da davanti a dietro. Non muovere le piastre in modo che le perline ruotino lungo il bordo esterno della piastra. Lasciare le perline sulle piastre al termine dell'operazione.

Posizionare la pila di piastre con i dischetti rivolti verso l'alto in un incubatore a 30 gradi Celsius. Prelevare la pila successiva di piastre dall'incubatore a 37 gradi Celsius e ripetere la procedura di separazione delle spore utilizzando i dischetti. Incubare tutte le piastre durante la notte a 30 gradi Celsius il giorno successivo alla separazione delle spore.

Rimuovere con attenzione le piastre dall'incubatrice a 30 gradi Celsius senza disturbare i granuli di vetro. Sulle piastre dovrebbero essersi formate delle piccole colonie. Rimuovere i granuli di vetro capovolgendo con cura e rapidamente le piastre sopra un contenitore profondo.

Battere delicatamente la parte inferiore della piastra mentre è capovolta può aiutare a staccare le perle aderenti alla piastra. I contenitori devono essere abbastanza profondi da raccogliere le perle senza permettere loro di rimbalzare e colpire la piastra di agar. Contare il numero di colonie su ciascuna piastra e utilizzare questo valore per stimare l'efficienza della separazione e del recupero delle spore.

Ad esempio, 25 tetradi per piastra per un incrocio con una viabilità vicina al 100% potrebbero produrre un totale di 100 colonie per piastra da piastre con un numero sufficiente di colonie, come ad esempio più di 65 per una viabilità elevata. Trasferire separatamente le cellule da ciascuna colonia in un pozzetto distinto di una piastra a 96 pozzetti contenente terreno liquido YPD più G four 18. Registrare inoltre quali pozzetti contengono colonie provenienti dalla stessa piastra di agar.

Queste informazioni verranno utilizzate successivamente per facilitare l'assegnazione dei tetra. Il software Software best può migliorare notevolmente la velocità con cui vengono isolate le spore dai tetradi. Sebbene l'attuale iterazione del metodo presenti una certa perdita di efficienza rispetto alla dissezione manuale, la distribuzione binomiale è stata utilizzata per calcolare la frazione prevista di tetradi con almeno una spora recuperata con successo che produce 1, 2, 3 o quattro colonie, in base alla proporzione di tutte le spore recuperate con successo.

Questo grafico può servire come una guida approssimativa al numero di ceppi che verranno infine assemblati in tetradi di tre o quattro spore, come osservato in questo caso. Il numero di tetradi complete recuperate aumenta all'aumentare del numero di colonie per piastra in questo studio. 25 raggi provenienti da incroci con vitalità delle spore vicina al 100%, determinata mediante dissezione manuale, sono stati seminati su 149 piastre di agar.

Il numero massimo di colonie osservato per piastra è stato di 80, indicando che 20 spore non sono riuscite a formare colonie distinte. Il numero medio di colonie per piastra è stato di 62,4; da 61 piastre contenenti 65 colonie o più sono state raccolte e sottoposte a sequenziamento 354 colonie. Delle 3.700 ceppi che hanno superato il controllo di qualità del sequenziamento, 2.665, ovvero il 72%, sono stati assegnati computazionalmente a tre o quattro tetradi di spore. Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere utilizzata per elaborare più di mille tetradi all'ora. Tuttavia, per sessioni che superano le tre ore, sarà necessario un aiuto.