Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di profilare i livelli di espressione genica di singole cellule staminali embrionali umane utilizzando la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa a singola cellula, o R-T-P-C-R. Ciò si ottiene utilizzando prima la selezione delle cellule attivate fluorescenti per ordinare le singole cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente un tampone di lisi cellulare. Il secondo passo consiste nell'inversione della trascrizione dell'RNA per generare CDNA da lisati a singola cellula.

Successivamente, il CDNA viene amplificato dalla reazione a catena della polimerasi. Il passaggio finale consiste nell'eseguire la R-T-P-C-R quantitativa sul CDNA amplificato. In definitiva, questo test è utile per studiare l'espressione genica in popolazioni eterogenee come le cellule staminali embrionali umane.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al vaso artificiale quantitativo a cellula singola esistente è che questo metodo, EEG e più robusto Prima della purificazione via fax. L'OCT quattro cellule staminali embrionali umane EGFP o Hess vengono staccate dal piatto da 60 millimetri. Rimuovere tutto il terreno, aggiungere un millilitro di Accutane e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Neutralizzare Accutane con un millilitro di centrifuga ES media umana per pellettare le cellule dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule nel tampone fax e regolare la concentrazione a una volta 10 per le sei cellule per millilitro. Quindi, passare il campione cellulare attraverso un tubo con tappo del filtro cellulare da 35 micrometri. Conservare la provetta sul ghiaccio prima di smistare le cellule.

Iniziare questa procedura preparando una master mix contenente un microlitro di soluzione di lisi a singola cellula D, Ns, uno e nove microlitri di soluzione di lisi a singola cellula. Per ciascuno, trasferire 10 microlitri della soluzione di miscela a ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti per il programma di analisi fax, il selezionatore di cellule per smistare singole cellule positive all'EGFP nei pozzetti della piastra PCR a 96 pozzetti dopo lo smistamento delle cellule, incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente per la lisi cellulare. Per fermare la reazione di lisi, aggiungere un microlitro di soluzione di arresto e incubare a temperatura ambiente per due minuti.

Per iniziare questa procedura, aggiungere prima a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti un Eloqua da 0,5 microlitri di 20 micromolari SMAT 15 e primer SMAA. Riscaldare i campioni a 80 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere quattro microlitri di cinque x tampone, due microlitri di DTT, un microlitro di trascrittasi inversa e un microlitro di D e tps.

Per ogni bene eseguire la trascrizione inversa in un termociclatore. Impostare il programma termico a 42 gradi Celsius per 90 minuti, seguito da 85 gradi Celsius per cinque minuti. Per inattivare la trascrittasi inversa quando la trascrizione inversa è completa, aggiungere quattro microlitri di reagente exo a ciascun campione di CDNA incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti per digerire le scivolate degli oligonucleotidi in eccesso, seguiti da 80 gradi Celsius per 15 minuti.

Per inattivare l'esoreagente, preparare la miscela di reazione PCR con due nanomolari del primer SMAP two. Aggiungere 10 microlitri della miscela di reazione PCR. Ad ogni campione trascritto al contrario.

Eseguire l'amplificazione composta da 20 cicli di denaturazione, un inginocchiamento e un'estensione dopo l'amplificazione dei campioni eseguiti due serie di reazioni quantitative R-T-P-C-R in piastre separate per confermare i risultati R-T-P-C-R a ciascun pozzetto delle 2 piastre da 96 pozzetti, aggiungere 10 microlitri di due x cyber green. PCR master mix, un microlitro di CDNA amplificato, due primer e sette microlitri di acqua. Impostare il programma a 95 gradi Celsius per tre secondi, seguito da 60 gradi Celsius per 30 secondi.

Per 40 cicli, il gradino in ginocchio viene rimosso per ridurre l'errore di innesco. In questo studio, le quantità di microgrammi di RNA totale di Hess sono state diluite fino a livelli di nano e picogrammi per valutare la variabilità tecnica e il rilevamento della differenza su basse quantità di RNA totale è stato eseguito utilizzando la risonanza magnetica. NA di bucce raggruppate diluite in serie da 10 nanogrammi per microlitro a 0,1 picogrammi per microlitro. Ogni punto mostra il valore CT dell'mRNA diluito in serie e dell'mRNA a cellula singola ordinati via fax.

È stata osservata una correlazione tra ciascun campione e i risultati del QR TPCR con diverse singole cellule che mostravano valori CT simili. Il fax è stato utilizzato per smistare e selezionare le cellule EEG FP positive da una linea HESC OCT four EGFP reporter. I risultati mostrano una popolazione positiva per EGFP di circa il 60% rispetto alla popolazione negativa per convalidare la coerenza tra diversi lotti di reazioni di trascrizione inversa e amplificazione.

I lisati a singola cellula purificati via fax sono stati divisi a metà e il protocollo è stato applicato a ciascuna metà per i confronti dei lotti. È stata osservata una correlazione significativa tra il valore CT di quattro OCT di ciascuna metà dei lisati a singola cellula. Una presentazione della mappa di calore dell'espressione genica di una singola buccia mostra un livello coerente e robusto di espressione di OCT quattro, ma livelli variabili di un altro gene marcatore di cellule staminali, NAN og presi insieme, i nostri risultati dimostrano che questo saggio di espressione genica a singola cellula è utile per studiare le eterogeneità di popolazione di cellule staminali pluripotenti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire correttamente il QITP per il trascrittoma a singola cellula.