Name: Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri il profilo di espressione genica in singole cellule staminali embrionali umane mediante RT-PCR quantitativa. Questo metodo rivela l'eterogeneità delle popolazioni cellulari per studi avanzati in biologia delle cellule staminali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Lee per le discussioni importanti sul manoscritto. Il lavoro in laboratorio Lee è stato sostenuto da sovvenzioni dal Robertson Investigator Award of Foundation di New York Stem Cell e dal Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

1. Preparazione di una piastra a 96 pozzetti <ol><li> Mescolare 1 ml di singola cella DNase1 a 9 ml Single Cell Lysis Solution. </li><li> Mettere la soluzione miscelata 10 microlitri in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti PCR. </li></ol> 2. Rimozione hESCs per FACS Purificazione <ol><li> Staccare OCT4 :: linea di cellule EGFP ES dalla parabola di 60 mm, con 1 ml Accutase per 20 minuti, a 37 ° C, che sono stati neutralizzati con supporto ES umana. </li><li> Preparare popolazione di cellule in 1 ml di tampone FACS e regolare la cella a 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Passare il campione cellulare attraverso un colino cellula tubo cap 35 micron. </li><li> Conservare la provetta in ghiaccio prima selezione delle cellule. </li></ol> 3. Lisi di FACS-purificato cella singola in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti <ol><li> Ordinare il campione di cellule positive EGFP su un cell sorter con un operatore qualificato. Mettere la singola cella in cella singola soluzione Lysis/DNase1 in piastra a 96 pozzetti PCR. Se necessario, il 96 pozzetti con campione può essere conservato a -80 ° C congelatore inferiore a un mese. </li><li> Incubare i campioni 5 min a RT per lisi cellulare. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di arresto per interrompere la reazione di lisi. </li><li> Incubare 2 min a RT. </li></ol> 4. Trascrizione inversa <ol><li> Aggiungere a ciascuna una aliquota di 0,5 ml di 20 mM SMA-T15, SMA-A. </li><li> Aggiungere 4 ml di buffer 5X, 2 microlitri DTT, 1 ml trascrittasi inversa, e 1 ml dNTP a ciascun bene. </li><li> Eseguire la trascrizione inversa in un termociclatore. <ol><li> Impostare il programma termica a 42 ° C × 90 min e inattivare la trascrittasi inversa a 85 ° C × 5 min. </li></ol></li></ol> 5. Amplificazione <ol><li> Aggiungere 4 ml di reagente ExoSAP-IT per ogni campione trascritto inverse. <ol><li> Incubare i campioni a 37 ° C per 15 min e 80 ° C per 15 minuti per inattivare il reagente ExoSAP-IT. </li></ol></li><li> Preparare PCR reazione mix wesima SMA-p2 (2 nm) </li><li> Aggiungere 10 ml di miscela di reazione PCR per ciascun campione inverse trascritto. </li><li> Eseguire l&#39;amplificazione, composto da 20 cicli di denaturazione (94 ° C per 30 sec), ricottura (57 ° C per 30 sec), e l&#39;estensione (68 ° C per 10 min). </li></ol> 6. QRT-PCR prestazioni <ol><li> Aggiungere 10 ml di 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ml amplificato cDNA, 2 primer nm e 7 microlitri di acqua a ciascun pozzetto. <ol><li> Impostare il programma seguito da 95 ° C per 3 sec, 60 ° C per 30 sec x 40 cicli. </li></ol></li><li> Eseguire in duplicato per errori tecnici. </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Singolo profiling genica con cellule potrebbe essere un importante strumento per predire la funzionalità di una singola cellula o di un intera popolazione. A causa di limitazioni tecniche, tutta l&#39;analisi del gene profiling è stato limitato alla media della popolazione. Le variazioni nei modelli di espressione genica e di livelli tra le singole cellule e le sottopopolazioni sono state proposte per provocare interpretazioni errate. Tali aspetti cellulari diversi possono essere trovati in hESCs e la loro eterogeneità ...

Popolazioni eucariote più elevati sono eterogenei quindi con analisi della popolazione studiata, è spesso difficile interpretare le loro caratteristiche cellulari. Le singole celle all&#39;interno di una popolazione può essere leggermente diversa, e queste differenze possono avere conseguenze importanti per la proprietà e la funzione di tutta la popolazione 1, 2. In particolare, le cellule staminali embrionali umane (hESC) sono noti per essere eterogeneo, che causa diversi livelli di pluripotenza e le diverse potenzialità per specifiche lignaggio in delicatamente modi caratteristici 3, 4. Ad esempio, differenti antigeni di superficie cellulare possono essere usati per classificare le cellule staminali pluripotenti indifferenziate, 5 e il gruppo Austin Smith proposti diversi livelli di pluripotenza in cellule staminali embrionali di topo, in base alla loro morfologia, differenziazione propensione e dipendenza della via di segnalazione 6. Questo fenomeno è stato ipotizzato in embrione umanoLe cellule staminali nic 7. Considerando che gli studi complessivi sono stati eseguiti tra le diverse linee di cellule staminali, non i singoli cellule staminali singoli, potrebbe essere molto interessante per analizzare i diversi livelli di pluripotenza a livello di singola cellula, che interessa potenzialmente le loro capacità di differenziazione verso tutte le linee cellulari somatiche. Eterogeneità cellulare e molecolare potrebbe essere dettata dalla trascrizione profiling, che si chiama &#39;trascrittoma cella singola&#39; e sottolinea nuovi approcci per la quantificazione dei livelli di espressione genica 8-10. Per l&#39;analisi dei livelli di espressione genica in cellule singole, abbiamo sviluppato un protocollo semplice, ma robusto di singola cellula RT-PCR quantitativa. Abbiamo confermato l&#39;efficacia e la fattibilità del nostro protocollo confrontando ogni mezzo di lisati cellulari singole e in serie diluiti RNA totali di hESCs, con conseguente varianti tecniche minime e le differenze. Inoltre, abbiamo utilizzato una linea giornalista genetica per isolare omogenea popolazione di hESC utilizzando il sistema di targeting gene. Il vettore dei donatori per il targeting OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro costruire) e un paio di plasmidi Talen sono stati utilizzati 11. Il vettore donatore e un paio di plasmidi Talen sono state introdotte nel hESCs (H9, WA09) utilizzando il nostro nucleofection e il protocollo di selezione clonale e la manutenzione di hESC è stata effettuata sulla base della nostra protocollo di routine 12. Abbiamo confermato questa linea giornalista genetica esprimono EGFP per l&#39;espressione OCT4 in OCT4 :: EGFP hESCs. Il nostro risultato dimostra che i singoli hESCs (filtrate per OCT4 :: cellule fortemente positivi EGFP) tengono alti livelli di espressione OCT4, ma diversi livelli di espressione NANOG. Quindi, il nostro unico dosaggio di espressione genica delle cellule dovrebbe essere utile per studiare l&#39;eterogeneità della popolazione di cellule staminali pluripotenti.

<table><tbody><tr><td>Piastra PCR a 96 pozzetti</td><td>USA scientific</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Kit di lisi cellulare Ambion</td> Life <td>Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Trascrittasi inversa</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polimerasi Alta fedeltà</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, PCR Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Universal 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>tampone</td><td></td><td></td> FACS <td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 &mu; l DNasi, filtro sterilizzato</td></tr><tr><td>35 &mu; tubi con tappo per filtro cellulare m</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante rt-pcr

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Eterogeneità della popolazione di cellule staminali ostacola la comprensione dettagliata della biologia delle cellule staminali, come la loro propensione verso la differenziazione diversi lignaggi. Un singolo saggio transcriptome cella può essere un nuovo approccio per sezionare variazioni individuali. Abbiamo sviluppato la singola cellula metodo qRT-PCR, e ha confermato che questo metodo funziona bene in diversi profili di espressione genica. Nel livello di singola cellula, ogni cellula staminali embrionali umane, ordinati per OCT4 :: cellule positive EGFP, ha alta espressione in OCT4, ma un diverso livello di espressione NANOG. Il nostro unico dosaggio di espressione genica delle cellule dovrebbe essere utile per interrogare eterogeneità della popolazione.

Efficiente e robusto singola amplificazione RNA cellulare Per ridurre al minimo la variazione trascrizionale tra hESCs, abbiamo usato OCT4 :: EGFP hESC clone per FACS purificazione. Dopo la cernita Oct4 :: cellule positive EGFP in una piastra a 96 pozzetti, ogni cella viene lisato in tampone di lisi e convertito poli (A) + RNA a piena lunghezza cDNA utilizzando SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primer di ancoraggio e con SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG...

Singolo gene delle cellule saggio di espressione è necessaria per comprendere eterogeneità di cellule staminali.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è analizzare i livelli di espressione genica di singole cellule staminali embrionali umane mediante la reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa da singola cellula, o R-T-P-C-R. Questo viene ottenuto innanzitutto utilizzando la sorta cellulare attivata da fluorescenza per separare singole cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente tampone per la lisi cellulare. Il secondo passaggio consiste nella trascrizione inversa dell'RNA per generare CDNA dai lisati di singole cellule.Successivamente, il CDNA viene amplificato mediante reazione a catena della polimerasi. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire una R-T-P-C-R quantitativa sul CDNA amplificato. In definitiva, questo saggio è utile per lo studio dell'espressione genica in popolazioni eterogenee come le cellule staminali embrionali umane.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di vasi artificiali quantitativi a singola cellula è che questo approccio è più semplice e robusto prima della purificazione mediante fax. Le cellule staminali embrionali umane OCT4-EGFP o Hess vengono staccate dalla piastra da

profiling-individual-human-embryonic-stem-cells-by-quantitative-rt-pcr

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dimostreremo la configurazione e l'analisi di pre-microRNA 96-array e per QPCR usando un robot così come a mano con una pipetta multicanale Thermo Scientific Matrix.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Singoli profili di espressione delle cellule consente la dettagliata analisi di espressione genica di cellule singole. Noi descrivere i metodi per l'isolamento dei cardiomiociti, e preparare il lisati risultante sia per microarray intero trascrittoma o qPCR di obiettivi specifici.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

Un metodo per l'isolamento di singole cellule retiniche e successiva amplificazione del cDNA è descritto loro. Unicellulari trascrittomica rivela il grado di eterogeneità cellulare presente in un tessuto e scopre nuovi geni marcatori per le popolazioni di cellule rare. Il protocollo di accompagnamento può essere regolato secondo molti tipi cellulari differenti.

Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

L'identificazione delle cellule tumorali del cervello avvio (BTICs), le cellule rare all'interno di una proprietà eterogenee di cellule staminali tumorali che possiedono, fornisce nuove intuizioni patogenesi umana tumore al cervello. Abbiamo affinato specifiche condizioni di coltura per arricchire per BTICs, e noi abitualmente uso citometria a flusso per arricchire ulteriormente queste popolazioni. Autorinnovamento saggi e analisi trascritto di singola cellula RT-PCR può successivamente essere...

Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficiente per propagare le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando solo terreni condizionati derivati dalla placenta umana in un piatto rivestito di gelatina senza ulteriori supplementazioni esogene o substrati sintetici specifici per hPSC.

A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

Descriviamo un metodo per ordinare singole cellule di mammifero e quantificare l'espressione di un massimo di 96 geni bersaglio di interesse in ogni cellula. Questo metodo include l'uso di standard qPCR interni per consentire la stima dei conteggi assoluti dei trascritti.

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Alla rinfusa gene espressione misure nube singola cella differenze nelle popolazioni eterogenee delle cellule. Qui, descriviamo un protocollo per analisi di espressione genica e l'indice come unicellulare ordinano di Florescence attivato Cell Sorting (FACS) possa essere combinato per delineare eterogeneità e immunophenotypically caratterizzare popolazioni molecolarmente distinte delle cellule.

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

Qui abbiamo presentato un metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula multiplexed per profilare l'espressione genica nei tessuti embrionali del topo. Il metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula (scRNA-Seq) basato su droplet in combinazione con strategie di multiplexing può profilare singole cellule da più campioni contemporaneamente, riducendo significativamente i costi del reagente e riducendo al minimo gli effetti batch sperimentali.

Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Scopri il profilo di espressione genica in singole cellule staminali embrionali umane mediante RT-PCR quantitativa. Questo metodo rivela l'eterogeneità delle popolazioni cellulari per studi avanzati in biologia delle cellule staminali.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Esplora altri video