Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

L'obiettivo generale di questo procedimento è analizzare i livelli di espressione genica di singole cellule staminali embrionali umane mediante la reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa da singola cellula, o R-T-P-C-R. Questo viene ottenuto innanzitutto utilizzando la sorta cellulare attivata da fluorescenza per separare singole cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente tampone per la lisi cellulare. Il secondo passaggio consiste nella trascrizione inversa dell'RNA per generare CDNA dai lisati di singole cellule.

Successivamente, il CDNA viene amplificato mediante reazione a catena della polimerasi. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire una R-T-P-C-R quantitativa sul CDNA amplificato. In definitiva, questo saggio è utile per lo studio dell'espressione genica in popolazioni eterogenee come le cellule staminali embrionali umane.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di vasi artificiali quantitativi a singola cellula è che questo approccio è più semplice e robusto prima della purificazione mediante fax. Le cellule staminali embrionali umane OCT4-EGFP o Hess vengono staccate dalla piastra da 60 millimetri. Rimuovere tutto il mezzo, aggiungere un millilitro di Accutase e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Neutralizzare l'Accutane con un millilitro di mezzo ES umano, centrifugare per ottenere il pellet cellulare, dopo aver scartato il sopranatante risospendere le cellule nel buffer fax e aggiustare la concentrazione a uno per 10 alla sesta cellule per millilitro. Successivamente, far passare il campione cellulare attraverso un tubo con filtro cap per strainer cellulare da 35 micrometri. Conservare il tubo sul ghiaccio prima dell'ordinamento cellulare.

Iniziare questa procedura preparando una miscela madre contenente un microlitro di DNs singola cellula uno e nove microlitri di soluzione di lisi per singola cellula. Per ogni pozzetto, trasferire 10 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti per il programma di analisi fax. Utilizzare il citometro a flusso per selezionare le cellule singole positive per EGFP e depositarle nei pozzetti della piastra PCR a 96 pozzetti. Dopo il sorting cellulare, incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente per consentire la lisi cellulare. Per arrestare la reazione di lisi, aggiungere un microlitro di soluzione di arresto e incubare a temperatura ambiente per due minuti.

Per iniziare questa procedura, aggiungere prima 0,5 microlitri di Eloqua di primer SMAT 15 e SMAA a 20 micromolari in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Riscaldare i campioni a 80 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere quattro microlitri di buffer 5x, due microlitri di DTT, un microlitro di trascrittasi inversa e un microlitro di D e tps.

In ogni pozzetto eseguire la trascrizione inversa in un termociclatore. Impostare il programma termico a 42 gradi Celsius per 90 minuti, seguito da 85 gradi Celsius per cinque minuti. Per inattivare la trascrittasi inversa al termine della trascrizione inversa, aggiungere quattro microlitri di reagente exo a ciascun campione di CDNA e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti per digerire gli eccessi di oligonucleotidi glides, seguito da 80 gradi Celsius per 15 minuti.

Per inattivare il reagente exo, preparare il mix di reazione PCR con due nanomolar della primer SMAP due. Aggiungere 10 microlitri del mix di reazione PCR a ciascun campione retrotrascritto.

Eseguire l'amplificazione composta da 20 cicli di denaturazione, annealing ed estensione; dopo l'amplificazione dei campioni, eseguire due set di reazioni quantitative di RT-PCR in piastre separate per confermare i risultati di RT-PCR. In ogni pozzetto delle due piastre da 96 pozzetti, aggiungere 10 microlitri di Sybr Green 2x PCR master mix, 1 microlitro di cDNA amplificato, due primer e 7 microlitri di acqua. Impostare il programma su 95 °C per tre secondi, seguito da 60 °C per 30 secondi.

Per 40 cicli, un passaggio di annealing viene rimosso per ridurre l'errore del primer. In questo studio, quantità nell'ordine dei microgrammi di RNA totale di Hess sono state diluite fino a livelli di nanogrammi e picogrammi per valutare la variabilità tecnica e il rilevamento delle differenze su basse quantità di RNA totale; è stata eseguita una R-T-P-C-R quantitativa del gene G-A-P-D-H utilizzando mR.NA di culmi raccolti in pool, diluiti in serie da 10 nanogrammi per microlitro a 0,1 picogrammi per microlitro. Ogni punto mostra il valore di CT di mRNA diluito in serie e di mRNA di singola cellula ordinato tramite fax.

È stata osservata una correlazione tra ogni campione e i risultati della PCR in tempo reale, con diverse cellule singole che mostravano valori di CT simili. Il FACS è stato utilizzato per ordinare e selezionare cellule fortemente positive per EEG FP da una linea di cellule staminali embrionali umane con reporter OCT4-EGFP. I risultati mostrano una popolazione positiva per EGFP di circa il 60% rispetto alla popolazione negativa, al fine di validare la coerenza tra diversi lotti di reazioni di trascrizione inversa e amplificazione.

I lisati cellulari singoli purificati sono stati suddivisi a metà e il protocollo è stato applicato a ciascuna metà per confronti in batch. È stata osservata una correlazione significativa tra il valore CT di OCT4 delle due metà dei lisati cellulari singoli. Una rappresentazione sotto forma di mappa termica dell'espressione genica nei singoli nuclei mostra un livello costante e robusto di espressione di OCT4, ma livelli variabili di un altro gene marcatore delle cellule staminali, NANOG. Nel complesso, i nostri risultati dimostrano che questo saggio di espressione genica a singola cellula è utile per lo studio delle eterogeneità della popolazione delle cellule staminali pluripotenti.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire correttamente il QITP per il trascrittoma singola cellula.