Umano camera di flusso neutrofili saggio

È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro.

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'adesione solida dei neutrofili utilizzando un saggio in camera di flusso che consente l'adesione dei neutrofili umani in presenza di stress di taglio. Ciò si ottiene preparando prima un substrato di molecole di adesione purificate o una superficie cellulare endoteliale, come la vena ombelicale umana, le cellule endoteliali o ve. Il secondo passo consiste nel separare i neutrofili dal sangue periferico umano utilizzando un metodo di centrifugazione PHI a due strati.

Successivamente, la camera di flusso viene assemblata per consentire l'iniezione dei neutrofili umani isolati sotto sforzo di taglio sul substrato di adesione, ligando o ve. Il passaggio finale consiste nel registrare gli eventi di adesione dei neutrofili nella camera di flusso, seguiti da un'attenta quantificazione dell'adesione solida. In definitiva, il saggio della camera di flusso viene utilizzato per mostrare una solida adesione dei neutrofili verso le molecole di adesione purificate e una superficie HX.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo autoimmune, come l'importanza funzionale delle variazioni genetiche in molecole di un tessuto che sono note per essere associate allo sviluppo dell'autoimmunità. Studi genetici in pazienti con ptosi da lupus eritema sistemico hanno dimostrato una forte associazione con varianti e Abeta due integrina, una proteina coinvolta nell'adesione solida dei neutrofili. Abbiamo sviluppato questo sistema di analisi per valutare le conseguenze funzionali della variazione genetica in questo endocrino beta due chiamato Mac one su un'adesione salda Per preparare i piatti di coltura da utilizzare nella camera di flusso.

Aggiungere un millilitro di una soluzione di fibrina e gelatina a ciascuna piastra di coltura tissutale da 35 millimetri e pipettare più volte per assicurarsi che l'intera superficie della piastra sia rivestita. Rimuovere la fibronectina in eccesso e la soluzione di gelatina e asciugare le piastre all'aria per almeno 30 minuti. Per ottimizzare la formazione della matrice proteica, raccogliere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana o il qve che sono state coltivate all'80-90% di confluenza utilizzando il seme di tripsina EDTA 500.000 cellule in ciascuna piastra di coltura tissutale rivestita.

Aggiungere due millilitri di terreno di coltura a ciascun piatto e incubare a 37 gradi Celsius. Le cellule al 5% di CO2 devono essere ispezionate visivamente ogni giorno con cambi di terreno ogni due giorni. Consentire alle cellule di crescere fino all'80-90% di confluenza.

Per iniziare questa procedura, utilizzare un pennarello o una penna per disegnare un cerchio di 0,5 centimetri di diametro al centro di una piastra per colture tissutali da 35 millimetri. 20 microlitri di una proteina da 20 microgrammi per millilitro, una soluzione nell'area contrassegnata. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere la proteina, una soluzione per coprire l'intera area all'interno del cerchio di 0,5 centimetri di diametro.

È importante non toccare o graffiare la superficie del piatto. Incubare le piastre di coltura tissutale a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, lava ogni proteina tre volte su un piatto rivestito con un millilitro di PBS.

Dopo aver rimosso il PBS dalla terza piastra di lavaggio, applicare 50 microlitri di BSA all'1% nell'area contrassegnata per bloccare il legame non specifico sulla piastra. Incubare a quattro gradi Celsius per due ore. Dopo due ore.

Lavare la piastra bloccata tre volte con un millilitro di PBS. Preparare le soluzioni proteiche chimeriche del ligando del recettore di adesione FC per il rivestimento e questo esperimento e ICAM verranno utilizzati un FC Kyra a 25 microgrammi per millilitro e una P selectina FC Kyra a 0,5 microgrammi per millilitro. Rivestire l'area contrassegnata con 50 microlitri di substrato, incubare le piastre di coltura tissutale per una notte a quattro gradi Celsius.

Le stoviglie devono essere utilizzate entro due giorni e l'area rivestita non deve essere lasciata asciugare. Se necessario. Aggiungere PBS per mantenere i 50 microlitri di soluzione sulla piastra.

I neutrofili per questo studio sono isolati dal sangue dei partecipanti che hanno dato il consenso informato scritto. Dopo aver raccolto il sangue mediante flebotomia in una provetta per la raccolta del sangue anticoagulante o in un vacutainer, diluire il sangue uno a uno con PBS e completare tutti i passaggi di questa procedura. A temperatura ambiente, preparare un phy call a due strati per separare le cellule mononucleate del sangue periferico o p BMC e neutrofili in provette da centrifuga da 50 millilitri.

Per prima cosa, aggiungi 15 millilitri di richiamo PHI pesante e poi sovrapponi con cura 10 millilitri di richiamo fi leggero sopra il richiamo fi pesante. Dovrebbe esserci un confine netto tra i livelli di chiamata fi leggeri e quelli di chiamata fi pesanti. Infine, sovrapporre con cura 25 millilitri di campione di sangue diluito sopra la spia luminosa senza disturbare il PHI.

Centrifugare le provette per 30 minuti a temperatura ambiente dopo la centrifugazione, dovrebbero essere presenti più strati. Lo strato di neutrofili con pochi globuli rossi si trova tra il phi leggero e quello pesante. Chiamare utilizzando una pipetta di trasferimento, raccogliere e trasferire lo strato di neutrofili in una nuova provetta da 50 millilitri e aggiungere PBS fino a un volume finale di 50 millilitri.

Centrifugare a 225 volte G per 10 minuti. A temperatura ambiente dopo la centrifugazione, possono esserci ancora globuli rossi mescolati con i neutrofili. Aspirare il surnatante fino a 10 millilitri.

Marco Resus. Sospendere brevemente il pellet di globuli rossi neutrofili, vorticando a bassa velocità, quindi lavare nuovamente con 50 millilitri di PBS, aspirare il surnatante per rimuovere i globuli rossi contaminanti. Risospendere le celle pellettate nel PBS residuo con un breve vortice a bassa velocità.

Aggiungere 25 millilitri di acqua e agitare delicatamente per 10 secondi. Ai pidocchi. I globuli rossi aggiungono 25 millilitri di cloruro di sodio all'1,8% e mescolano immediatamente mediante centrifugazione a 225 volte G per 10 minuti.

I globuli rossi contaminanti dovrebbero ora essere sdraiati lasciando un pellet di cellule neutrofile bianche. Lavare il pellet di cellule neutrofile con PBS, scartare il surnatante e risospendere i neutrofili isolati in terreno RPMI con il 10% di FBS. Dopo aver determinato la concentrazione cellulare al microscopio ottico con un emocitometro, regolare la densità cellulare a 500.000 cellule per millilitro con un terreno RPMI 10%FBS completo.

Prima di iniziare il saggio di adesione della camera di flusso, innescare il VE con 20 nanogrammi per millilitro di TNF alfa umano per quattro-sei ore per sovraregolare e stimolare l'espressione della molecola di adesione. Quando i VE sono pronti, assemblare la camera di flusso. Posizionare il piatto da 35 millimetri contenente il VE confluente sul tavolo del microscopio.

Ai fini di questo video, verrà esaminata solo l'adesione dei neutrofili al VE, ma la stessa procedura si applica allo studio dell'adesione dei neutrofili alle molecole di adesione purificate: collegare la camera di flusso a piastre parallele con la pompa a siringa e il sistema del vuoto e lasciare una linea aperta per l'ingresso dei neutrofili. Inserire la camera di flusso sulla parte superiore della piastra e fissare il gruppo della camera di flusso. Avviare il programma di registrazione video sul computer collegato al microscopio.

Regolare il campo e la messa a fuoco del microscopio fino a quando non è visibile un campo libero con VE completamente sviluppato. Utilizzando la pompa a siringa, sciacquare la camera di flusso con il mezzo RPMI. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria all'interno della camera o della linea di ingresso dei neutrofili.

Utilizzare la pompa a siringa per iniettare i neutrofili nella camera di flusso a velocità definite. Registra il video Poiché l'adesione dei neutrofili può verificarsi rapidamente, un video di quattro o cinque minuti è solitamente sufficiente per quantificare gli eventi di adesione per l'analisi. Questo video mostra un esempio di neutrofili che si legano a una camera di flusso rivestita di HU E.

Una cellula aderente è definita come una cellula che si muove di meno di un diametro cellulare entro cinque secondi. Sulla superficie rivestita HU e. Qui sono mostrati screenshot in diversi punti temporali di video campione di neutrofili che aderiscono a una superficie rivestita di selectina ICAM o a una superficie rivestita di uve.

In entrambi gli esperimenti, la velocità del flusso dei neutrofili è di 350 microlitri al minuto con una densità di neutrofili di 500.000 cellule per millilitro. In condizioni tipiche, è stato osservato che da 50 a 70 neutrofili umani hanno aderito saldamente al ligando o alla superficie rivestita di VE durante un periodo di registrazione di quattro minuti. Tuttavia, varianti alleliche di molecole di adesione dei neutrofili o varianti alleliche nel substrato potrebbero alterare sostanzialmente l'adesione quantitativa dei neutrofili registrando video di lunghezza simile con donatori diversi.

Neutrofili, il numero di cellule di aderenza al minuto può essere calcolato per confrontare le proprietà di adesione tra diversi donatori. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di controllare visivamente i neutrofili per il clampaggio cellulare causato dall'attivazione cellulare indotta dall'isolamento. Inoltre, è possibile eseguire una valutazione citofluorimetrica parallela dell'attivazione cellulare per garantire che lo stato di attivazione delle cellule corrisponda tra i donatori e tra gli esperimenti.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'autoimmunità per esplorare l'adesione cellulare in cellule umane primarie provenienti da donatori di genotipo che hanno diversi alleli della regione codificante della catena B CD 11 dell'integrina beta due, MAC uno. Questi studi hanno permesso una valutazione attenta e quantitativa dell'impatto funzionale di queste varianti alleliche nel sistema umano.