Umano camera di flusso neutrofili saggio

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'adesione stabile dei neutrofili mediante un saggio in camera a flusso che consente l'adesione dei neutrofili umani in presenza di stress di taglio. Ciò viene ottenuto innanzitutto preparando un substrato di molecole di adesione purificate o una superficie di cellule endoteliali, come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana o ve. Il secondo passaggio consiste nel separare i neutrofili dal sangue periferico umano utilizzando un metodo di centrifugazione a due strati con PHI.

Successivamente, la camera a flusso viene assemblata per permettere l'iniezione di neutrofili umani isolati, sotto stress di taglio, sul substrato contenente adesivi, ligandi o ve. L'ultimo passaggio consiste nel registrare gli eventi di adesione dei neutrofili all'interno della camera a flusso, seguito da una accurata quantificazione dell'adesione stabile. In definitiva, il saggio nella camera a flusso viene utilizzato per dimostrare l'adesione stabile dei neutrofili verso molecole di adesione purificate e una superficie HX.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie autoimmuni, come l'importanza funzionale delle variazioni genetiche in molecole tissutali note per essere associate allo sviluppo dell'autoimmunità. Studi genetici effettuati su pazienti affetti da lupus eritematoso sistemico hanno dimostrato una forte associazione con varianti dell'integrina Abeta2, una proteina coinvolta nell'adesione stabile dei neutrofili. Abbiamo sviluppato questo sistema sperimentale per valutare le conseguenze funzionali delle variazioni genetiche in questa beta2 integrina, chiamata Mac-1, sull'adesione stabile. Per preparare le piastre di coltura per l'uso nella camera a flusso.

Aggiungere un millilitro di una soluzione di fibrina e gelatina in ciascuna piastra da coltura tissutale da 35 millimetri e pipettare più volte per assicurarsi che l'intera superficie della piastra sia rivestita. Rimuovere l'eccesso di soluzione di fibronectina e gelatina ed essiccare le piastre all'aria per almeno 30 minuti. Per ottimizzare la formazione della matrice proteica, raccogliere cellule endoteliali di vena ombelicale umana o qve coltivate fino a una confluenza dell'80-90% utilizzando tripsina EDTA e seminare 500.000 cellule in ciascuna piastra da coltura tissutale rivestita.

Aggiungere due millilitri di mezzo di crescita in ogni piastra e incubare a 37 gradi Celsius. Le cellule in un’atmosfera con 5%CO2 devono essere ispezionate visivamente ogni giorno, con cambi del mezzo ogni due giorni. Lasciare crescere le cellule fino a una confluenza dell’80-90%.

Per iniziare questa procedura, utilizzare un pennarello o una penna per disegnare un cerchio di 0,5 centimetri di diametro al centro di una piastra per colture cellulari da 35 millimetri. Aggiungere 20 microlitri di una soluzione di proteina A a 20 microgrammi per millilitro nell'area marcata. Utilizzare la punta della pipetta per distribuire la soluzione di proteina A in modo da coprire l'intera area all'interno del cerchio di 0,5 centimetri di diametro.

È importante non toccare né graffiare la superficie della piastra. Incubare le piastre per colture cellulari a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, lavare ogni piastra rivestita con la proteina a tre volte con un millilitro di PBS.

Dopo aver rimosso il PBS dalla terza piastra di lavaggio, aggiungere 50 microlitri di BSA al 1% nell'area marcata per bloccare il legame non specifico sulla piastra. Incubare a quattro gradi Celsius per due ore. Dopo due ore.

Lavare la piastra bloccata tre volte con un millilitro di PBS. Preparare le soluzioni di proteina chimera del ligando recettoriale per l'adesione FC per la rivestimento e questo esperimento, e ICAM-1 FC Kyra a 25 microgrammi per millilitro e P-selectina FC Kyra a 0,5 microgrammi per millilitro verranno utilizzate. Rivestire l'area marcata con 50 microlitri del substrato, incubare le piastre per colture cellulari tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Le piastre devono essere utilizzate entro due giorni e l'area rivestita non deve essere lasciata asciugare. Se necessario, aggiungere PBS per mantenere 50 microlitri di soluzione sulla piastra.

I neutrofili per questo studio sono isolati dal sangue di partecipanti che hanno fornito consenso informato scritto. Dopo aver prelevato il sangue mediante flebotomia in un tubo per prelievo di sangue con anticoagulante o vacutainer, diluire il sangue in rapporto uno a uno con PBS ed eseguire tutti i passaggi di questa procedura. A temperatura ambiente, preparare un gradiente a due strati di Phy per separare le cellule mononucleate del sangue periferico o pBMCs e i neutrofili in provette da centrifuga da 50 millilitri.

Prima, aggiungere 15 millilitri di soluzione densa di PHI e quindi stratificare con attenzione 10 millilitri di soluzione leggera di fi su quella densa di fi. Deve formarsi un confine netto tra il livello della soluzione leggera di fi e quello della soluzione densa di fi. Infine, stratificare con attenzione 25 millilitri del campione di sangue diluito sulla soluzione leggera di fi senza perturbare il PHI.

Chiamare il centrifugo a strati le provette per 30 minuti a temperatura ambiente dopo la centrifugazione; dovrebbero essere presenti strati multipli. Lo strato di neutrofili con pochi globuli rossi si trova tra il phi leggero e quello pesante. Utilizzando una pipetta di trasferimento, raccogliere e trasferire lo strato di neutrofili in una nuova provetta da 50 millilitri e aggiungere PBS fino a un volume finale di 50 millilitri.

Centrifugare a 225 ×g per 10 minuti. A temperatura ambiente dopo la centrifugazione, potrebbero essere ancora presenti globuli rossi mescolati ai neutrofili. Aspirare il soprannatante fino a raggiungere i 10 millilitri.

Marcare Resus. Sospendere il pellet di neutrofili e globuli rossi mediante vortex breve a bassa velocità, quindi lavare nuovamente con 50 millilitri di PBS. Aspirare il soprannatante per rimuovere i globuli rossi contaminanti. Risospendere le cellule pellettate nel PBS residuo mediante vortex breve a bassa velocità.

Aggiungere 25 millilitri di acqua e vortexare delicatamente per 10 secondi. Ai pidocchi, aggiungere 25 millilitri di cloruro di sodio all'1,8% e mescolare immediatamente mediante centrifugazione a 225 ×g per 10 minuti.

Le cellule rosse contaminanti dovrebbero ora essere lisate, lasciando un pellet cellulare bianco di neutrofili. Lavare il pellet di neutrofili con PBS, scartare il soprannatante e risospendere i neutrofili isolati nel mezzo RPMI con FBS al 10%. Dopo aver determinato la concentrazione cellulare al microscopio ottico con un emocitometro, aggiustare la densità cellulare a 500.000 cellule per millilitro con mezzo RPMI completo contenente FBS al 10%.

Prima di iniziare il saggio di adesione in camera a flusso, pretrattare l'endotelio vascolare (VE) con 20 nanogrammi per millilitro di TNF-α umano per un periodo compreso tra quattro e sei ore, al fine di potenziare e stimolare l'espressione delle molecole di adesione. Quando l'endotelio vascolare (VE) è pronto, assemblare la camera a flusso. Posizionare la piastra da 35 millimetri contenente l'endotelio vascolare (VE) confluenziale sul tavolo del microscopio.

Per gli scopi di questo video, verrà esaminata soltanto l'adesione dei neutrofili all'VE, ma lo stesso procedimento si applica allo studio dell'adesione dei neutrofili a molecole di adesione purificate. Collegare la camera di flusso a piastre parallele alla pompa a siringa e al sistema di vuoto, lasciando un tubo aperto per l'ingresso dei neutrofili. Inserire la camera di flusso sulla piastra e fissare l'insieme della camera di flusso. Avviare il programma di registrazione video sul computer collegato al microscopio.

Regolare il campo e la messa a fuoco del microscopio finché non si visualizza un campo chiaro con VE completamente sviluppate. Utilizzando la pompa a siringa, risciacquare la camera di flusso con mezzo RPMI. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria all'interno della camera o nella linea di ingresso dei neutrofili.

Utilizzare la pompa per siringa per iniettare i neutrofili nella camera a flusso a velocità definite. Registrare il video poiché l'adesione dei neutrofili può avvenere rapidamente; di solito un video della durata di quattro o cinque minuti è sufficiente per quantificare gli eventi di adesione ai fini dell'analisi. Questo filmato mostra un esempio di neutrofili che si legano a una camera a flusso rivestita con HU E.

Una cellula aderente è definita come una cellula che si sposta di meno di un diametro cellulare entro cinque secondi. Sulla superficie rivestita con HU e. Qui vengono mostrati screenshot a diversi intervalli di tempo da video campione di neutrofili che aderiscono a una superficie rivestita con ICAM uno e P-selectina, oppure a una superficie rivestita con uve.

In entrambi gli esperimenti, la velocità di flusso dei neutrofili è di 350 microlitri al minuto con una densità di 500.000 cellule per millilitro. In condizioni tipiche, si è osservato che da 50 a 70 neutrofili umani si sono legati saldamente alla superficie rivestita con ligando o VE durante un periodo di registrazione di quattro minuti. Tuttavia, varianti alleliche delle molecole di adesione dei neutrofili o varianti alleliche nel substrato potrebbero alterare in modo significativo l'adesione quantitativa dei neutrofili, registrando video di durata simile con donatori diversi.

Neutrofili, il numero di cellule aderenti al minuto può essere calcolato per confrontare le proprietà di adesione tra donatori diversi. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante verificare visivamente la presenza di aggregazione cellulare nei neutrofili causata dall'attivazione indotta dall'isolamento. Inoltre, è possibile eseguire una valutazione parallela mediante citometria a flusso dello stato di attivazione cellulare, per assicurare che lo stato di attivazione sia comparabile tra i diversi donatori e tra esperimenti diversi.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'autoimmunità per esplorare l'adesione cellulare in cellule umane primarie provenienti da donatori di genotipo con diversi alleli della regione codificante della catena CD11B del beta due integrina, MAC-1. Questi studi hanno permesso una valutazione accurata e quantitativa dell'impatto funzionale di queste varianti alleliche nel sistema umano.