Name: Colorimetrico carta a base di rilevamento di Escherichia coli, Salmonella Spp., E Listeria monocytogenes Da grandi volumi di acqua agricolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Impara a rilevare patogeni alimentari in grandi volumi di acqua agricolo con il metodo MMS e rilevazione colorimetrica su dispositivi cartacei. Questo protocollo consente il monitoraggio rapido di Escherichia coli, Salmonella e Listeria monocytogenes.

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Ringraziamo il finanziamento per questo progetto da parte dell'USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 e 2009-01984.

1. Concentrazione di batteri da grandi volumi di acqua agricola tramite MMS <ol><li> MMS Preparazione <ol><li> Tagliare una sezione rettangolare di 4 strati di garza misura 40 x 12 centimetri. </li><li> Piegare la garza lungo entrambi gli assi per ottenere un rettangolo di 20 x 6 cm. </li><li> Rotolare la garza ermeticamente lungo il suo asse per formare un tampone cilindrico di circa 6 cm di altezza e 3 cm di diametro. </li><li> Sterilizzare il tampone di garza in un foglio di alluminio, non sterilizzare in autoclave la cassetta. Decontaminare la cassetta immergendolo per 30 min in candeggina 10%, e disattivare il cloro residuo immergendo la cassetta per 15 min in una pentaidrato tiosolfato di sodio (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O) soluzione (50 mg / L preparato in acqua sterile). </li><li> Inserire il tampone nella cassetta MMS. NOTA: Se si utilizza la versione non usa e getta della cassetta MMS, iniziare con un foglio 4 strati di garza measuring 80 x 22 centimetri, piegarlo a 40 x 11 cm e rotolare a formare un cilindro alto circa 11 centimetri e 6 cm di diametro. </li><li> Montare l&#39;MMS. </li><li> Collegare il tubo di vinile perni su entrambi i lati delle MMS, assicurando il tubo aderisce pienamente ai perni, e fissare tubo nella pompa peristaltica. Assicurarsi che la tubazione a monte della pompa peristaltica è di lunghezza sufficiente per il campionamento. </li></ol></li><li> Concentrazione di batteri <ol><li> Esempio di almeno 10 L di acqua agricola eseguendo la pompa peristaltica ad alta velocità. </li><li> Dopo il campionamento è completo, ritirare la pompa peristaltica dal campione di acqua e continuare a funzionare la pompa fino a quando non si osserva acque reflue in uscita dal MMS. </li><li> Se un collettore viene utilizzato per eseguire diversi campioni allo stesso tempo, raccogliere l&#39;effluente di ciascuna MMS, e quando 10 L viene filtrata attraverso un singolo MMS chiudere la valvola per quel MMS particolari e continuare l&#39;esecuzione della pompa. <ol><li> Quando il campionamento is completata, ritirare la pompa peristaltica dall&#39;acqua agricolo, aprire tutte le valvole del collettore, e continuare a funzionare la pompa fino a quando non si osserva acque reflue in uscita dal MMS. </li></ol></li></ol></li><li> Quando la concentrazione è stata completata per tutte MMS, rimuovere con cautela il tubo in vinile dai perni MMS e tappare i rubinetti su entrambi i lati del MMS. MMS ben chiuso possono essere conservati fino a 12 ore prima di aggiungere il supporto di arricchimento. </li></ol> 2. MMS arricchimento e di preparazione del campione <ol><li> Arricchimento <ol><li> Svitare il coperchio delle MMS, e aggiungere asetticamente 20 ml di brodo di arricchimento appropriato sterile. Utilizzare un MMS per ogni arricchimento selettivo. In alternativa, eseguire un arricchimento non selettivo per propagare i tre batteri bersaglio nello stesso campione. NOTA: Se si utilizza la versione non usa e getta della cassetta MMS, rimuovere asetticamente il filtro garza dal cassetto e metterli in un sacchetto sterile prima adding 225 ml di mezzi di comunicazione di arricchimenti adeguati. <ol><li> Per l&#39;arricchimento di E. coli, aggiungere 20 ml di acqua peptonata tamponata (BPW), completata con 8 mg / L di vancomicina cloridrato. </li><li> Per l&#39;arricchimento di Salmonella spp., Aggiungere 20 ml di BPW integrate con il supplemento Salmonella (4 ml / L). </li><li> Per l&#39;arricchimento di L. monocytogenes, aggiungere 20 ml di VIDAS UP Listeria (LPT) brodo. </li><li> Per simultanea di arricchimento non selettivo per tutti e tre i microrganismi che utilizzano un singolo MMS, utilizzare brodo preenrichment universale (UPB). </li></ol></li><li> Avvitare il coperchio del MMS indietro ermeticamente. Assicurarsi che i rubinetti siano ben chiusi per evitare fuoriuscite ed eventuale contaminazione durante arricchimento. </li><li> Incubare gli MMS fino a 18-24 ore in un incubatore agitazione a 200 rpm. Utilizzare 42 ° C per E. coli e Salmonella spp. arricchimenti selettivi. Utilizzare 30 ° C per L. monocytogenes arricchimento selettivo, e utilizzare 37 &amp; #176; C per arricchimento non selettivo. </li></ol></li><li> Preparazione del campione <ol><li> Al termine dell&#39;incubazione, rimuovere gli MMS dal termostato, stappando uno dei perni, e delicatamente erogare circa 0,5 ml in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. In alternativa, svitare i MMS e pipetta su 0,5 ml di arricchimento durante la notte. NOTA: Se si utilizza la versione non-getta della cassetta MMS, pipettare 0,5 ml di arricchimento dal sacchetto. </li><li> Per l&#39;analisi colorimetrica di E. coli arricchimento selettivo, o per l&#39;analisi dei arricchimenti non selettivi, sonicazione 0,5 ml di arricchimento a 5 W, 22 kHz per 20 secondi usando una sonda sonicatore. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione e incorporamento di colorimetrici Substrati in μPADs <ol><li> Preparare abbastanza μPADs per ogni campione e di destinazione testato. Per rilevare E. coli preparare CPRG e X-Gluc μPADs, per la Salmonella spp. rilevamento preparare μPADs MC, e L. monocytrilevamento ogenes preparare μPADs X-InP. <ol><li> Preparare tampone HEPES [0,1 M HEPES con 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA)] per i substrati colorimetrici e regolare il pH del tampone secondo i substrati che sta per essere utilizzato: pH 7,5 per la preparazione di CPRG o X-Gluc, pH 9 per MC, e pH 7 per X-InP. </li><li> Preparare soluzioni madre dei substrati del pH regolato tampone HEPES a concentrazioni di 3 mm (CPRG), 62,5 mm (X-Gluc), 15 mm (MC), 100 mm (X-InP). Proteggere le soluzioni madre dalla luce. </li><li> Posizionare i μPADs all&#39;interno di una piastra di Petri sterile, poi incastonare il microspot μPAD con 24 ml di ogni soluzione stock substrato. </li></ol></li></ol> 4. Rilevamento e analisi dei dati <ol><li> Rivelazione <ol><li> Aggiungere 6 ml di campione arricchito di ogni Microspot μPAD appropriata contenuta in una capsula di Petri. </li><li> Mettere il coperchio sul piatto di Petri e sigillarlo con Parafilm. </li><li> Incubare il campionecon il μPAD a 37 ° C per 3 ore per consentire lo sviluppo del colore e asciugatura dei microspot. </li></ol></li><li> Visiva esame dei risultati <ol><li> Eseguire il rilevamento mediante una semplice ispezione visiva dei cambiamenti di colore dei μPADs. NOTA: in genere, forti reazioni che producono cambiamenti di colore definitivi sono attesi a seguito 18-24 ore di arricchimento, che dovrebbe evitare la necessità di ulteriori chiarimenti e dovrebbe essere considerato positivo. </li><li> Determinare la presenza di un E. coli campione positivo osservando microspot incorporati con cambio CPRG dal giallo al rosso-viola e microspot incorporati con X-Gluc cambiamento da incolore a blu-verde. </li><li> Determinare la presenza di un L. monocytogenes campione positivo osservando microspot incorporati con X-InP cambiamento da incolore a indaco. </li><li> Determinare la presenza di una Salmonella spp. campione positivo da microspot osservando incorporati con MC cambiamento da colorless al viola-malva. </li></ol></li><li> Software Aided Analisi dei dati NOTA: condotto per determinare con chiarezza se le reazioni deboli sono positivi o negativi e per consentire un&#39;analisi semi-quantitativa dei risultati. <ol><li> Lasciare le μPADs asciugare completamente. </li><li> Eseguire la scansione del μPAD utilizzando uno scanner a letto piano. </li><li> Utilizzare il software ImageJ per elaborare l&#39;immagine. <ol><li> &quot;Apri&quot; immagine acquisita da analizzare in ImageJ si trova sotto la scheda &quot;File&quot; nel menu principale (o premere &quot;Clt + O&quot;). </li><li> Invertire l&#39;immagine selezionando &quot;Inverti&quot; che si trova sotto la scheda &quot;Modifica&quot; nel menu principale (o premere &quot;Clt + Maiusc + I&quot;). </li><li> Utilizzare la scheda &quot;Analizza&quot; del menu principale e selezionare &quot;Imposta Misure ...&quot; per selezionare le misure riportate analizzati. </li><li> Assicurarsi che la &quot;intensità di grigio media&quot;, &quot;Limit to soglia&quot; e &quot;scatole etichetta di visualizzazione&quot; sonocontrollato, e premere &quot;OK.&quot; Imposta come il software analizza ogni area selezionata e come riporta esso. </li><li> Utilizzare lo strumento &quot;Oval&quot; per disegnare un cerchio che delinea l&#39;area che si desidera misurare all&#39;interno. </li><li> Nella scheda &quot;Analizza&quot; selezionare &quot;Measure&quot; (o premere &quot;Clt + M&quot;). Il software misurare l&#39;intensità di grigio medio nella zona definita e riportarlo in una schermata pop-up che può essere copiato e incollato in Excel per ulteriori analisi. NOTA: per analisi più accurate, almeno due repliche tecniche di ciascun campione deve essere eseguita. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+for+industry%3A+Guide+to+minimize+microbial+food+safety+hazards+for+fresh+fruits+and+vegetables%22">Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables</a>. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).</li>
<li>Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Modified+Moore+swabs+and+continuous+flow+centrifugation+for+concentration+of+Salmonella+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+from+large+volumes+of+water%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water).</a> J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).</li>
<li>Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Moore+swab+optimization+and+validation+in+capturing+E.+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+in+large+volume+field+samples+of+irrigation+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water.</a> Food Res Int. 51, 654-662 (2013).</li>
<li>McEgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Salmonella+spp.+from+large+volumes+of+water+by+modified+Moore+swabs+and+tangential+flow+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration.</a> Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Solicitation+Number%3A+FDA-SS-1116253%22">Solicitation Number: FDA-SS-1116253</a>. , Administration USFaD. (2013).</li>
<li>Jokerst, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+paper-based+analytical+device+for+colorimetric+detection+of+select+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens.</a> Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+paper+as+a+platform+for+inexpensive%2C+low-volume%2C+portable+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays.</a> Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+A+rapid+method+for+prototyping+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).</li>
<li>Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-printed+microfluidic+multianalyte+chemical+sensing+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper.</a> Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millimeter-scale+contact+printing+of+aqueous+solutions+using+a+stamp+made+out+of+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape.</a> Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).</li>
<li>Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+paper-based+microfluidics+with+wax+for+low-cost%2C+portable+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay.</a> Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).</li>
<li>Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , WO2012125781 A3 (2012).</li>
<li>T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo integrato per rilevare E. coli, Salmonella spp., e L. monocytogenes in acqua agricoltura. Qui, la concentrazione di batteri MMS da grandi volumi (10 L) di acqua agricola, è accoppiato con l&#39;arricchimento di batteri, e la rilevazione colorimetrica batterico-indicativo utilizzando μPADs. La procedura MMS può far fronte a elevato contenuto di particolato nei campioni di acqua concentrando la batteri 10 volte, è abbastanza robusto e semplice per applicazioni sul cam...

E &#39;importante che gli agenti di malattie di origine alimentare vengono rilevati rapidamente e preferibilmente in contesti sul campo, al fine di ridurre l&#39;onere delle malattie di origine alimentare. Strategie comuni per rilevare batteri patogeni di origine alimentare comprendono profili biochimici, coltura selettivo e differenziale, isolamento immunologica e rilevazione, e la diagnosi molecolare. Tuttavia, questi metodi sono ostacolati dalla sporadica contaminazione, campioni di piccole dimensioni testate, le basse concentrazioni spesso dei batteri patogeni di origine alimentare, richiedono tempi di lavorazione lunghi, e / o non sono applicabili per le impostazioni dei campi. Inoltre, composti in molte matrici alimentari inibiscono l&#39;individuazione e applicazioni diagnostiche. Per migliorare la probabilità di rilevamento microbica, la Food and Drug Administration ha suggerito che il test acqua agricola (quali acqua acqua di lavaggio e irrigazione) delle quali viene a contatto con una grande superficie di prodotti freschi o serve come veicolo per pcontaminazione roduce è una valida alternativa alla sperimentazione diretta di prodotti alimentari 1. Anche così, la spesso bassa patogeno-carico naturale, accoppiato con l&#39;effetto di diluizione del campione rappresentativo dell&#39;acqua in agricoltura rende preparazione del campione metodi per la concentrazione di patogeni essenziale. Tale metodo richiederebbe campionamento grandi volumi di acqua (≥ 10 L), adeguata patogeno-concentrazione, e la compatibilità con le strategie di rilevamento a valle. Tamponi Moore modificati (MMS) sono dispositivi a basso costo, semplici e robusti utilizzati per concentrare i batteri dai grandi volumi (≥ 10 L) di acqua 2-4. L&#39;MMS è composto da una cassetta di plastica riempito di garza, che serve come un filtro grossolano per grandi volumi di acqua pompata attraverso il cassetto utilizzando una pompa peristaltica. L&#39;MMS è un metodo non discriminatoria della concentrazione batterica (≥ concentrazione 10 volte) che cattura il materiale particolato organico e inorganico, tra cui i microrganismi in li trasformaticampioni di sterline. E &#39;probabile che l&#39;eccellente efficacia di concentrazione di microrganismi bersaglio, entro il MMS può essere spiegato dal fatto che i microrganismi dovrebbero essere attaccato alla frazione limo-argilla o organici microaggregati dei solidi sospesi 3. Il design robusto di MMS consente di superare la maggior parte dei difetti associati con altri metodi di filtrazione per la cattura e la concentrazione dei batteri dall&#39;acqua, come l&#39;intasamento dei filtri, l&#39;incapacità di elaborare grandi volumi, i campioni del filtro con elevata torbidità e costi elevati. Per questi motivi, la FDA raccomanda che MMS di essere incorporati nelle procedure ufficiali per le procedure di raccolta dei campioni ambientali e produrre correlati 5. Qui, è descritto un metodo per la concentrazione, arricchimento, e la rilevazione di Escherichia coli, Salmonella spp., E Listeria monocytogenes dalle acque agricole. Un MMS è utilizzato per la concentrazione di bacteria, e serve anche come vaso per arricchimento batterica selettiva o non selettiva. Rilevazione batterica si ottiene biochimicamente utilizzando dispositivi analitici basati su carta (μPADs) 6. μPADs possono essere prodotte come reti fluidici o spot test utilizzando una varietà di metodi tra cui fotolitografia, la stampa a getto d&#39;inchiostro, stampaggio, e la stampa a cera 7-11. Esempi di disegni fluidici possono essere modelli di canale dendritiche in cui il campione viene depositato al centro e successivamente flussi di serbatoi distali o modelli a singolo canale in cui il campione o substrato vengono tirati dai serbatoi esterni del canale per azione capillare verso il centro 12. Per questo protocollo, abbiamo scelto di utilizzare per 7 mm di diametro cera carta array loco incastonate con i substrati cromogeni che possono essere elaborati dagli enzimi indicativi dei microrganismi testati qui: Chlorophenol rosso β-D-galattopiranoside (CPRG) e 5 - bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucuronide (X-Gluc)per il rilevamento di β-galattosidasi e β-glucuronidasi prodotta da E. coli; 5-bromo-6-cloro-3-indolil caprilato (magenta caprilato) per la rilevazione di C8-esterasi prodotta da Salmonella spp.; e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-myo-inositolo fosfato (X-InP) per il rilevamento di specifici fosfatidilinositolo-fosfolipasi C (PI-PLC) prodotto da L. monocytogenes 6. Pertanto, la presenza di un particolare batterio può essere osservato visivamente, senza la necessità di attrezzature complesse o l&#39;interpretazione dei dati. La specificità e la sensibilità della rilevazione colorimetrica μPAD a base di enzimi di questi specifici batteri bersaglio è stato esplorato in precedenza 6. Inoltre, la sensibilità del metodo di concentrazione di rilevamento integrato per questi batteri bersaglio è stata valutata da chiodare di grandi volumi di acqua con livelli predeterminati di microrganismi (dati non pubblicati e Bisha et al. 13).

<table><tbody><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> agricola <td>Acqua di irrigazione, acqua di lavaggio dei prodotti, acqua di pozzo, ecc.</td></tr><tr><td>Tubo in vinile</td><td>Wilmar</td><td>BN-CVT1005</td><td>&nbsp; 1/4" diametro interno,&nbsp; Diametro esterno 3/8", disponibile presso:&nbsp; http://www.wilmar.com</td></tr><tr><td>Cartuccia del tampone Moore modificata&nbsp;</td><td>Lumiere Diagnostics</td><td></td><td>11 &frac12; cm di lunghezza e 4 &frac12; cm di larghezza, disponibile all'indirizzo:&nbsp; http://www.lumierediagnostics.com.&nbsp; In alternativa, è possibile utilizzare una versione non usa e getta della cartuccia (fare riferimento al testo)</td></tr><tr><td>Garza</td><td>Chesapeake Wiper & Fornitura, Inc.</td><td>CC90</td><td>Grado #90, trama 44 x 36, disponibile presso:&nbsp; www.raglady.com</td></tr><tr><td>Candeggina per uso domestico</td><td>Varie</td><td></td><td>concentrazioni di ipoclorito di sodio circa 6%</td></tr><tr><td>Tiosolfato di sodio 5-idrato</td><td>Mallinckrodt Baker Inc</td><td>8100-04</td><td></td></tr><tr><td>Collettore</td><td>Costruito internamente</td><td></td><td>Opzionale, il dispositivo può essere costruito con tubi in PVC e raccordi appropriati</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Micron Meter</td><td>RPP1300</td><td>Disponibile presso:&nbsp; http://www.micronmeters.com</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Varie</td><td></td><td>Monouso, 10 ml</td></tr><tr><td>Brodo di prearricchimento universale</td><td>Difco</td><td>223510</td><td></td></tr><tr><td>Acqua peptonica tamponata</td><td>Difco</td><td>218105</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di Salmonella</td><td>Biom&eacute; rieux Industry</td><td>42650</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>VIDAS UP Listeria (LPT) Brodo</td><td>Biom&eacute; rieux Industry</td><td>410848</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861987</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Vari</td><td></td><td>Drummond DP-110 usato qui</td></tr><tr><td>Agitazione incubatore</td><td>Vari</td><td></td><td>Excella E25, New Brunswick Scientific usato qui</td></tr><tr><td>Micropipetta&nbsp;</td><td>Varie</td><td></td><td>10 &mu; l, 1 ml</td></tr><tr><td>Puntali per micropipette</td><td>Varie</td><td></td><td>barriere, 10 &mu; l, 1 ml</td></tr><tr><td>1,5 provette per microcentrifuga</td><td>Vari</td><td></td> sonicatori <td>con sonda privi di RNasi e DNasi</td></tr><tr><td></td><td>Q Sonica LLC</td><td>XL-2000 series</td><td></td></tr><tr><td>&micro; PAD</td><td>all'avanguardia</td><td></td><td>Cerchi di 7 mm di diametro stampati a cera, con spessore della linea di 4 pt. Contatta il Dr. Charles Henry per ulteriori informazioni</td></tr><tr><td>HEPES [N-(2-Idrossietil)piperazina-N&prime; Acido -2-etansolfonico]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>Clorofenolo rosso-galattopiranoside (CPRG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59767</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-glucuronide (X-Gluc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8174</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-6-cloro-3 indolilcaprilato (magenta caprilato)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53451</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-mio-inositolo fosfato (X-InP)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38896</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri, polistirene 100 mm per 15 mm</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scanner a letto piano</td> sterile <td>Vari</td><td></td><td>scanner USB Xerox</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

colorimetrico carta a base di rilevamento di<em&gt; escherichia coli</em&gt;,<em&gt; salmonella</em&gt; spp., e<em&gt; listeria monocytogenes</em&gt; da grandi volumi di acqua agricolo

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Questo protocollo descrive rapida individuazione colorimetrica di Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes e dai grandi volumi (10 L) delle acque agricole. Qui, l&#39;acqua viene filtrata attraverso sterile Modificati Moore Tamponi (MMS), che consistono in un semplice filtro di garza racchiuso in una cartuccia di plastica, per concentrare i batteri. Dopo filtraggio, arricchimenti non selettivi o selettivi per i batteri bersaglio sono eseguiti nel MMS. Per il rilevamento colorimetrico dei batteri bersaglio, i arricchimenti vengono poi analizzati utilizzando dispositivi analitici basati su carta (μPADs) integrati con batteri indicative substrati. Ogni substrato reagisce con enzimi batterici bersaglio-indicativo, generando prodotti colorati rilevabili visivamente (determinazione qualitativa) sul μPAD. In alternativa, le immagini digitali dei μPADs reagito possono essere generati con la scansione comune o dispositivi fotografici e analizzati utilizzando il software ImageJ, alsivo per l&#39;interpretazione più oggettiva e standardizzata dei risultati. Sebbene le procedure di screening biochimici sono progettati per identificare i batteri patogeni di cui sopra, in alcuni casi enzimi prodotti da uno sfondo microbiota o la degradazione dei substrati colorimetrici può produrre un falso positivo. Pertanto, è necessaria una conferma tramite una diagnostica più discriminatorie. Tuttavia, questa concentrazione e rilevazione piattaforma batterica è poco costoso, sensibile (0,1 CFU / ml limite di rivelazione), facile da eseguire, e rapida (concentrazione, arricchimento, e la rilevazione viene effettuata entro circa 24 ore), giustificando il suo uso come metodo di screening iniziale per la qualità microbiologica dell&#39;acqua agricola.

Come descritto in questo protocollo, la concentrazione di batteri utilizzando gli MMS (Figura 1) può essere eseguita in circa 15-20 min. Gli MMS in costruite da acrilonitrile-butadiene-stirene (ABS) in due componenti separati; un coperchio e una cartuccia sia con un gruppo perno integrato nel quale viene inserito un tampone di garza cilindrico (Figura 1A). Entrambi i componenti sono quindi avvitati insieme formano gli MMS (Figura 1B). Trasformazione basata MMS è azionat...

Viene presentato qui un protocollo che coinvolge la concentrazione integrata, l'arricchimento e il rilevamento colorimetrico end-point di agenti patogeni di origine alimentare in grandi volumi di acqua agricola. L'acqua viene filtrata attraverso tamponi di Moore modificati (MMS), arricchiti con terreni selettivi o non selettivi, e il rilevamento viene eseguito utilizzando dispositivi analitici a base di carta (μPAD) incorporati con substrati colorimetrici indicativi dei batteri.

Colorimetrico carta a base di rilevamento di<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp., E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Da grandi volumi di acqua agricolo

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare patogeni trasmissibili con gli alimenti in grandi volumi di acqua agricola. Per raggiungere questo scopo, si assembla uno swab MMS modificato, indicato in seguito come MMS, inserendo al suo interno una piega di garza o tela di juta. Successivamente, sul sito di campionamento, i batteri bersaglio vengono concentrati facendo passare grandi volumi di acqua attraverso l'MMS mediante una pompa peristaltica.Le estremità dei MMS vengono quindi sigillate accuratamente e trasportate in laboratorio. Al MMS viene aggiunto un brodo di arricchimento selettivo o non selettivo, che viene incubato per 18-24 ore. Le colture arricchite vengono quindi raccolte e, per la rilevazione di e coli, vengono preparati i lisati.Questi vengono aggiunti a micro spot su microtamponi impregnati con substrati per la rilevazione enzimatica cromatica e incubati fino a tre ore. I microtamponi vengono quindi esaminati e scansionati. Infine, l'analisi visiva e quantitativa dei micro spot rivela la presenza di *E. coli*, *Salmonella* spp. e *L. monocytogenes* a livelli bassi fino a 0,1 UFC per millilitro.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla filtrazione su membrana e alla coltura su terreni solidi è che consente l'analisi di volumi maggiori di campione d'acqua. Ciò aumenta la sensibilità del saggio e riduce anche il tempo di arricchimento. Il tempo di rilevamento è ulteriormente ridotto entro 24 ore, rispetto alle 24-48 ore richieste dal metodo di filtrazione su membrana.Inoltre, le micropiastrine possono essere utilizzate per rilevare contemporaneamente tre diversi patogeni trasmessi dagli alimenti, cosa che non è possibile fare su un tradizionale terreno batterico solido. Le implicazioni di questa tecnica riguardano l'analisi dell'acqua agricola e anche quella successiva a eventi estremi come incendi boschivi o episodi di precipitazioni intense, entrambi i quali possono causare un aumento della contaminazione microbica delle acque superficiali, utilizzate per l'irrigazione delle colture. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo dovuto effettuare rapidamente lo screening di grandi volumi d'acqua alla ricerca di patogeni dopo gli incendi boschivi in Colorado durante le estati del 2012 e del 2013; il metodo doveva essere adattabile all'uso sul campo a causa delle aree campionate remote, il che rendeva difficile raccogliere e trasportare grandi volumi d'acqua al laboratorio per le analisi.Iniziare questo protocollo preparando un tampone in cotone modificato o MMS, tagliando una sezione rettangolare di garza a quattro strati delle dimensioni di 40 per 12 centimetri. Pieghare la garza lungo entrambi i lati più lunghi per ottenere un rettangolo di 20 per 6 centimetri. Successivamente, arrotolare strettamente la garza lungo il suo asse longitudinale per formare un tampone cilindrico alto circa sei centimetri e con un diametro di tre centimetri.Inserire il tampone nella busta di carta stagnola e sterilizzarlo in autoclave per 15 minuti a 15 PSI utilizzando un ciclo secco. Dopo la sterilizzazione, il dispositivo è pronto per essere trasportato sul campo. Una volta sul posto, collegare il tubo in vinile ai rubinetti su entrambi i lati del MMS, assicurandosi che il tubo aderisca completamente ai rubinetti.Quindi fissare il tubo nella pompa peristaltica. Assicurarsi che il tratto di tubo a monte della pompa peristaltica sia di lunghezza sufficiente per il campionamento e la concentrazione dei batteri. Posizionare l'ingresso della pompa peristaltica nell'acqua agricola da campionare.Fare funzionare la pompa peristaltica a una portata di 300 millilitri al minuto e campionare almeno 10 litri. Al termine del campionamento, rimuovere l'ingresso della pompa peristaltica dal campione d'acqua e continuare a far funzionare la pompa fino a quando non si osserva più acqua in uscita. Uscire dal MMS una volta completata la concentrazione.Per tutti i tamponi MMS modificati, rimuovere con attenzione il tubo in vinile dai beccucci del MMS e chiudere i beccucci su entrambi i lati del MMS; conservare il MMS ben chiuso fino a 12 ore a temperatura di refrigerazione prima dell'aggiunta del terreno di arricchimento. In questo caso, verrà dimostrato l'arricchimento di e coli, salmonella species e l monocytogenes. Un MMS viene utilizzato per ogni arricchimento selettivo.Svitare il coperchio del MMS e aggiungere 20 millilitri di acqua peptonata sterile tamponata o BPW, integrata con otto milligrammi per litro di cloridrato di vancomicina, per l'arricchimento di e coli. Riavvitare saldamente il coperchio del MMS.Per l'arricchimento di specie di salmonella, aggiungere 20 millilitri di BPW sterile integrato con quattro millilitri per litro. Supplemento per salmonella per l'arricchimento di L. monocytogenes, aggiungere 20 millilitri di brodo sterile up list area. Incubare il MMS per 18-24 ore in un incubatore agitato a 150 giri al minuto; al termine dell'incubazione.Rimuovere il MMS dall'incubatore. Svitare il coperchio. Versare delicatamente il mezzo in un tubo Falcon e, utilizzando una pipetta, trasferire delicatamente 0,5 millilitri in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri.In previsione dell'analisi colorimetrica dell'arricchimento selettivo di e coli, oppure per l'analisi degli arricchimenti non selettivi, sonicare 0,5 millilitri di arricchimento a cinque watt e 22 kilohertz per 20 secondi. Utilizzando un omogenizzatore a sonda, preparare soluzioni stock dei substrati C-P-R-G-X glue, magenta cap relate e XINP in tampone heebies con pH aggiustato. Proteggere le soluzioni stock dalla luce per cinque promo sei.CHLORO tre nell'allele, capite o capite magenta è sensibile alla luce e potrebbe produrre risultati falsamente positivi attraverso degradazione autonoma. Per ogni campione e bersaglio testato, posizionare un microtampone all'interno di una piastra di Petri sterile. Per la rilevazione di e coli, preparare i microtamponi CPRG e xgl.Per la rilevazione di specie di salmonella, preparare microdischi con tappo magenta, e per la rilevazione di L. monocytogenes, preparare microdischi XINP. Utilizzando una pipetta, aggiungere su ogni punto microscopico del disco 24 microlitri di ciascuna soluzione madre di substrato. In preparazione alla rilevazione, aggiungere sei microlitri del campione arricchito a ciascun microdisco appropriato.Rimettere il coperchio sulla piastra di Petri e sigillarla con pellicola di parafilm. Incubare il campione con una micro pastiglia a 37 gradi Celsius per un massimo di tre ore per consentire lo sviluppo del colore e l'essiccazione delle micro pastiglie. Al termine dell'incubazione, eseguire il rilevamento mediante semplice ispezione visiva dei cambiamenti di colore delle micro pastiglie.Si noti che reazioni intense che producono cambiamenti di colore definitivi sono generalmente attese dopo 18-24 ore di arricchimento. Queste sono considerate positive e non richiedono ulteriori chiarimenti. Se è presente e coli, microgocce contenenti CPRG cambieranno colore dal giallo al rosso.Punti violetti e microscopici. I punti incorporati con xlu diventeranno da incolori a blu-verdi, come mostrato qui. Se è presente L. monocytogenes, i microscopici punti incorporati con XINP cambieranno da incolori a indaco.Se sono presenti specie di salmonella, le microgocce contenenti magenta capite diventeranno di colore viola, passando da incolori a viola. Nei casi in cui le reazioni siano debolmente positive, utilizzare un software per facilitare un'analisi semi-quantitativa dei risultati. A tale scopo, lasciare asciugare completamente le micropiastrine. Scansionare la micropiastrina utilizzando uno scanner a piastra.Utilizzare il software ImageJ per elaborare l'immagine. Successivamente, in ImageJ, aprire l'immagine scannerizzata da analizzare. Quindi, per invertire l'immagine, fare clic sulla scheda Modifica nel menu principale e selezionare Inverti.Utilizzare la scheda analizza nel menu principale e selezionare imposta misurazioni per scegliere le misurazioni da riportare nell'analisi. Assicurarsi che siano selezionate le opzioni intensità media di grigio, limite per soglia e visualizza caselle etichetta, quindi premere ok. Questa impostazione determina come il software analizza ciascuna area selezionata e come ne riporta i risultati.Successivamente, utilizzando lo strumento ellittico, delimitare l'area da analizzare nella scheda analizza e selezionare misura. Il software misurerà l'intensità media di grigio all'interno dell'area definita e la riporterà in una finestra popup che può essere copiata e incollata in Excel per ulteriori analisi. I saggi con microplacca si basano sul rilevamento di enzimi indicativi dei batteri, che reagiscono con substrati colometrici.I saggi che rilevano E. coli producono un prodotto blu-verde e un prodotto rosso-viola. I saggi che rilevano specie di Salmonella e L. monocytogenes producono rispettivamente colori porpora MOV e indaco. In alternativa, le immagini digitalizzate possono essere elaborate utilizzando il software ImageJ per consentire un'interpretazione dei dati più oggettiva e standardizzata.Qui vengono mostrate immagini digitali a colori e immagini metriche per ogni saggio, comprendenti sia test negativi che positivi. I test negativi sono stati eseguiti utilizzando specie batteriche che non codificano per gli enzimi bersaglio, mentre i test positivi sono stati effettuati con batteri bersaglio. La prima riga mostra le immagini scansionate non modificate, mentre la seconda riga le mostra elaborate.Le immagini scansionate sono state convertite in scala di grigi utilizzando il software ImageJ. E nella riga tre, il colore è stato invertito, per l'interpretazione successiva dell'intensità del grigio.La riga quattro mostra l'intensità media di grigio misurata mediante ImageJ all'interno di ciascun micro spot del micro pad. Un esempio di micro spot è indicato dalla freccia e dal cerchio gialli. Questo grafico mostra le intensità medie di grigio ottenute da quattro replicati, determinate mediante ImageJ. Per ogni colore, test positivo e negativo con micro pad I metrico.Questi dati dimostrano che la rilevazione ambigua dei tre microorganismi bersaglio, concentrati da grandi volumi di acqua agricola, può essere effettuata mediante questa procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come assemblare uno swab di Moore modificato, concentrare i microorganismi di interesse da grandi volumi di acqua agricola e svolgere un'analisi enzimatica colorimetrica su dispositivi analitici a base di carta.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di includere un passaggio di sonificazione per la rilevazione di e coli. È inoltre fondamentale proteggere il substrato magenta capite dalla luce il più possibile. Un'adeguata chiusura e assemblaggio del MMS prima dell'incubazione è essenziale affinché la procedura si completi con un ulteriore sviluppo.Questa tecnica si preannuncia molto utile come approccio semplice, economico e rapido per la diagnostica sul campo di patogeni microbici e microorganismi indicatore, oltre alle applicazioni per la sicurezza alimentare. Tale tecnica potrebbe trovare utilizzo potenziale in microbiologia ambientale e clinica. Non dimenticare che lavorare con microorganismi patogeni può essere estremamente pericoloso, ed è quindi fondamentale evitare il versamento degli arricchimenti batterici e la formazione di bioaerosol.Devono essere sempre osservate le precauzioni standard per la manipolazione di microrganismi patogeni durante l'esecuzione di questa procedura.

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