Colorimetrico carta a base di rilevamento di

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare patogeni trasmissibili con gli alimenti in grandi volumi di acqua agricola. Per raggiungere questo scopo, si assembla uno swab MMS modificato, indicato in seguito come MMS, inserendo al suo interno una piega di garza o tela di juta. Successivamente, sul sito di campionamento, i batteri bersaglio vengono concentrati facendo passare grandi volumi di acqua attraverso l'MMS mediante una pompa peristaltica.

Le estremità dei MMS vengono quindi sigillate accuratamente e trasportate in laboratorio. Al MMS viene aggiunto un brodo di arricchimento selettivo o non selettivo, che viene incubato per 18-24 ore. Le colture arricchite vengono quindi raccolte e, per la rilevazione di e coli, vengono preparati i lisati.

Questi vengono aggiunti a micro spot su microtamponi impregnati con substrati per la rilevazione enzimatica cromatica e incubati fino a tre ore. I microtamponi vengono quindi esaminati e scansionati. Infine, l'analisi visiva e quantitativa dei micro spot rivela la presenza di *E. coli*, *Salmonella* spp. e *L. monocytogenes* a livelli bassi fino a 0,1 UFC per millilitro.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla filtrazione su membrana e alla coltura su terreni solidi è che consente l'analisi di volumi maggiori di campione d'acqua. Ciò aumenta la sensibilità del saggio e riduce anche il tempo di arricchimento. Il tempo di rilevamento è ulteriormente ridotto entro 24 ore, rispetto alle 24-48 ore richieste dal metodo di filtrazione su membrana.

Inoltre, le micropiastrine possono essere utilizzate per rilevare contemporaneamente tre diversi patogeni trasmessi dagli alimenti, cosa che non è possibile fare su un tradizionale terreno batterico solido. Le implicazioni di questa tecnica riguardano l'analisi dell'acqua agricola e anche quella successiva a eventi estremi come incendi boschivi o episodi di precipitazioni intense, entrambi i quali possono causare un aumento della contaminazione microbica delle acque superficiali, utilizzate per l'irrigazione delle colture. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo dovuto effettuare rapidamente lo screening di grandi volumi d'acqua alla ricerca di patogeni dopo gli incendi boschivi in Colorado durante le estati del 2012 e del 2013; il metodo doveva essere adattabile all'uso sul campo a causa delle aree campionate remote, il che rendeva difficile raccogliere e trasportare grandi volumi d'acqua al laboratorio per le analisi.

Iniziare questo protocollo preparando un tampone in cotone modificato o MMS, tagliando una sezione rettangolare di garza a quattro strati delle dimensioni di 40 per 12 centimetri. Pieghare la garza lungo entrambi i lati più lunghi per ottenere un rettangolo di 20 per 6 centimetri. Successivamente, arrotolare strettamente la garza lungo il suo asse longitudinale per formare un tampone cilindrico alto circa sei centimetri e con un diametro di tre centimetri.

Inserire il tampone nella busta di carta stagnola e sterilizzarlo in autoclave per 15 minuti a 15 PSI utilizzando un ciclo secco. Dopo la sterilizzazione, il dispositivo è pronto per essere trasportato sul campo. Una volta sul posto, collegare il tubo in vinile ai rubinetti su entrambi i lati del MMS, assicurandosi che il tubo aderisca completamente ai rubinetti.

Quindi fissare il tubo nella pompa peristaltica. Assicurarsi che il tratto di tubo a monte della pompa peristaltica sia di lunghezza sufficiente per il campionamento e la concentrazione dei batteri. Posizionare l'ingresso della pompa peristaltica nell'acqua agricola da campionare.

Fare funzionare la pompa peristaltica a una portata di 300 millilitri al minuto e campionare almeno 10 litri. Al termine del campionamento, rimuovere l'ingresso della pompa peristaltica dal campione d'acqua e continuare a far funzionare la pompa fino a quando non si osserva più acqua in uscita. Uscire dal MMS una volta completata la concentrazione.

Per tutti i tamponi MMS modificati, rimuovere con attenzione il tubo in vinile dai beccucci del MMS e chiudere i beccucci su entrambi i lati del MMS; conservare il MMS ben chiuso fino a 12 ore a temperatura di refrigerazione prima dell'aggiunta del terreno di arricchimento. In questo caso, verrà dimostrato l'arricchimento di e coli, salmonella species e l monocytogenes. Un MMS viene utilizzato per ogni arricchimento selettivo.

Svitare il coperchio del MMS e aggiungere 20 millilitri di acqua peptonata sterile tamponata o BPW, integrata con otto milligrammi per litro di cloridrato di vancomicina, per l'arricchimento di e coli. Riavvitare saldamente il coperchio del MMS.

Per l'arricchimento di specie di salmonella, aggiungere 20 millilitri di BPW sterile integrato con quattro millilitri per litro. Supplemento per salmonella per l'arricchimento di L. monocytogenes, aggiungere 20 millilitri di brodo sterile up list area. Incubare il MMS per 18-24 ore in un incubatore agitato a 150 giri al minuto; al termine dell'incubazione.

Rimuovere il MMS dall'incubatore. Svitare il coperchio. Versare delicatamente il mezzo in un tubo Falcon e, utilizzando una pipetta, trasferire delicatamente 0,5 millilitri in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

In previsione dell'analisi colorimetrica dell'arricchimento selettivo di e coli, oppure per l'analisi degli arricchimenti non selettivi, sonicare 0,5 millilitri di arricchimento a cinque watt e 22 kilohertz per 20 secondi. Utilizzando un omogenizzatore a sonda, preparare soluzioni stock dei substrati C-P-R-G-X glue, magenta cap relate e XINP in tampone heebies con pH aggiustato. Proteggere le soluzioni stock dalla luce per cinque promo sei.

CHLORO tre nell'allele, capite o capite magenta è sensibile alla luce e potrebbe produrre risultati falsamente positivi attraverso degradazione autonoma. Per ogni campione e bersaglio testato, posizionare un microtampone all'interno di una piastra di Petri sterile. Per la rilevazione di e coli, preparare i microtamponi CPRG e xgl.

Per la rilevazione di specie di salmonella, preparare microdischi con tappo magenta, e per la rilevazione di L. monocytogenes, preparare microdischi XINP. Utilizzando una pipetta, aggiungere su ogni punto microscopico del disco 24 microlitri di ciascuna soluzione madre di substrato. In preparazione alla rilevazione, aggiungere sei microlitri del campione arricchito a ciascun microdisco appropriato.

Rimettere il coperchio sulla piastra di Petri e sigillarla con pellicola di parafilm. Incubare il campione con una micro pastiglia a 37 gradi Celsius per un massimo di tre ore per consentire lo sviluppo del colore e l'essiccazione delle micro pastiglie. Al termine dell'incubazione, eseguire il rilevamento mediante semplice ispezione visiva dei cambiamenti di colore delle micro pastiglie.

Si noti che reazioni intense che producono cambiamenti di colore definitivi sono generalmente attese dopo 18-24 ore di arricchimento. Queste sono considerate positive e non richiedono ulteriori chiarimenti. Se è presente e coli, microgocce contenenti CPRG cambieranno colore dal giallo al rosso.

Punti violetti e microscopici. I punti incorporati con xlu diventeranno da incolori a blu-verdi, come mostrato qui. Se è presente L. monocytogenes, i microscopici punti incorporati con XINP cambieranno da incolori a indaco.

Se sono presenti specie di salmonella, le microgocce contenenti magenta capite diventeranno di colore viola, passando da incolori a viola. Nei casi in cui le reazioni siano debolmente positive, utilizzare un software per facilitare un'analisi semi-quantitativa dei risultati. A tale scopo, lasciare asciugare completamente le micropiastrine. Scansionare la micropiastrina utilizzando uno scanner a piastra.

Utilizzare il software ImageJ per elaborare l'immagine. Successivamente, in ImageJ, aprire l'immagine scannerizzata da analizzare. Quindi, per invertire l'immagine, fare clic sulla scheda Modifica nel menu principale e selezionare Inverti.

Utilizzare la scheda analizza nel menu principale e selezionare imposta misurazioni per scegliere le misurazioni da riportare nell'analisi. Assicurarsi che siano selezionate le opzioni intensità media di grigio, limite per soglia e visualizza caselle etichetta, quindi premere ok. Questa impostazione determina come il software analizza ciascuna area selezionata e come ne riporta i risultati.

Successivamente, utilizzando lo strumento ellittico, delimitare l'area da analizzare nella scheda analizza e selezionare misura. Il software misurerà l'intensità media di grigio all'interno dell'area definita e la riporterà in una finestra popup che può essere copiata e incollata in Excel per ulteriori analisi. I saggi con microplacca si basano sul rilevamento di enzimi indicativi dei batteri, che reagiscono con substrati colometrici.

I saggi che rilevano E. coli producono un prodotto blu-verde e un prodotto rosso-viola. I saggi che rilevano specie di Salmonella e L. monocytogenes producono rispettivamente colori porpora MOV e indaco. In alternativa, le immagini digitalizzate possono essere elaborate utilizzando il software ImageJ per consentire un'interpretazione dei dati più oggettiva e standardizzata.

Qui vengono mostrate immagini digitali a colori e immagini metriche per ogni saggio, comprendenti sia test negativi che positivi. I test negativi sono stati eseguiti utilizzando specie batteriche che non codificano per gli enzimi bersaglio, mentre i test positivi sono stati effettuati con batteri bersaglio. La prima riga mostra le immagini scansionate non modificate, mentre la seconda riga le mostra elaborate.

Le immagini scansionate sono state convertite in scala di grigi utilizzando il software ImageJ. E nella riga tre, il colore è stato invertito, per l'interpretazione successiva dell'intensità del grigio.

La riga quattro mostra l'intensità media di grigio misurata mediante ImageJ all'interno di ciascun micro spot del micro pad. Un esempio di micro spot è indicato dalla freccia e dal cerchio gialli. Questo grafico mostra le intensità medie di grigio ottenute da quattro replicati, determinate mediante ImageJ. Per ogni colore, test positivo e negativo con micro pad I metrico.

Questi dati dimostrano che la rilevazione ambigua dei tre microorganismi bersaglio, concentrati da grandi volumi di acqua agricola, può essere effettuata mediante questa procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come assemblare uno swab di Moore modificato, concentrare i microorganismi di interesse da grandi volumi di acqua agricola e svolgere un'analisi enzimatica colorimetrica su dispositivi analitici a base di carta.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di includere un passaggio di sonificazione per la rilevazione di e coli. È inoltre fondamentale proteggere il substrato magenta capite dalla luce il più possibile. Un'adeguata chiusura e assemblaggio del MMS prima dell'incubazione è essenziale affinché la procedura si completi con un ulteriore sviluppo.

Questa tecnica si preannuncia molto utile come approccio semplice, economico e rapido per la diagnostica sul campo di patogeni microbici e microorganismi indicatore, oltre alle applicazioni per la sicurezza alimentare. Tale tecnica potrebbe trovare utilizzo potenziale in microbiologia ambientale e clinica. Non dimenticare che lavorare con microorganismi patogeni può essere estremamente pericoloso, ed è quindi fondamentale evitare il versamento degli arricchimenti batterici e la formazione di bioaerosol.

Devono essere sempre osservate le precauzioni standard per la manipolazione di microrganismi patogeni durante l'esecuzione di questa procedura.