Attivazione Monitoraggio del Pattern Recognition antivirale recettori RIG-I E PKR By limitata proteasi Digestione e PAGE Native

Le difese innate contro le infezioni virali sono attivate dai recettori di riconoscimento dei pattern o prrs. Presente nelle cellule del sistema immunitario innato durante un'infezione. L'occhio citoplasmatico del rig PRRS e PKR si legano alla firma virale, gli RNA cambiano la conferma di tutti gli occhi della liga e attivano la segnalazione antivirale per monitorare i cambiamenti di conferma dell'occhio del rig e PKR e tutte le cellule di legamentosità in vitro umane A 5 49 sono infettate dal virus della febbre della Rift Valley.

Clone 13 per stimolare l'attivazione della PRR. I lisati cellulari di controllo e le cellule infette vengono quindi preparati per l'analisi dei cambiamenti di conferma dell'occhio di rig e del PKR. Viene eseguita una digestione con prova limitata.

Se si sono verificati cambiamenti confermativi nella struttura della proteina, la proteina è più resistente alla digestione e si vedranno le bande con Western blotting Viene eseguita l'analisi per analizzare la formazione della pagina nativa di allgas seguita dall'analisi del western blotting. Se tutte le legamentizzazioni sono avvenute più in alto, si vedono tutti i complessi liga rig eye e PKR. Il vantaggio principale della digestione limitata della proteasi e della pagina nativa è che queste tecniche facilitano la misurazione diretta dell'attivazione di rega e PKR.

Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunità innata, come ad esempio qual è l'esatta natura e origine delle specie di RNA rilevanti per l'attivazione di rig eye e PKR. Questi metodi possono fornire informazioni sull'occhio del rig e sugli agonisti PKR. Possono anche essere applicati ad altre proteine sensore citoplasmatiche come MDA cinque, a dimostrare la procedura sarà Mila Viva, una dottoranda del mio laboratorio Prima di iniziare questa procedura.

Si prega di notare che il clone 13 del virus della febbre della Rift Valley, di seguito denominato CL 13, è un mutante virale attenuato, che in Germania deve essere maneggiato in due condizioni BSL per preriscaldare il terreno privo di siero PBS e il terreno di coltura cellulare contenente il 5% di FCS. Metterli a bagnomaria in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Preparare 1,25 volte 10 al settimo PFU per millilitro di CL 13 in terreno libero dal siero per infettare 2,5 volte 10 al sesto.

A 5-49 cellule con una molteplicità di infezioni o MOI di cinque preparano circa il 10% in più del necessario per tenere conto degli errori di pipettaggio. Rimuovere le cellule A 5 49 dall'incubatore, aspirare il terreno e aggiungere 10 millilitri di PBS swirl o rovesciare il pallone di coltura per lavare le cellule e quindi rimuovere il PBS. Successivamente, aggiungere un millilitro di CL 13 diluito o per il controllo non infetto o l'infezione simulata.

Aggiungere un millilitro di terreno libero di siero e incubare per un'ora ogni 15 minuti. Inclinare con cautela il pallone per garantire una distribuzione uniforme del fluido. Dopo un'ora dall'infezione, rimuovere l'inoculare.

Aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura cellulare preriscaldato con il 5% di FCS e incubare per cinque ore. Preparare il PBS con tritton X 100 allo 0,5% e posizionarlo a quattro gradi Celsius. Non aggiungere inibitori della proteasi siriana.

Successivamente, lavare le celle con PBS freddo e aggiungere 10 millilitri di PBS fresco. Quindi, utilizzando un raschietto cellulare, staccare le cellule dal piatto. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 800 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 30 microlitri di PBS con 0,5% di Triton X 100. Trasferire il lisato in una provetta fresca da 1,5 millilitri e incubare per almeno 10 minuti con ghiaccio. Centrifugare il lisato a 10.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, trasferire il lisato cellulare chiarificato in una nuova provetta. Eseguire un test Bradford per determinare la concentrazione proteica nel lisato cellulare chiarificato Conservare a meno 20 gradi Celsius o procedere immediatamente a provare e digestione o pagina nativa per analizzare per confermare i cambiamenti dei recettori di riconoscimento del modello prima diluire L un tosto cloro, metilchetone trattato o tripsina TPCK in PBS a una concentrazione di lavoro finale di due microgrammi per millilitro in due nuove provette per ciascuna condizione, regolare la concentrazione proteica finale del CL 13 e dei lisati proteici di controllo non infetti a 25 microgrammi in un volume finale di nove microlitri con PBS, un set di lisati verrà utilizzato come controllo di input e l'altro sarà trattato con tripsina TPCK nelle provette di controllo non trattate. Aggiungere un microlitro di PBS ai due tubi rimanenti.

Aggiungere un microlitro di due microgrammi per microlitro di tripsina TPCK per portare la concentrazione finale a 0,2 microgrammi per microlitro. Miscelare le reazioni mediante pipettaggio. Incubare i lisati a 37 gradi Celsius per 25 minuti.

Arrestare la reazione aggiungendo cinque tamponi di campionamento denaturanti e quindi facendo bollire per cinque minuti a 95 gradi Celsius. È importante non prolungare il tempo di incubazione della tripsina. Si noti che la tempistica precisa della digestione della tripsina è fondamentale per il rilevamento di frammenti resistenti senza alcun fondo se non vengono rilevate proteine resistenti o se ne vengono rilevate troppe, la durata della digestione è regolata. Secondo.

Dopo l'ebollizione, conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius o caricare i campioni con due solfato di sodio docale. Gel di poliacrilammide costituiti da un gel impilabile al 5% su un gel risolutivo al 12%. Separare le proteine a 25 milliampere per gel fino a quando il blu di fenolo bromo si esaurisce.

Dopo aver eseguito i gel, trasferire le proteine da un gel a una membrana di fluoruro di polivite e analizzarle mediante western blotting con anticorpi diretti contro l'occhio di rig e colorare PKR l'altro gel con kumasi blu brillante G due 50. Quindi conservare il gel in etanolo al 25%, acido acetico all'8% e glicerolo al 4% a quattro gradi Celsius o procedere con l'imaging e l'analisi. Per analizzare gli stati oligomerici dei recettori di riconoscimento dei pattern, preparare 50 microgrammi di lisato cellulare in un volume finale di 10 microlitri con PBS e aggiungere cinque tamponi campione a una concentrazione finale di uno x.

Caricare immediatamente i campioni su un gel nativo di poliacrilammide con un gel impilabile al 5% e un gel risolutivo all'8%. Qualsiasi ritardo comporterà una perdita di complessi nativi. Far funzionare il gel a 20 milliampere per gel a quattro gradi Celsius.

Interrompere l'elettroforesi 45 minuti dopo che la banda blu del fenolo Bromo ha lasciato il gel dopo un totale di circa 1,5-2 ore per eseguire il Western blotting utilizzando anticorpi diretti contro rig eye e PKR come descritto nel documento di accompagnamento per il test per la commutazione confermativa e l'oligo indotto dal riconoscimento di un agonista virale da parte di rig eye o PKR digestione limitata della proteasi e pagina nativa sono stati eseguiti come descritto in questo video, La digestione della tripsina di finti lisati cellulari infetti ha provocato una rapida degradazione dell'occhio di Rig, mentre l'infezione da clone 13 ha portato alla generazione di un frammento di occhio di Rig resistente a 30 kilodalton. PKR mostra anche una parziale resistenza alla digestione della tripsina nei campioni infetti, che coincide con la sua fosforilazione per monitorare l'efficienza e la specificità della tripsina I gel per la digestione sono stati colorati con kumasi blu brillante G due 50. I campioni non trattati mostrano quantità uguali di proteine caricate, sottoponendo i lisati cellulari mock e C 13 alla digestione della tripsina porta a una diminuzione comparabile delle quantità proteiche globali.

Ciò dimostra che il trattamento con tripsina ha la stessa efficienza per i campioni mock e infetti da CL 13 in cellule non infette. Solo i monomeri di R EYE e PKR sono stati rilevati come controllo aggiuntivo. È stato incluso il fattore di trascrizione IRF tre, che è presente come monomero, ma noto per dimerizzare dopo l'attivazione tramite R Eye.

L'infezione da clone 13 porta ad un forte accumulo di complessi oligomerici rig eye sotto forma di striscio e di PKR e IRF a tre dimeri o oligomeri come banda proteica definita. Questi risultati dimostrano che i viaggi limitati nella digestione e nella pagina nativa sono strumenti utili per monitorare i cambiamenti di conferma e la formazione di oligo dell'occhio di rig e della PKR dopo l'infezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare la commutazione e l'izzazione dell'occhio WIC e della conferma PKR una volta padroneggiata.

Questa tecnica può essere eseguita in due giorni dopo questa procedura. Come metodi, i saggi professionali possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se c'è un'interazione stabile con il ligando stimolante dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunità innata per esplorare lo stato di attivazione dei recettori di riconoscimento dei modelli nelle cellule stimolate virali.