Name: Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Scopri la registrazione juxtacellulare per monitorare l'attività di singoli neuroni nelle strutture sottocorticali di ratti svegli con testa fissa. Questo metodo consente l'isolamento inequivocabile delle unità e la localizzazione anatomica precisa.

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Siamo grati agli Istituti canadesi di ricerca sanitaria (sovvenzione MT-5877), agli Istituti Nazionali di Sanità (sovvenzioni NS058668 e NS066664) e alla Fondazione binazionale USA-Israele (sovvenzione 2003222) per aver finanziato questi studi.

Sono stati effettuati i protocolli sperimentali su ratti femmine lungo Evans (250-350 g) in conformità alle linee guida per la cura degli animali e uso federale prescritti e sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso l&#39;Università della California a San Diego. 1. acclimatare il Ratto di Corpo Restraint NOTA: Posizionare il ratto su una dieta ristretta. Alimentare il topo una volta al giorno immediatamente dopo ogni sessione di trattamento al giorno per ambientarsi il ratto al sistema di ritenuta (descritto di seguito). Fornire abbastanza alimentazione per mantenere l&#39;animale al 80% del suo peso iniziale. Tale importo è di circa 6 grammi di mangime al giorno per 250 g femminile di lunga Evans ratto. <ol><li> Acclimatare il ratto di essere manipolati da esseri umani. Frenare delicatamente il ratto a mano per periodi di circa 5 sec ogni 30 sec. Fate questo per 15 minuti al giorno su 2 giorni consecutivi. Monitorare i ratti al giorno per i segni di stress durante il periodo di formazione. Segni includono lottando iRisposta n a moderazione, la vocalizzazione, e denti chattering. </li><li> Al 3 ° giorno, collocare il ratto in un panno calzino-limitante corpo (Figura 1) per 15 minuti al giorno per due giorni consecutivi. </li><li> Al 5 ° giorno, posizionare il ratto all&#39;interno della calza, e posizionare il calzino all&#39;interno di un tubo rigido sulla maschera sperimentale (Figura 4). Lasciare il ratto nel tubo per 15 min al giorno su 2 giorni consecutivi. </li><li> Concime subito il ratto dopo ogni sessione di allenamento. Al termine dell&#39;ultima sessione (6 ° giorno) darà accesso illimitato al cibo. Selezionare per l&#39;impianto solo i topi che non presentano segni di stress eccessivo l&#39;ultimo giorno di allenamento. NOTA: Sebbene selezione di ratti per l&#39;impianto è soggettiva, nelle nostre mani oltre il 90% dei ratti sono stati trovati per essere sensibili alle assuefazione e in grado di subire l&#39;impianto. </li></ol> 2. Impianto del meccanismo di camera di registrazione e poggiatesta <ol><li> Fare un reconferenza filo da saldatura filo di acciaio inossidabile nudo a un connettore pin. Tagliare il filo in modo che resti 3-5 mm scoperti dal perno. Sterilizzare il filo di riferimento, insieme a tutti gli strumenti chirurgici. </li><li> Somministrare ketamina / xylazina anestesia. Somministrare 95 mg / kg ketamina mescolato con 5 mg / kg per via intraperitoneale xilazina. La dose iniziale dura 1½ a 2 ore. Supplemento anestesia ogni 30-45 minuti, successivamente, se necessario. Lubrificare occhi dell&#39;animale con una pomata oftalmica. </li><li> Controllare il riflesso recesso punta per determinare il piano di anestesia, e mantenere l&#39;anestesia, se necessario. </li><li> Posizionare il topo in una cornice di partecipazione stereotassico con barre orecchio (Figura 3A). Radersi i capelli sulla testa e disinfettare la ferita con povidone-iodio (soluzione al 10%). Fare attenzione a inserire le barre di orecchio in modo appropriato in modo che non danneggino il timpano. Barre di orecchio con punte smussate sono preferibili. </li><li> Praticare un&#39;incisione con un approxi bisturinell&#39;intervallo lungo la linea mediana del cranio dal livello rostro-caudale degli occhi alla parte posteriore delle orecchie. Utilizzare forbici per tagliare e rimuovere una striscia di 2-3 mm di cute su entrambi i lati dell&#39;incisione. </li><li> Raschiare periostio per esporre la superficie del cranio verso le creste laterali. Coprire il cranio esposta con sottile strato di colla. </li><li> Praticare un piccolo foro con un diametro leggermente inferiore rispetto 0-80 viti, utilizzando un trapano bava ½ mm di diametro (vedi sezione Materiali). Praticare il foro posteriormente immediatamente a dove la sutura bregma incontra la cresta laterale, e con un angolo di 30-45 ° nel cranio, in modo che la vite può andare a cima più laterale rispetto al fondo. </li><li> Avvitare una vite 0-80 macchina a fondo piatto al foro (circa 3 giri), a 30-45 °. Fare attenzione a non avvitare troppo profondamente per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale sottostante. </li><li> Ripetere questa procedura per 6 viti supplementari nella configurazione mostrata <strong&gt; (Figura 3B). Applicare colla alla base di tutte le viti. </li><li> Inserire un ago della siringa nel manipolatore stereotax. Misurare dalla sutura bregma, e fare un&#39;ammaccatura nel cranio con l&#39;ago vicino, ma al di fuori del luogo craniotomia desiderata, come un marchio di riferimento. NOTA: In questa dimostrazione, le coordinate stereotassica del marchio sono di 3 mm posteriori e 1 mm laterali alla sutura bregma. </li><li> Segna il dente con un pennarello indelebile. Nota le coordinate stereotassica del marchio, in quanto servirà come punto di riferimento stereotassico (Figura 3B). </li><li> Fare una craniotomia centrato sulle coordinate desiderate (da 3 mm posteriormente e 3 mm laterali bregma in questo esempio). Lasciare la dura madre intatto. Coprire la craniotomia con liquido cerebro-spinale artificiale modificato (125 mM NaCl, il glucosio 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM CaCl 2, 1.3 mM MgCl 2, pH 7.4) 13 (Figura 3C). </li&gt; <li> Tagliare un tubo di 0,2 ml centrifuga a 4 - 5 mm di lunghezza, e tagliare il tappo. Posizionare il tubo sul cranio e centrare la craniotomia. </li><li> Applicare cemento dentale intorno alla parte inferiore del tubo per sigillare la base del tubo al cranio. Fare attenzione a non far trapelare il cemento in craniotomia esposta (Figura 3D). </li><li> Praticare un piccolo foro (circa ½ mm di diametro) nella piastra cranica controlaterale e inserire delicatamente il filo di riferimento. Costruire il filo di riferimento saldando un perno che si interfaccia con l&#39;amplificatore registrazione alla fine del filo (vedi sezione Equipment). Non spostare il cavo di riferimento una volta che è nel cervello in quanto ciò potrebbe causare danni. </li><li> Applicare colla al foro in cui è stato inserito il filo. Questo sigillare il perno e il filo in luogo temporaneamente. </li><li> Mescolare le due parti del kit gel di silicone (vedere la sezione Materiali) in porzioni di circa uguali. Attendere due minuti per la miscelazione e fill provetta di circa ⅓ completo con il gel. </li><li> Fissare un diritto pinza angolare posta (vedere la sezione Materiali) alla barra di poggiatesta. Fissare la piastra di testa (figura 2A) per la barra di tenuta (Figura 2B) con un angolo di passo di 45 ° in modo che la parte inferiore della piastra sia verso il naso dell&#39;animale. È utile utilizzare un inclinometro per impostare l&#39;angolo di inclinazione corrispondente a quello della dima sperimentale (Figura 4). </li><li> Fissare la barra di tenuta al braccio stereotax manipolatore in modo che la barra sia parallela alle barre orecchio. Abbassare la barra e la piastra in modo che la piastra è posteriore della sutura lambda e anteriore al caudale più a vite. </li><li> Afferrare la testa bullone anteriore (a 8-32 perno o vite, vedere la sezione Materiali) a circa 45 ° con una mano aiutando braccio e pinza, in modo che la testa della vite rivolto verso il basso e verso la coda dell&#39;animale. Abbassare la vite in modo che tocchi la formicaerior 0-80 viti (Figura 3F, G). </li><li> Fissare il bullone e la piastra in posizione con acrilico dentale. Applicare acrilico dentale attorno alle teste delle viti dell&#39;osso, perno di riferimento, e intorno ai lati del tubo da centrifuga. Attendere circa 10 minuti per l&#39;acrilico dentale asciugare (Figura 3H). </li><li> Applicare uno strato di cemento dentale attorno ai bordi del acrilico dentale, cementando la pelle per l&#39;impianto. Attendere che il cemento si asciughi. </li><li> Poke diversi fori nel tappo della provetta, e posizionare il tappo sul tubo. </li><li> Rimuovere la fascetta mani aiutare. Quindi rimuovere con attenzione la barra testa-holding dalla stereotax, e quindi rimuovere la piastra testa dalla barra (Figura 3I). </li><li> Rimuovere l&#39;animale dal stereotax e amministrare cure post-operatorie e il monitoraggio in conformità con tutte le norme, i regolamenti e le leggi (ad esempio, Buprenorfina 0,02 mg / kg, ogni 8-12 ore per un minimo di 24hr). Se l&#39;infiammazione si sviluppa intorno ai bordi della protesi, applicare uno strato sottile di unguento antibiotico al sito interessato giorni fino risolto. </li></ol> 3. Juxtacellular monitoraggio delle unità neuronali <ol><li> Tirare il tubo capillare di quarzo su un anidride carbonica micropipetta laser estrattore (vedi sezione Equipment) con diametro di punta di meno di 1 micron (Figura 5A). NOTA: i parametri di riscaldamento variano a seconda del particolare strumento, e che il diametro del collo richiesto varierà a seconda della struttura cerebrale di interesse. Per le registrazioni nel ratto talamo, micropipette sono colli che vanno da 5-7 mm. </li><li> Fissare la pipetta in luogo sotto un contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopio equipaggiato con obiettivi distanza di lavoro. Utilizzare plastilina per tenere la pipetta in posizione sul palco del microscopio. </li><li> Lentamente spostare un blocco di vetro (0,5 - 1 cm di spessore, un pezzo di vetro usato per making coltelli ultra-microtomo è conveniente) nel campo visivo, con la punta della pipetta. Utilizzando il micromanipolatore fase, toccare delicatamente la punta della pipetta di vetro, provocando la rottura. Ripetere se necessario fino a quando il diametro esterno punta della pipetta è tra 1-3 micron (Figura 5B, C). Assicurarsi che questi micropipette hanno impedenze tra circa 5-15 MW. </li><li> Preparare salina extracellulare (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2 con NaOH) 8 e aggiungere 2% (w / v) Chicago Sky blu. Usando una siringa con un ago 30 G o minore, riempire la estremità posteriore della pipetta con la soluzione. In alternativa, per singola cellula etichettatura juxtacellular aggiungere 2% (w / v) Neurobiotin o biotinilato ammina destrano (BDA-3000 o BDA-10000) alla soluzione salina al posto di Chicago Sky blu. </li><li> Posizionare il topo all&#39;interno della calza panno all&#39;interno del tubo rigido in adeguato maschera sperimentale ( <strong&gt; Figura 4) .Wait un minimo di 72 ore dopo l&#39;intervento chirurgico prima di mettere l&#39;animale in maschera poggiatesta. Stringere la coulisse intorno sterno superiore, piuttosto che il collo, per evitare l&#39;ostruzione delle vie aeree. Se la respirazione sembra essere lavorato o ostacolato, allentare la coulisse o spostarlo posteriormente. Effettuare questa procedura, mentre il topo è vigile. </li><li> Fissare la piastra di testa di ritenuta sul ratto al pezzo corrispondente sulla maschera. Per fare questo, prima pin la piastra poggiatesta in luogo, e poi fissarlo con una vite 4-40. Ricordarsi di aspettare fino a quando l&#39;animale è calma per evitare di applicare una coppia eccessiva alla testa. Successivamente, posizionare un 8-32 dado sul bullone testa frenare che viene impiantato nel topo. Quindi avvitare in un tondino di acciaio inossidabile filettato per la testa del bullone. Fissare l&#39;asta alla maschera sperimentale in modo tale che possa essere serrato in posizione (figura 4). NOTA: Protezione animale con testa del bullone e la piastra poggiatesta minimizes piegatura dell&#39;apparato e migliora la stabilità di registrazione. Nella maggior parte dei casi la registrazione può iniziare il primo giorno l&#39;animale è capo-trattenuto. Tuttavia, se l&#39;animale si agita eccessivamente o vocalizza, fornire una giornata di formazione assuefazione poggiatesta prima di iniziare le registrazioni. In questo caso, l&#39;animale lasciato sulla maschera per 15 min e poi riposizionarlo nella sua gabbia. Ripetere questo passaggio il giorno successivo e continuare con il protocollo. </li><li> Aprire la camera di registrazione e rimuovere il gel di silicone. Pulire la craniotomia utilizzando una pinza sottile se il tessuto è nuovamente cresciuta in craniotomia. </li><li> Fissare la pipetta al micromanipolatore motorizzato, e collegare il headstage pre-amplificatore. NOTA: Nel presente dimostrazione, un piccolo circuito relè sul headstage viene utilizzato per passare i cavi amplificatore e una sorgente di corrente esterna con alta compliance (Figura 6A-C). Si noti che alcuni amplificatori hanno un adeguato incasso sorgente ad alta compliance(Vedi la discussione e Materiali sezioni). </li><li> Utilizzare il micromanipolatore motorizzato per spostare la punta della pipetta a volume stereotaxically identificato nella camera di registrazione. Nota le coordinate di questa posizione. Fare attenzione a non rompere la punta della pipetta sul cranio. </li><li> Spostare la pipetta nella posizione di registrazione desiderata negli assi antero-posteriore e medio-laterale. Poi avanzare la pipetta ventrale attraverso la dura fino a quando non è di circa 500 micron dorsale nella posizione di registrazione prevista. </li><li> Lentamente avanzare la pipetta durante l&#39;ascolto di chiodare eventi su un monitor audio della tensione amplificata registrata tra la punta della pipetta e il filo di riferimento. Una volta che gli eventi spiking sono identificati, continuano a spostare la pipetta 0-100 micron fino positive deviazioni di tensione in corso superiori si osservano circa 500 mV. NOTA: La resistenza dell&#39;elettrodo aumenterà di un fattore di circa 1,5-10 when ciò si verifica. </li><li> Iniziare a registrare una volta una unità è stato isolato come secondo punto 3.11, insieme a tutte le altre misure comportamentali e fisiologici di interesse. Nel presente manifestazione, i movimenti delle vibrisse auto-generati sono monitorati con videografia ad alta velocità (vedere la sezione Materiali). </li><li> Per etichettare il sito di registrazione, passare l&#39;elettrodo porta per la connessione al generatore di corrente. Ci sono diversi modi per farlo, utilizzando un circuito di relè (Figura 6A - C), dotato di un generatore di corrente dell&#39;amplificatore, o manualmente (Figura 6D, vedere il punto 3.8 e discussione). Passare -4 μA con 2 impulsi sec al 50% duty cycle per 4 minuti di iniettare iontophoretically Chicago Blue Sky attraverso la pipetta. </li><li> Uccidere e profumato l&#39;animale dopo diverse procedure di etichettatura secondo la prassi consueta. Sezione del cervello e di contrasto se necessario per identificare la posizione anatomica della registrazione sederee. Controcolorare il tessuto per la citocromo ossidasi reattività secondo 14. In alternativa, individuare i depositi di Chicago Sky Blu usando la microscopia a fluorescenza. NOTA: Per distinguere con precisione tra le diverse unità etichettati, è importante che tutte le etichette sono realizzati con la stessa pipetta lo stesso giorno, senza che lo sbloccaggio la pipetta tra le etichette. In questo caso i siti di registrazione possono essere differenziati dai loro posizioni relative in istologia post-hoc insieme alle coordinate manipolatore noti di ogni sito (vedere il punto 3.9). Per l&#39;identificazione univoca, contrassegnare le etichette di almeno 200 micron l&#39;uno dall&#39;altro, e non più di 3-5 etichette per regione del cervello. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Costruzione della maschera sperimentale La descrizione delle parti meccaniche utilizzate per costruire la maschera sperimentale (Figura 4) viene omesso dal protocollo, in quanto può essere realizzato in una varietà di modi. In questo standard manifestazione sono utilizzati opto-meccaniche parti e morsetti di supporto per il montaggio del bar poggiatesta e il tubo di ritenuta corpo (vedere la sezione Materiali). Parti simili opt...

Monitoraggio attività neuronale in un animale avviso attivamente impegnato in un compito comportamentale è fondamentale per comprendere la funzione e l&#39;organizzazione del sistema nervoso. Registrazione extracellulare dell&#39;attività elettrica dalle unità neuronali singole è stato a lungo uno strumento fiocco di sistemi neuroscienze ed è ancora ampiamente in uso al momento. Una varietà di tipi di elettrodi e configurazioni sono disponibili a seconda delle esigenze scientifiche e tecniche di un particolare esperimento. Cronicamente impiantati microdrive o schiere di elettrodi vengono spesso utilizzati in animali liberi di muoversi, compresi gli uccelli, roditori e primati non umani 1-4. In alternativa, penetrazioni acuti di metallo o di vetro microelettrodi tramite un micromanipolatore esterna sono spesso utilizzati per registrare da animali anestetizzati o testa-trattenuto. Elettrodi micropipetta di vetro hanno il vantaggio che possono essere utilizzati nel juxtacellular o &quot;cellule attaccate&quot; configurazione per isolare l&#39;ambiguitàattività dei neuroni singoli senza le complicazioni di picco post-hoc di ordinamento 5. Questi elettrodi consentono ulteriori registrazioni da cellule o posizioni anatomicamente identificati, in quanto possono essere utilizzati per iniettare piccoli depositi di tintura o neuroanatomici traccianti, o anche per riempire l&#39;individuo registrato cella. Questa configurazione è stata applicata con successo in ratti, topi e uccelli 6-10. La tecnica attualmente descritta si concentra sul monitoraggio juxtacellular e depositi tintura extracellulari in allerta, ratti testa-trattenuto. Si noti che a differenza di singola cellula juxtacellular riempie, questi depositi di colorante non forniscono informazioni sulla morfologia cellulare o proiezioni assonale 11, ma consentire la localizzazione anatomica esatta a circa 50 micron e, criticamente, hanno un rendimento significativamente più alto in allarme animali. Informazioni riguardanti unicellulare juxtacellular riempie viene comunque fornito come una strategia alternativa per l&#39;etichettatura anatomica. In breve, laprotocollo consiste di tre fasi principali. Nella prima fase, il ratto è acclimatati per contenzione corpo in un calzino stoffa (Figura 1) in un periodo di 6 giorni. Nella seconda fase, un apparato poggiatesta (Figura 2) e la camera di registrazione vengono impiantati chirurgicamente tale che il topo può essere mantenuta nel piano stereotassico durante più sessioni di registrazione successivi (Figura 3); questa procedura consente lo sperimentatore di mirare determinati regioni sub-corticali del cervello per lo studio elettrofisiologico in base a coordinate di riferimento standard 12. La terza fase prevede il posizionamento del ratto in una maschera appropriato per effettuare gli esperimenti comportamentali ed elettrofisiologici (Figura 4), ​​costruendo l&#39;elettrodo da un tubo di quarzo capillare (figura 5), effettuare registrazioni neuronali juxtacellular che inequivocabilmente isolano singole unità 6-9, e segnando i locati anatomicisul sito di registrazione con Chicago Sky colorante blu (figure 6 e 7). Le registrazioni sono eseguite con monitoraggio comportamentale simultanea; tuttavia, i dettagli tecnici del comportamento dipenderanno gli obiettivi scientifici di ogni esperimento e sono quindi oltre la portata di un unico protocollo. Dopo il completamento della procedura sperimentale, che può essere ripetuta più giorni, l&#39;animale è eutanasia. Il cervello viene estratto e lavorato secondo le tecniche neuroanatomiche standard utilizzando sia in campo chiaro e microscopia a fluorescenza.

<table><tbody><tr><td>Ketaset (Ketamina HCl)</td><td>Fort Dodge</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anased (soluzione di xilazina)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadyne (povidone-iodio)</td><td>CVS Pharmacy</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp cianoacrilato</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Grip cement polvere</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>Per la base della camera di registrazione</td></tr><tr><td>Grip liquido cementizio</td><td>Dentsply Intl</td><td>675572</td><td>Per la base della camera di registrazione</td></tr><tr><td>Gel di silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>Jet polvere acrilica per la riparazione di protesi dentarie</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Per fissare l'apparecchio di ritenuta della testa al cranio</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Liquido di resina acrilica ortodontica a polimerizzazione rapida</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Per fissare l'apparato di ritenuta della testa al cranio</td></tr><tr><td>Chicago sky blue</td><td>Sigma</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Per la perfusione e la fissazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Per la perfusione e la fissazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Citocromo C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>Per la colorazione con citocromo-ossidasi, Figura 7</td></tr><tr><td>Diaminobenzidina</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>Per colorazione con citocromo-ossidasi, Figure 7</td></tr><tr><td>Rat sock</td><td>Sew Elegant (San Diego, CA)</td><td>N/A Su</td><td>misura, Figure 1, 4</td></tr><tr><td>Tubo in PVC 2 &frac12; "</td><td>Plastica statunitense Co.</td><td>34108</td><td>Figura 4</td></tr><tr><td>Pin e prese D subminiaturizzati</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Filo musicale in acciaio inossidabile diametro 0,010"</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Telaio di supporto stereotassico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modello 900</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Barre auricolari stereotassiche</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modello 957</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Manipolatore stereotassico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modello 960</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>&frac12; fresa per trapano a mm</td><td>Henry Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>Trapano odontoiatrico Quiet-Air</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>Acciaio inossidabile 0-80 &frac18; &rdquo; vite</td><td>Dispositivo di fissaggio superstore</td><td>247438</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>0,2 ml provetta da centrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>Figura 3</td></tr><tr><td>Barra portatesta personalizzata</td><td>UCSD SIO Officina meccanica</td><td>N/A Su</td><td>misura, Figure 2 - 4</td></tr><tr><td>Piastra portatesta personalizzata</td><td>UCSD SIO Officina meccanica</td><td>N/A</td><td>Su misura, Figure 2 - 4</td></tr><tr><td>Morsetto ad angolo retto</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td>Figure 3, 4 anche le parti optomeccaniche standard per la maschera sperimentale (Figura 4) sono di Newport Corp.</td></tr><tr><td>8-32 &frac34; &rdquo; vite</td><td>Fissaggio Superstore</td><td>240181</td><td>Per poggiatesta, Figura 3</td></tr><tr><td>4-40 &frac14; &rdquo; vite</td><td>Dispositivo di fissaggio Superstore</td><td>239958</td><td>Per poggiatesta, Figure 3, 4</td></tr><tr><td>Tubi capillari al quarzo</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td>Figura 5</td></tr><tr><td>Estrattore laser ad anidride carbonica</td><td>Sutter instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore motorizzato</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore per microelettrodi</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Parte alternativa: Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Stadio principale dell'amplificatore per microelettrodi</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Parte alternativa: HS-9Ax10 con Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Stimolatore di impulsi isolato</td><td>A-M Systems</td><td>Modello 2100</td><td>Parte alternativa: HS-9Ax10 con Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Monitor audio</td><td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>Porta pipetta</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>Parti alternative: vedi Discussion, Figura 6ACavo dell'elettrodo</td></tr> <tr><td></td><td>Filo cooner</td><td>NEF34-1646</td> <td>(opzionale), Figura 6D</td></tr><tr><td>Relè per stadio principale dell'amplificatore</td><td>COTO Technology</td><td>#2342-05-000</td><td>(Facoltativo) Utilizzato con un circuito stampato su misura (UCSD Physics Electronics Shop), Figura 6A-C</td></tr><tr><td>Videocamera digitale</td><td>Basler</td><td>A602fm</td> <td>(opzionale) Per il monitoraggio comportamentale, Figura 7</td></tr><tr><td>Puralube unguento veterinario</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali sub-corticali di alert, rats testa-trattenuto

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Ci sono una varietà di tecniche per monitorare l'attività extracellulare di singole unità neuronali. Tuttavia, il monitoraggio di questa attività dalle strutture cerebrali profonde negli animali che si comportano rimane una sfida tecnica, soprattutto se le strutture devono essere mirate in modo stereotassico. Questo protocollo descrive tecniche chirurgiche ed elettrofisiologiche convenienti che mantengono la testa dell'animale nel piano stereotassico e isolano in modo inequivocabile l'attività di picco dei singoli neuroni. Il protocollo combina il poggiatesta dei roditori in allerta, il monitoraggio iuxtacellulare con elettrodi per micropipette e l'iniezione di colorante ionoforetico per identificare la posizione dei neuroni nell'istologia post-hoc. Sebbene ciascuna di queste tecniche sia di per sé ben consolidata, il protocollo si concentra sulle specifiche del loro uso combinato in un singolo esperimento. Queste tecniche neurofisiologiche e neuroanatomiche si combinano con il monitoraggio comportamentale. Nel presente esempio, le tecniche combinate sono utilizzate per determinare come i movimenti autogenerati della vibrissa siano codificati nell'attività dei neuroni all'interno del talamo somatosensoriale. Più in generale, è semplice adattare questo protocollo per monitorare l'attività neuronale in combinazione con una varietà di compiti comportamentali in ratti, topi e altri animali. Criticamente, la combinazione di questi metodi consente allo sperimentatore di correlare direttamente i segnali neurofisiologici anatomicamente identificati al comportamento.

<html> Unità neuronali in ventrale posteriore mediale (VPM) talamo codificare la fase di movimento vibrissa durante autogenerata sbattere 15,16. Figura 7A mostra attività spiking del campione di un&#39;unità talamica VPM come un topo è attivamente sbattere. Figura 7B mostra un istogramma di picco tempi allineati alla fase istantanea di vibrissa movimento 17. Ci sono più picchi durante la fase di retrazione di sbattere. Dopo la registrazione, la posizione dell&#39;un...

Questo protocollo descrive la progettazione e l'impianto chirurgico di un meccanismo di contenimento della testa per monitorare l'attività neuronale nelle strutture cerebrali sub-corticali nei ratti allertati. Delinea le procedure per isolare i singoli neuroni nella configurazione juxtacellulare e per identificare in modo efficiente le loro posizioni anatomiche.

Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare e localizzare l'attività di singoli neuroni all'interno delle strutture cerebrali sottocorticali di ratti svegli con la testa immobilizzata. Questo viene ottenuto in primo luogo abituando il ratto al contenimento del corpo mediante un calzino di stoffa. Il secondo passaggio consiste nell'implantare chirurgicamente un dispositivo di fissaggio della testa e una camera di registrazione, in modo che il ratto possa essere mantenuto nel piano stereotassico durante molteplici sessioni di registrazione successive.Successivamente, il ratto viene posizionato in un apposito supporto per eseguire esperimenti comportamentali ed elettrofisiologici e vengono effettuate registrazioni neuronali juxta cellulari. Questo processo permette l'isolamento inequivocabile di unità singole. L'ultimo passaggio consiste nel marcare la posizione anatomica del sito di registrazione con il colorante Chicago Sky blue, in modo che possa essere visualizzato in una successiva istotologia.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi comunemente utilizzati, come la registrazione extracellulare con microelettrodi metallici, è che gli spike da unità singole possono essere isolati in modo inequivocabile e che il sito di registrazione può essere rivelato mediante istologia post hoc. Per iniziare questa procedura, anestetizzare l'animale mediante iniezione di xilazina e ketamina. Verificare il riflesso di ritrazione del dito del piede per determinare il livello di anestesia e mantenere l’anestesia tramite ulteriore somministrazione di anestetico.Se necessario, rasare il capo e disinfettare la sede chirurgica con iodopovidone. Successivamente, posizionare il ratto in un telaio stereotassico e fissare la testa con le barre auricolari. Praticare un'incisione con un bisturi lungo la linea mediana del cranio, dal punto medio tra gli occhi fino alla parte posteriore delle orecchie.Quindi rimuovere una striscia di pelle larga due-tre millimetri su entrambi i lati dell'incisione. Raschiare via il periostio per esporre il cranio fino ai margini laterali. Successivamente, ricoprire il cranio esposto con uno strato sottile di colla cianoacrilica.Successivamente praticare un piccolo foro immediatamente posteriore al punto in cui la sutura bgma incontra la cresta laterale, con un angolo di 30-45 gradi rispetto al cranio. Quindi avvitare una vite zero 80 a fondo piatto nella macchina. Avvitare la vite nel foro con un angolo di 30-45 gradi, facendo attenzione a non avvitare troppo in profondità per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale sottostante.Ripetere questa procedura per altre sei viti in questa configurazione. Successivamente, applicare colla istantanea alla base di tutte le viti. Posizionare ora l'ago della siringa nel manipolatore stereotassico.Creare una piccola incrinatura nel cranio con l'ago per segnare una posizione di riferimento appropriata. Quindi, contrassegnare l'incrinatura con un pennarello indelebile. Successivamente, eseguire una craniotomia centrata sulla coordinata desiderata, lasciando intatta la dura madre.Coprire la craniotomia con liquido cerebrospinale artificiale modificato. Successivamente, tagliare un tubo da centrifuga da 0,2 millilitri in un segmento lungo quattro-cinque millimetri e rimuovere il cappuccio. Posizionare il tubo sul cranio centrando esattamente la craniotomia.Quindi applicare del cemento dentale attorno alla base del tubo per sigillarne il fondo al cranio. Fare attenzione a non far colare alcun cemento nella craniotomia esposta. Ora praticare un altro piccolo foro nella lamina cranica controlaterale.Inserire con attenzione il filo di riferimento precedentemente saldato a un connettore a perno. Successivamente, applicare una colla istantanea sul foro in cui è stato inserito il filo, per fissare saldamente il perno e il filo. Poi mescolare le due parti del kit di gel di silicone in porzioni uguali.Attendere due minuti e riempire il tubo della centrifuga con il gel. Quando è riempito all'incirca per un terzo, fissare la piastra della testa alla barra di sostegno della testa. In questo caso, la barra è stata fissata a una morsetto per asta ad angolo retto con un angolo di inclinazione di 45 gradi.Successivamente, fissare la barra di sostegno al braccio del manipolatore stereotassico utilizzando la morsetto a stelo in modo che la barra sia parallela alle barre auricolari; abbassare quindi la barra e la piastra in modo che la piastra si trovi posteriormente alla sutura lambda e anteriormente alla vite del coddle mos. A questo punto, afferrare il bullone frontale della testa con un morsetto a un angolo di circa 45 gradi, in modo che la testa della vite sia rivolta verso il basso e in direzione della coda dell'animale. Successivamente, abbassare la vite fino a farla toccare il cranio.Successivamente, fissare il bullone e la piastra in posizione con acrilico dentale. Applicare uno strato di cemento dentale lungo i bordi dell'acrilico dentale per incollare la pelle all'impianto. Dopo che il cemento si è asciugato, praticare diversi fori nel tappo del tubo centrifuga e posizionare il tappo sul tubo.Ora rimuovere la pinza. Rimuovere con attenzione la barra di sostegno della testa dallo stereo tac. Successivamente, rimuovere la piastra della testa dalla barra.Alla fine, rimuovere l'animale dallo stereotassico e somministrare le cure e il monitoraggio postoperatori. In questa procedura, utilizzare una pipetta polo con tubo capillare di quarzo su un micropipettatore a laser al biossido di carbonio. Quindi fissare saldamente la pipetta in posizione sotto un microscopio a contrasto di interferenza differenziale dotato di obiettivo con lunga distanza di lavoro.Spostare lentamente un blocco di vetro nel campo visivo utilizzando la punta di una pipetta. Utilizzando il micromanipolatore del palchetto, rompere la punta della pipetta toccandola delicatamente con il vetro. Ripetere la procedura fino a quando la punta della pipetta.Il diametro esterno è compreso tra uno e tre micrometri. Successivamente, preparare la soluzione salina extracellulare e aggiungere il 2% di Chicago sky blue. Utilizzando una siringa con un ago da 30 gauge, riempire l'estremità posteriore della pipetta con la soluzione.Quindi posizionare il ratto nel calzino di stoffa e trasferire il calzino di stoffa in un tubo rigido montato su un’apposita struttura sperimentale. Fissare la piastra di immobilizzazione della testa del ratto alla parte corrispondente della struttura. Successivamente, posizionare un dado 8 32 sul bullone di fissaggio della testa precedentemente impiantato sul ratto.Successivamente, avvitare una barra filettata in acciaio inossidabile sul bullone della testa. Dopodiché, aprire la camera di registrazione ed eliminare il gel di silicone. Pulire la craniotomia utilizzando pinzette fini.Se il tessuto si è rigenerato nella craniotomia, utilizzare l'anestesia con iso-fluorina durante questo procedimento, se necessario. Successivamente, collegare la pipetta al micromanipolatore motorizzato. Spostare la pipetta nella posizione desiderata per la registrazione lungo l'asse anteriore, posteriore e latero-mediale.Quindi avanzare la pipetta in senso ventrale attraverso la dura fino a raggiungere una posizione approssimativamente 500 micrometri dorsale rispetto al sito previsto per la registrazione. Procedere lentamente con l'avanzamento della pipetta, ascoltando gli eventi di potenziale d'azione su un monitor audio del voltaggio amplificato registrato. Una volta identificati gli eventi di potenziale d'azione, continuare a spostare la pipetta di zero a 100 micrometri finché le deflessioni di voltaggio positive superano approssimativamente i 500 microvolt.Per etichettare il sito di registrazione, impostare la sorgente di corrente a meno quattro microampere con impulsi di due secondi a un ciclo di lavoro del 50% e far passare la corrente per quattro minuti per ionoforesi, iniettando Chicago sky blue attraverso la pipetta. Al termine dell'esperimento, eseguire la perfusione dell'animale secondo le pratiche standard. Quindi sezionare il cervello e applicare la colorazione di contrasto secondo necessità per identificare la localizzazione anatomica del sito di registrazione indicato.Ecco l'attività di spiking di un'unità talamica VPM mentre un ratto sta esplorando attivamente con i suoi vibris. Ecco un istogramma dei tempi degli spike allineati alla fase istantanea del movimento Vibra. Si osserva un numero maggiore di spike durante la fase di retrazione dell'esplorazione con i vibris.Dopo la registrazione, la posizione di questa unità è stata etichettata mediante affioramento del colorante Chicago sky blue. Come mostrato qui, il tessuto è stato controcolorato per l'attività della citocromo ossidasi al fine di rivelare i confini neuroanatomici del talamo VPM. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire tecniche chirurgiche ed elettrofisiologiche che mantengono la testa dell'animale nel piano stereotassico e che isolano in modo inequivocabile l'attività di scarica di singoli neuroni.

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Neuroscience

Neuroscienze

Il monitoraggio dei livelli del neurotrasmettitore extracellulare nelle regioni cerebrali distinte di muoversi liberamente animali offre approfondimenti sul legame tra il rilascio dei neurotrasmettitori e comportamento. In microdialisi in vivo accoppiato con rilevazione elettrochimica fornisce anatomica eccellente e la risoluzione chimici e informazioni su come neurotrasmissione basale è alterato da manipolazioni farmacologiche o fisiologiche.

Survivable Chirurgia Stereotassica in roditori

Registrazioni extracellulari di attività neuronale con sonde silicio nel ratto anestetizzato saranno descritti. Questa tecnica permette di ottenere informazioni attraverso aree cerebrali multiple da più di 100 neuroni contemporaneamente. Esso fornisce informazioni sulla risoluzione singola cellula neuronale dinamiche ensemble in più circuiti locali.

Registrazione Ensembles neuronali su larga scala con sonde di silicio sotto Rat anestetizzati

Questo video mostra la procedura dettagliata per preparare un ratto anestetizzato per registrazioni elettrofisiologiche dell'attività cerebrale da più siti. Il cuoio capelluto viene sezionato per accedere al cranio e vengono praticati dei fori in punti precisi per installare e fissare gli elettrodi. Gli elettrodi a microfilo di tungsteno vengono quindi inseriti nella posizione mirata per registrare i dati.

Registrazioni elettrofisiologiche in vivo di attività cerebrali da più siti nei ratti

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in topi svegli. J. Vis. Exp. (2022) Questo video mostra una procedura di microscopia a due fotoni per l'imaging dell'attività neuronale e della dinamica microgliale in un topo sveglio durante la stimolazione visiva, evidenziando i transitori del calcio e le interazioni cellulari.

Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in un topo sveglio

Fonte: Moore, J. D., et al. Monitoraggio juxtacellulare e localizzazione di singoli neuroni all'interno di strutture cerebrali subcorticali di ratti allertati e con la testa trattenuta. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra il metodo di registrazione e colorazione juxtacellulare in un ratto sveglio e trattenuto. La procedura prevede la registrazione dei segnali dai neuroni e l'iniezione di colorante per localizzare con precisione il sito di registrazione. Questa tecnica consente di mappare con...

Registrazione e colorazione juxtacellulare per una mappatura precisa dell'attività neurale in un ratto sveglio 

Fonte: Lai, J., et al. Registrazione elettrofisiologica simultanea e microiniezioni di agenti inibitori nel cervello dei roditori. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra una tecnica basata su microiniezione per la registrazione e l'inibizione neuronale simultanea nel collicolo superiore del ratto. La procedura prevede il targeting stereotassico, la perforazione del cranio e l'inserimento di un iniettore, che rilascia un neurotrasmettitore inibitorio durante la registrazione dell'attività...

Inibizione dell'attività neuronale e sua rilevazione mediante elettrofisiologia in un ratto

Per comprendere la struttura delle reti neuronali, caratterizzazione funzionale e morfologica dei singoli neuroni è una necessità. Qui, dimostriamo etichettatura juxtasomal biocitina, che permette registrazioni elettrofisiologiche nella configurazione extracellulare, pur mantenendo la capacità di etichettare intracellulare neurone per la ricostruzione post-hoc di dendritiche e dell'architettura assonale.

Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

Questo metodo crea un ambiente familiare tangibile per il mouse per navigare ed esplorare durante microscopiche di imaging o unicellulari registrazioni elettrofisiologiche, che richiedono ferma fissazione della testa dell'animale.

Appartamento con pavimento Platform aria sollevata: Un nuovo metodo per la combinazione di Comportamento con microscopia o Elettrofisiologia su Awake liberi di muoversi Roditori

In questo studio viene presentata la metodologia su come eseguire registrazioni elettrofisiologiche in vivo multi-site dal percorso iperdirezionale in anestesia uretanica.

acuto<em&gt; In Vivo</em&gt; Registrazioni elettrofisiologiche dei potenziali del campo locale e dell&#39;attività multi-unità dal percorso iperdirezionale nei ratti anestetizzati

Se integrata con una piastra di testa e un design ottico compatibile con microscopi a singolo e due fotoni, la lente del microprisma presenta un vantaggio significativo nella misurazione delle risposte neurali in una colonna verticale in diverse condizioni, inclusi esperimenti ben controllati in stati di fissazione della testa o compiti comportamentali naturali in animali che si muovono liberamente.

Imaging a lungo termine di popolazioni neurali identificate utilizzando microprismi in animali che si muovono liberamente e fissano la testa

Le aree sensoriali primarie nella neocorteccia mostrano attività spontanee uniche durante lo sviluppo. Questo articolo descrive come visualizzare le attività dei singoli neuroni e le aree sensoriali primarie per analizzare le attività sincrone area-specifiche nei topi neonatali in vivo.

Visualizzazione in vivo dell'attività spontanea nella corteccia sensoriale del topo neonatale con risoluzione di un singolo neurone

Scopri la registrazione juxtacellulare per monitorare l'attività di singoli neuroni nelle strutture sottocorticali di ratti svegli con testa fissa. Questo metodo consente l'isolamento inequivocabile delle unità e la localizzazione anatomica precisa.

Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto (Video) | JoVE Journal

Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto

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