Una piattaforma Novel Stretching per applicazioni in cellule e tessuti mechanobiology

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la novità di una piattaforma di stretching isotropa che può essere utilizzata per studiare le risposte di singole cellule a deformazioni meccaniche complesse e per quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici. Ciò si ottiene fabbricando prima la membrana flessibile e montando questa membrana su una serie di morsetti. Il secondo passo consiste nel coltivare C due cellule C 12 sulla membrana durante la notte e, il giorno successivo, montare i morsetti sulla piattaforma di allungamento.

Successivamente, in una seconda serie di esperimenti, i tessuti dell'aorta toracica vengono rigettati da un modello murino e ripuliti da qualsiasi tessuto connettivo. Quindi il tessuto aortico viene montato sulla piattaforma di stretching utilizzando un diverso set di morsetti. In definitiva, la piattaforma di stretching viene utilizzata per indurre una deformazione nelle cellule lungo due direzioni ortogonali che possono essere quantificate utilizzando un microscopio invertito.

In alternativa, un trasduttore di forza è integrato nel dispositivo di allungamento per misurare la rigidità dei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come l'allungamento unilaterale o biassiale delle cellule, è che ci permette di controllare indipendentemente la deformazione in due direzioni ortogonali in una membrana trasparente su cui sono attaccate le cellule, e quindi consentendo l'imaging di cellule vive. Microscopia anche un'attenta progettazione di un diverso set di pinze.

Con l'integrazione di un utente a quattro stringhe sulla piattaforma, ci permette di eseguire test su 10 cellule su tessuti biologici per la quantificazione delle loro proprietà meccaniche. Questo video presenta la piattaforma di stretching biassiale, un apparecchio costruito su misura che può essere utilizzato per studiare l'effetto della deformazione del substrato a livello cellulare ed eseguire prove di trazione su tessuti biologici. Il design e le caratteristiche della piattaforma di allungamento biassiale sono dettagliati nel manoscritto di accompagnamento per studiare l'effetto della deformazione meccanica delle singole cellule, un substrato flessibile e trasparente su cui le cellule possono aderire deve prima essere fabbricato.

Per iniziare questa procedura, pipettare 500 microlitri di una soluzione di microsfere fluorescenti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 16, 200 Gs Per 10 minuti, scartare il supernat e aggiungere 500 microlitri di isopropanolo, seguiti da cinque minuti di vortex. Mettere da parte la fiala per una notte al buio per consentire la sedimentazione di eventuali aggregati di particelle di grandi dimensioni la mattina seguente, trasferire con cura lo SNAT in una fiala di microcentrifuga pulita. Questa soluzione di perline può essere utilizzata per fabbricare più di cinque substrati perché la soluzione di perline continuerà a sedimentare per i prossimi tre giorni.

È importante evitare che Resus sospenda il pellet. Versare 0,5 grammi dell'agente indurente fornito con il kit PDMS in una fiala di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 15 microlitri di perline fluorescenti e vorticare per un minuto.

Ripetere l'operazione altre cinque volte per aggiungere un totale di 90 microlitri di perline Mettere da parte. Pesare 10 grammi di PDMS, aggiungere 0,5 grammi di agente indurente, integrato con perle fluorescenti e mescolare per almeno 12 minuti. Successivamente, utilizzare la pipetta di trasferimento per trasferire quattro milligrammi di PDMS con perline in uno stampo a forma di croce SUH 2050 precedentemente fabbricato utilizzando tecniche di fotolitografia standard.

Lo stampo ha un'altezza di 320 micrometri e un'area di 13,4 centimetri quadrati e può contenere 428 microlitri o 440 milligrammi di PDMS per polimerizzare il PDMS per due ore a 80 gradi Celsius. Dopo l'indurimento, staccare il substrato dallo stampo, il substrato può essere conservato in una capsula di Petri a temperatura ambiente per due settimane senza mostrare cambiamenti significativi e le sue proprietà meccaniche. Versare goccioline di PDMS in una capsula di Petri con una dimensione finale di circa quattro millimetri di diametro, polimerizzarle a testa in giù per due ore a 80 gradi Celsius, la piastra deve essere mantenuta capovolta per evitare che le gocce si appiattiscano durante il processo di polimerizzazione.

Queste caratteristiche di ancoraggio possono essere conservate in una capsula di Petri per settimane. Il plasma d'aria tratta il substrato e otto caratteristiche di ancoraggio, legano le caratteristiche su ciascuna estremità del substrato a una distanza di quattro millimetri dalla rientranza di forma quadrata presente sul substrato per montare la membrana sui morsetti. Avvolgere ciascuna estremità del substrato attorno alla parte cilindrica scanalata dei morsetti e fissarla in posizione con le due viti di fermo dall'alto.

Avvitare i quattro morsetti sul supporto del morsetto. Quindi versare il PDMS all'interfaccia tra il substrato e la parte scanalata dei morsetti. Stendere il PDMS non polimerizzato attorno alla parte cilindrica scanalata utilizzando una chiave esagonale da 1,5 millimetri.

Versare il PDMS nelle scanalature fino a riempirlo completamente per azione capillare e polimerizzare l'assemblaggio a 80 gradi Celsius per due ore prima di seminare le cellule sulla membrana. Plasma d'aria. Trattare l'intero assemblaggio per sterilizzare e funzionalizzare il substrato per consentire il rivestimento di collagene.

Funzionalizzare l'area del substrato in cui verranno seminate le cellule con un millilitro di acido acetico molare 0,02 integrato con 16 microgrammi per millilitro di collagene di coda di ratto a temperatura ambiente per un'ora. La densità finale di collagene desiderata è di cinque microgrammi per centimetro quadrato Dopo un'ora, sciacquare il substrato tre volte con tampone fosfato e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per almeno 10 minuti. Aggiungere 40 microlitri di terreno di coltura, integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina.

La streptomicina contiene 2000 cellule nella parte centrale del substrato per coprire un'area di un centimetro quadrato. In questo esempio, la densità delle celle è di 20 celle per centimetro quadrato. Tuttavia, la densità cellulare può essere modificata in base alle esigenze sperimentali.

Mettere l'intero gruppo in un incubatore per colture cellulari standard con il substrato rivolto verso l'alto con la goccia di terreno di coltura contenente le cellule su di esso. L'assemblaggio deve essere mantenuto con il substrato rivolto verso l'alto per almeno tre ore per consentire alle cellule di attaccarsi saldamente ad esso per evitare l'evaporazione. 30 microlitri di terreno di coltura caldo vengono aggiunti alla goccia sul substrato.

Ogni 45 minuti dopo tre ore, capovolgere l'intero gruppo in una capsula di Petri riempita con terreno di coltura fresco per immergere il substrato e incubare durante la notte per consentire alle cellule di proliferare il giorno successivo. Montare la configurazione su un microscopio a contrasto di fase invertito o a fluorescenza. Montare il gruppo substrato del morsetto sulla piattaforma di allungamento biassiale e i motori riempiono la piastra di Petri all'interno del riscaldatore della piastra di Petri con una soluzione salina tamponata HEPs appena preparata.

Questa soluzione fisiologica viene utilizzata per mantenere le cellule sul palco del microscopio imitando il normale ambiente sanguigno dei tessuti. La stessa piattaforma di stretching biassiale può essere utilizzata anche per quantificare la rigidità di piccoli campioni di tessuto. In questa dimostrazione verranno utilizzate aorte di topo isolate.

Rimuovere il diaframma, la gabbia toracica e i lobi polmonari dal topo soppresso per ridurre al minimo il rischio di danneggiare il tessuto. Tenere il cuore attaccato all'aorta ed evitare di toccare il vaso direttamente ma manipolato. Usando il cuore.

Rimuovere il cuore, la radice aortica e l'aorta toracica tagliando delicatamente tra il vaso e la colonna vertebrale per mantenere intatta la struttura interna del tessuto. Fare attenzione a non indurre alcun allungamento nel vaso durante l'incisione. Immergere immediatamente e conservare il cuore e l'aorta nella soluzione di Krebs, che viene preparata quotidianamente e mantenuta a 37 gradi Celsius durante gli esperimenti.

Tagliare e lavare accuratamente l'aorta in soluzione di Krebs per rimuovere eventuali coaguli di sangue lavorando al microscopio da dissezione chirurgica. Rimuovere il tessuto connettivo utilizzando micro forbici e pinzette. È importante mantenere tutta la lunghezza del vaso e utilizzare la radice aortica per determinare l'orientamento del vaso.

Le dimensioni della nave a vuoto sono necessarie per determinare la rigidità della nave. Tagliare un anello aortico di circa due millimetri di lunghezza e misurarne con precisione la lunghezza utilizzando un'impostazione calibrata del microscopio. Metti da parte questo segmento nella soluzione di Kreb.

Successivamente, tagliare due piccoli anelli aortici dalle sezioni di aorta rimaste dopo la rimozione del segmento di due millimetri. Un anello dalla sezione dell'aorta prima del segmento di due millimetri e un altro anello dalla sezione dell'aorta. Dopo il segmento di due millimetri, posizionare entrambi gli anelli aortici su un vetrino da microscopio con il lume rivolto verso l'alto e misurare lo spessore della parete utilizzando un'impostazione calibrata del microscopio.

Lo spessore della parete aortica viene misurato e mediato utilizzando questi due anelli. Riempire la piastra di Petri sulla piattaforma di allungamento biassiale con la soluzione di Krebs e inserire il segmento dell'anello dell'aorta da due millimetri sui perni di trazione. In questo protocollo, la piattaforma di stretching biassiale è stata utilizzata per studiare la risposta meccanica del nucleo in singole cellule di mioblasti di topo esposte a una deformazione del substrato del 25% di deformazione di spostamento.

Le relazioni tra l'esecuzione dell'allungamento assiale standard e puro sono mostrate in questi risultati rappresentativi. I beads fluorescenti vengono selezionati manualmente sul primo fotogramma del video e tracciati da un fotogramma all'altro fino a raggiungere il massimo allungamento lungo le direzioni orizzontale e verticale. Uno script MATLAB calcola automaticamente i componenti del tensore di deformazione verde per ogni fotogramma e produce una curva di calibrazione della deformazione rispetto allo spostamento del motore.

In questi grafici, le linee blu e rosse corrispondono alla componente dell'heer teso verde lungo le direzioni orizzontale e verticale rispettivamente. Questi risultati illustrano le capacità della piattaforma di stiramento biassiale di indurre una deformazione nel substrato lungo due direzioni ortogonali. Oltre ai campi di deformazione biassiali standard uni assiali di EQU, la piattaforma di allungamento biassiale può indurre campi di deformazione complessi nel substrato.

Il pannello G mostra che allungando lo stesso substrato di quattro millimetri lungo l'asse x e allungando leggermente lungo l'asse Y di 1,5 millimetri evidenziati in rosso, produce un campo assiale uni puro senza deformazione di compressione nel substrato. Il pannello, H mostra che l'allungamento del substrato lungo l'asse x di 3,5 millimetri produce una deformazione del 25% e una deformazione compressiva del 7% quando le estremità del substrato lungo l'asse verticale sono fisse, evidenziate in rosso Con la capacità di eseguire l'imaging al microscopio su cellule vive durante l'allungamento dei nuclei è stato colorato con un colorante fluorescente a cellule vive che lega il DNA e quindi allungato del 25% lungo ciascun asse di allungamento ortogonale come Qui illustrata tra ogni fase del ciclo di allungamento, sono state acquisite immagini di contrasto e immagini epifluorescenti del nucleo non formato e deformato. Le lunghezze dell'asse nucleare maggiore e minore lungo lo stato informe e quando il nucleo è stato allungato in sequenza lungo il suo asse maggiore e minore sono state determinate utilizzando un plug-in di immagine J e utilizzate per calcolare la variazione relativa di lunghezza.

Lungo ogni asse di questo grafico a barre, l'asse X o maggiore è mostrato in blu e l'asse y o minore è mostrato in rosso. La capacità di deformazione del nucleo mostra un'anisotropia meccanica in quanto mostra una capacità di deformazione significativamente più elevata lungo il suo asse minore in, rispetto al suo asse maggiore, il ruolo dell'actina e del citoscheletro dei microtubuli nella regolazione della capacità di deformazione nucleare è stato esaminato depolimerizzando, i filamenti di actina o i microtubuli selettivamente utilizzando rispettivamente il cito D e il neolo depolimerizzando. Si è scoperto che i filamenti di actina o i microtubuli inducono una perdita della deformabilità anisotropa del nucleo.

Questi risultati supportano i risultati che i componenti del citoscheletro trasmettono forze al nucleo dal substrato e sono anche essenziali per preservare il naturale comportamento meccanico del nucleo. Durante la deformazione, la piattaforma di stretching biassiale è stata utilizzata anche per valutare l'effetto della sovraespressione cronica della proteina da shock termico 27 o HP 27 sulla sovraespressione della rigidità del vaso. In un modello murino incline all'aterosclerosi, un POE omozigote negativo modifica la composizione istologica delle lesioni dell'aterosclerosi aumentando le cellule muscolari lisce intimali e il contenuto di collagene.

Per determinare l'impatto di questo rimodellamento istologico sulle proprietà meccaniche dei vasi, la piattaforma di stretching è stata utilizzata per misurare la rigidità aortica. Questo grafico mostra una tipica curva sforzo-deformazione ottenuta dall'allungamento di un vaso aortico, mentre la rigidezza è calcolata al 30% della deformazione. La rigidezza è la pendenza della tangente indicata dalla linea rossa alla curva.

È stato riscontrato che la rigidità dei segmenti aortici dei topi che esprimono HSP 27 era significativamente aumentata del 41% rispetto al modello murino di controllo. Nel complesso, la valutazione meccanica combinata con l'istologia del vaso e della placca ha dimostrato che la sovraespressione di HSP 27 è caratterizzata da un aumento della rigidità dei vasi e del contenuto di cellule muscolari lisce di collagene. Questi risultati suggeriscono che l'HSP 27 potrebbe potenzialmente aumentare la stabilità delle lesioni aterosclerotiche e quindi ridurre il rischio di rottura della placca dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica rappresenta un nuovo modo per i ricercatori nel campo della bioingegneria di esplorare la risposta cellulare a deformazioni meccaniche complesse e inotrope per applicazioni in biologia meccanica, ma anche per monitorare la meccanica dei tessuti biologici nelle malattie.