Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre un aumento o una diminuzione a lungo termine della segnalazione del recettore accoppiato alla proteina GQG degli astrociti in risposta a cambiamenti nella trasmissione sinaptica neuronale. Ciò si ottiene preparando prima fette acute di ippocampo da topi di tipo selvatico. Il secondo passo consiste nell'applicare sulur Rumine 1 0 1 alle fette per marcare gli astrociti.

Successivamente, le fette acute dell'ippocampo vengono incubate per quattro-sei ore di tetrodatossina per bloccare i potenziali d'azione neuronali o nel normale liquido cerebrospinale artificiale. Il passaggio finale consiste nel caricare gli astrociti nello strato radi dell'atomo della fetta con un indicatore di calcio utilizzando un protocollo di carico a contropressione. In definitiva, la microscopia confocale viene utilizzata per mostrare i cambiamenti nell'attività di segnalazione del GPCR GQ degli astrociti, registrando i cambiamenti nel transitorio di calcio spontaneo ed evocato dagli astrociti.

Questo metodo fornisce informazioni sulla plasticità del recettore degli astrociti e sui cambiamenti associati nella segnalazione TQG PCR. Può anche essere utilizzato per misurare la plasticità omeostatica dei recettori metabotropici nei neuroni. Per iniziare questa procedura, accendi il vibrato e assicurati che lo scarico sia chiuso.

Quindi fissare la camera di taglio nel vibrato e imballare il ghiaccio attorno alla camera di taglio. Quindi, rimuovere il grasso di fabbrica dalla lama del rasoio a doppio taglio immergendola in etanolo al 70% per cinque minuti, quindi risciacquando con acqua distillata doppia. Tagliarlo a metà con cura e montarne una metà sul blocco di taglio per la preparazione della fetta di cervello.

Dopo aver ottenuto un cervello di topo diviso in due con la lama di rasoio raffreddata in una capsula di Petri per consentire una maggiore superficie per il raffreddamento e l'ossigenazione. Lascia riposare gli emisferi divisi in due nel tampone per affettare ghiacciato per due o tre minuti e diventa completamente freddo e più solido. Dopodiché, applica un sottile strato di colla pazza sulla piattaforma della colla vibrato, entrambi gli emisferi sulla piattaforma.

Con i lati tagliati verso il basso e i lati laterali verso l'alto e il bulbo olfattivo rivolto in avanti, fissare la piattaforma nella camera di taglio. Riempire la camera di taglio con un tampone per affettare ghiacciato e ben ossigenato. Continuare a ossigenare la camera di taglio mentre si preparano fette para sagittali spesse 300 micron usando il vibrato Dopo l'affettatura, sezionare l'ippocampo e la corteccia terminale adiacente da ciascuna fetta para sagittale nel tampone di affettatura ghiacciato ben ossigenato.

Per fare una pipetta di trasferimento, rompere la punta lunga di una pipetta da pascolo in vetro e coprire la parte rotta con un bulbo per pipetta. Trasferire le fette dell'ippocampo nella camera di incubazione nel bagno d'acqua a 35 gradi Celsius una alla volta. Si prega di notare che per motivi di visibilità, questi passaggi vengono mostrati con le camere di incubazione al di fuori del bagno d'acqua a 35 gradi Celsius.

Incubare le fette dell'ippocampo per 20 minuti in un micromolare SR 1 0 1 diluito in liquido cerebrospinale a basso contenuto di calcio A nel bagno d'acqua a 35 gradi. Quindi trasferirli nel liquido cerebrospinale a basso contenuto di calcio A senza SR 1 0 1 per altri 10 minuti. Recupero a caldo.

Successivamente trasferire le fette nel liquido cerebrospinale A di controllo o sperimentale per i restanti 15 minuti dell'incubazione a caldo. Dopo il recupero di 45 minuti, spostare con cautela le camere di incubazione dal bagno d'acqua a 35 gradi Celsius al piano di lavoro e lasciare che le fette continuino a incubare a temperatura ambiente per tre ore in totale prima di iniziare il protocollo di caricamento in bolo. In questa procedura, preparare una pipetta da un capillare di vetro silicico boro tirato a una resistenza di circa 1,3 mega ohm quando riempito con soluzione colorante.

Successivamente, posizionare una fetta di ippocampo in una camera di registrazione e perfusa continuamente con A CSF ossigenato a 1,5 millilitri al minuto, utilizzare solo una fetta di ippocampo che abbia un'alta percentuale di cellule parametalliche CA one sane e una superficie dall'aspetto liscio e scartare se sembra malsana. Utilizzando ottiche a contrasto interferenziale differenziale, individuare un campo adatto di astrociti nello strato radio da 40 a 70 micron sotto la superficie della fetta. Quindi posizionare la pipetta di vetro precaricata con la soluzione D in un portamicroelettrodo patch clamp standard.

Abbassarlo sulla superficie della fetta sopra il campo con la pipetta sulla superficie della fetta. Applicare una pressione positiva sulla pipetta per iniziare a espellere il colorante. Abbassare lentamente la pipetta a circa 40 micron sotto la superficie della fetta utilizzando un micromanipolatore e lasciare che il colorante venga espulso per circa 45-60 secondi.

Quindi abbassare la pipetta di altri 35 micron ed espellere il colorante per circa 45-60 secondi. Successivamente, ritrarre lentamente la punta della pipetta dalla fetta per assicurarsi che un gran numero di astrociti assorba il colorante. Di solito è utile iniettare un secondo bolo di colorante a breve distanza.

Per fare ciò, sollevare la pipetta sulla superficie della fetta e assicurarsi che la pipetta non sia ostruita. Quindi spostare la pipetta a circa 80-100 micron di distanza dal primo sito di iniezione lungo lo strato radio, ripetere l'iniezione in bolo in questo sito e attendere da 30 a 45 minuti prima dell'imaging degli astrociti per impostare il microscopio confocale per l'imaging. L'esposizione alla luce laser è della massima importanza in quanto un'esposizione elevata può portare allo sbiancamento del colorante e/o alla fototossicità.

Impostare i valori predefiniti per ciascun laser su un'impostazione del moltiplicatore fotografico alto, un guadagno x e un'ora di potenza di uscita del laser dello 0,5%. Quindi, applica uno zoom 1,5x per una migliore visualizzazione dei processi degli astrociti. Quindi impostare la risoluzione del campo su 512 pixel per 512 pixel.

Successivamente, impostare la velocità di scansione al massimo possibile, ovvero circa 1,2 secondi per scansione. Utilizzando la modalità di scansione unidirezionale, raccogliere gli spettri di emissione utilizzando filtri passa-banda da 503 a 548 nanometri per il laser a 488 nanometri e da 624 a 724 nanometri per il laser a 559 nanometri. Quindi confermare l'identità delle cellule caricate con colorante di calcio come astrociti visualizzando la marcatura SR 1 0 1 co.

Utilizzando il laser a 559 nanometri per registrare l'attività del calcio negli astrociti. Per prima cosa, disegna le caselle sulle regioni di interesse all'interno della cellula utilizzando il software di acquisizione delle immagini, in questo caso sui corpi cellulari degli astrociti. Quindi disegna una casella sullo sfondo come riferimento.

Ottenere 10 minuti di registrazione basale dell'attività spontanea del calcio dai ROI. Successivamente, applicare un agonista di interesse a concentrazioni sequenzialmente crescenti e lasciare un minimo di cinque minuti tra le applicazioni per ridurre la possibile desensibilizzazione del recettore. Alla fine della registrazione, applicare un cocktail di agonisti per altri GQ astrocitici, GPCR come controllo positivo per le vie di segnalazione GPCR astrocitiche GQ Inpact.

Al termine della registrazione del calcio, scattare immagini fisse con i laser a 488 nanometri e 559 nanometri per confermare successivamente l'identità degli astrociti e il posizionamento del ROI. Ecco le immagini rappresentative delle cellule nel campo di registrazione, incubate in condizioni di controllo o in TTX che hanno assorbito il colorante indicatore di calcio Oregon Green BAFTA 1:00 AM e SR 1 0 1. La sovrapposizione di entrambi i segnali indica che gli astrociti caricati con caselle indicatrici di calcio vengono disegnati sui somi dei singoli astrociti per registrare l'intensità della fluorescenza nel tempo nel canale verde per monitorare l'attività del calcio negli astrociti.

Ecco le tracce del campione dalle scatole di registrazione dell'attività del calcio negli astrociti, gli astrociti incubati in TTX mostrano un aumento dell'attività spontanea e risposte di calcio MGL R del primo gruppo evocato più robuste, come evidenziato dai cambiamenti nel modello di risposta. Vengono mostrati esempi di transienti di calcio a picco singolo, multi picco e plateau e qui sono riportate le tracce rappresentative delle registrazioni di calcio degli astrociti da fette incubate in 5,0 millimolari di potassio A CSF per depolarizzare i neuroni e aumentare la loro velocità di sparo basale rispetto a 2,5 millimolari di potassio di controllo A CSF di controllo A CSF incubati con 5,0 millimolari di potassio A CSF esibiscono, un minor numero di transienti somatici spontanei di calcio e risposte evocate DHPG più deboli rispetto agli astrociti incubati nel controllo. L'imaging del calcio degli astrociti nel liquido cerebrospinale fornisce una buona lettura funzionale dei cambiamenti nella segnalazione del recettore accoppiato alla proteina G.

Tuttavia, non è in grado di individuare dove nella via di segnalazione stanno avvenendo questi cambiamenti. Pertanto, un approccio complementare sarebbe quello di utilizzare la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza o la citometria a flusso su astrociti che esprimono la proteina fluorescente verde, quindi applicare un anticorpo al recettore accoppiato alla proteina G di interesse e quindi eseguire western blot per cercare cambiamenti nei livelli di espressione del recettore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare il ridimensionamento dell'attività della tqt PCR degli astrociti, seguendo i cambiamenti nella trasmissione sinaptica neuronale registrando gli eventi spontanei e Agnes ha evocato gli eventi di calcio negli astrociti.