Un metodo a basso costo per l'analisi sequestro-come attività e il movimento in Drosophila

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le alterazioni dei comportamenti locomotori o convulsivi nella drosofila. Ciò si ottiene separando prima le mosche in fiale individuali con l'uso dell'anestesia. Successivamente, una semplice webcam viene utilizzata per registrare il movimento delle mosche.

I dati vengono quindi importati nell'immagine J per iniziare l'analisi. Infine, il software di analisi delle mosche personalizzato viene utilizzato per determinare la distanza, la velocità e la durata del movimento durante il periodo di registrazione. In definitiva, questo test può mostrare cambiamenti nel comportamento locomotorio o convulsivo associati a manipolazioni genetiche e farmacologiche.

Ora, questa tecnica di registrazione a basso costo che descriveremo può essere utilizzata sia per analizzare il comportamento convulsivo che la locomozione nei moscerini della frutta. In particolare, lo abbiamo utilizzato per identificare le manipolazioni genetiche e farmacologiche che modificano il comportamento convulsivo in quei moscerini. Ma oggi, Chris Burner, un assistente di ricerca universitario nel mio laboratorio, dimostrerà questa tecnica Per iniziare a configurare la webcam che registrerà le mosche durante i test locomotori e convulsivi.

Una volta posizionata la fotocamera, aprire il pratico programma software VI. Per regolare le impostazioni di registrazione, selezionare l'opzione immagini time-lapse nella scheda di acquisizione e, quando si apre la nuova finestra, selezionare la webcam come dispositivo di acquisizione. Per la maggior parte degli esperimenti, è sufficiente una dimensione del fotogramma video di sei 40 per quattro 80 Sotto l'opzione di compressione, selezionare il codec Intel IUV e impostare i secondi per fotogramma in base al saggio.

Nella scheda Avanzate, crea un file immagine bitmap per ogni acquisizione e seleziona una cartella in cui il programma memorizzi la pila di immagini una volta registrata. Quindi, posiziona una mosca morta su un foglio di carta. Fare clic sulla casella delle impostazioni video e, nella scheda delle impostazioni del dispositivo, regolare le impostazioni fino a quando lo sfondo bianco brillante non è in netto contrasto con la mosca più scura.

Fare clic sul pulsante di avvio per avviare la registrazione. Una volta terminato il periodo di registrazione, fare clic sul pulsante di arresto. La pila di immagini dovrebbe ora trovarsi nella cartella selezionata per iniziare il test dell'attività locomotoria.

Trasferire le mosche in fiale individuali tappate con un tappo di cotone. Lascia che le mosche rimangano indisturbate per 20-30 minuti prima di procedere. Trascorso questo tempo, picchiettare delicatamente la mosca da testare fuori dalla fiala e sotto il coperchio di una capsula di Petri.

Il coperchio dovrebbe contenere piccole fessure per consentire il flusso d'aria a posizionare la mosca sotto la webcam impostata in precedenza. Quando si è pronti, premere start per iniziare a registrare l'attività locomotoria. Il primo passo del test delle crisi è quello di nutrire mosche sensibili alle convulsioni di due giorni, sia con terreni standard che con terreni mescolati con il farmaco da testare.

Dopo due giorni di alimentazione, trasferire le mosche picchiettando delicatamente nelle singole fiale vuote e tappare le fiale con un tappo di cotone. Lascia che le mosche rimangano indisturbate per 20 minuti prima dell'osservazione. Quando sei pronto, agita una fiala su un vortice da laboratorio o utilizzando le impostazioni più alte per 10 secondi.

Posiziona immediatamente la mosca immobilizzata su un foglio di carta bianco direttamente sotto la webcam. Una volta posizionato, inizia la registrazione. Questo vola l'attività.

La mosca subirà movimenti rapidi e scoordinati intervallati da periodi di paralisi. La registrazione termina una volta che la mosca si è raddrizzata. Per iniziare ad analizzare i dati, aprire il software gratuito di elaborazione delle immagini image J una volta aperto.

Importa la pila di immagini desiderata facendo prima clic sulla scheda del file e quindi selezionando Importa. E infine, la sequenza di immagini. Seleziona la cartella che contiene la pila di immagini e apri un'immagine.

Quando si apre la finestra di dialogo delle opzioni di sequenza, selezionare i nomi di ordinamento numerico, quindi selezionare. Ok. Successivamente, seleziona la scheda dell'immagine e imposta il tipo di valore su otto bit. Fare nuovamente clic sulla scheda dell'immagine e selezionare la soglia sotto l'opzione di regolazione.

In questo modo si imposta la soglia in tutte le immagini in modo che ognuna sia costituita da uno sfondo bianco con la mosca convertita in un punto nero. Si apre anche la finestra di dialogo della soglia in cui è possibile regolare i punti di taglio. Scansiona le immagini per vedere se alcune contengono punti neri extra o se manca il punto.

Se necessario, regolare la soglia per alleviare eventuali problemi. Una volta apportate le modifiche, selezionare Applica nella finestra di dialogo della soglia. Quando si apre la finestra di dialogo Converti in maschera, fare clic su OK per sozzare la pila di immagini.

Per misurare il movimento della mosca in pixel, seleziona il plug-in multi tracker nella scheda dei plug-in. Quando viene visualizzata la finestra di dialogo dell'inseguitore di oggetti, fare clic su tutte e quattro le opzioni fornite e selezionare. Ok. Il plug-in multi tracker allegherà quindi le coordinate al nero.

in ogni fetta ed elencarli nella finestra dei risultati, nonché la lunghezza totale in pixel. La finestra dei percorsi fornisce la visualizzazione grafica del percorso seguito dalla mosca. Copia l'elenco delle coordinate X e Y dalla finestra dei risultati e incolla i dati in un foglio di calcolo Excel.

Se una diapositiva nella pila non contiene un nero., il programma multi tracker si fermerà a quella diapositiva. In questo caso, rimettere in soglia lo stack per assicurarsi che la mosca venga registrata come nera.

nella diapositiva in questione. Per convertire le lunghezze del percorso da pixel a centimetri, prendi un'immagine di due punti distanziati a una distanza nota su un foglio di carta bianco bianco. Determina le coordinate dei pixel XY per i due punti e utilizza queste informazioni per determinare il numero di pixel corrispondenti a un centimetro per ottenere risultati più accurati.

Rimuovi il rumore dalle immagini importando le coordinate XY in un programma di analisi delle mosche personalizzato. Una volta aperto, importa i dati di ciascun genotipo o trattamento in fogli di calcolo separati. Quindi, seleziona la scheda del foglio di riepilogo e fai clic sul pulsante fai clic su di me.

Selezionare un valore di soglia in base al tipo di analisi, fare clic su OK e il programma calcolerà la velocità, il tempo e la distanza di movimento. Questi percorsi rappresentativi mostrano un'attività simile a quella convulsiva nei moscerini mutanti con e senza trattamento con metformina. L'attività convulsiva è diminuita con il trattamento nei due mutanti testati.

La metformina ha ridotto significativamente sia la distanza percorsa durante il test convulsivo che la durata totale dell'attività convulsiva. Al contrario, non c'è stato alcun cambiamento nella velocità media in questi singoli percorsi locomotori. Il percorso della mosca CS di tipo selvatico mostra concentrazione intorno alla periferia dell'arena circolare.

Mentre il percorso di una mosca BSS mutante mostra la stessa concentrazione, ma con meno movimento nel complesso. Quando sono stati testati per la locomozione in un ambiente nuovo, i mutanti BSS hanno mostrato una significativa riduzione della lunghezza del percorso rispetto ai moscerini CS. Il test ha anche rilevato cambiamenti nella velocità di movimento durante l'esplorazione della mosca CS durante il test locomotore.

La mosca BSS è rimasta relativamente inattiva per tutta la durata della prova, ad eccezione di alcune esplosioni di attività. Una delle cose più importanti da tenere a mente quando si esegue uno di questi test comportamentali con questa tecnica è assicurarsi di non anestetizzare le mosche prima di effettuare le registrazioni. Si scopre che l'anestetizzazione influenzerà sia il comportamento convulsivo che il comportamento locomotore e può alterare significativamente i risultati.