Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare un campione per la crioTEM estraendo una lamella a fascio ionico focalizzato da un campione bulk criogenicamente congelato. Ciò si ottiene mediante prima immersione, congelando il campione in azoto liquido e montandolo all'interno del SEM a fascio ionico criofocalizzato. Il secondo passo consiste nel ritagliare un sottile LA Melo con il fascio ionico e trasferirlo su una griglia TEM per mezzo di un nano manipolatore raffreddato.

Successivamente, la griglia GST viene trasferita dal supporto SEM al titolare GST in una stazione di trasferimento. La fase finale è il trasferimento del titolare della TEM alla crioterapia per ulteriori analisi. In definitiva, il crioTEM viene utilizzato per mostrare immagini ad alta risoluzione, tomo Grahams o mappe a raggi X della lamella estratta.

Questa tecnica ci permetterà di analizzare la materia soffice con la massima risoluzione nel microscopio elettronico a trasmissione preselezionando il luogo di analisi con altre microscopie come la microscopia ottica o l'elettromicroscopia a scansione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la criomicrotomia Mac, è che si evitano artefatti di preparazione come la compressione e la formazione di def del campione. Per prima cosa monta due griglie TEM per campioni di fasci ionici focalizzati.

Sul supporto di trasferimento SEM, fissare le griglie serrando le viti corrispondenti con un cacciavite e chiudere le serrande, montare un tronchetto di campione appropriato per il campione e aggiungere una parte del campione. Ad esempio, utilizzare una pipetta per depositare goccioline su un tronchetto piatto. Quindi montare il supporto di trasferimento SEM sul dispositivo di trasferimento a vuoto o VTD.

Dopo aver aggiunto l'azoto liquido nella stazione di granita e aver pompato verso il basso, aprire la stazione e immergere, congelare nuovamente la pompa del supporto di trasferimento SEM fino a quando l'ebollizione non è completa e la granita è di nuovo ottenuta. Quindi, ritrarre il supporto di trasferimento SEM nella camera a vuoto del VTD e sigillarlo. Sfiatare la stazione di granita e la camera di preparazione criogenica Sfiato della camera di compensazione esterna.

Quindi abbinare la guarnizione VTD con la camera di compensazione della camera di preparazione criogenica e della pompa. Quando viene raggiunto un buon livello di vuoto, calibrare il perno della camera di compensazione per aprire la guarnizione del VTD e della camera di compensazione esterna. Quindi inserire il supporto di trasferimento SEM.

Successivamente, utilizzare un coltello freddo per aprire i coperchi protettivi delle fessure della griglia TEM. Spegnere l'alta tensione sul SEM a fascio ionico focalizzato e aprire la camera di compensazione interna. Quindi utilizzare il VTD per trasferire il supporto SEM nella camera del campione.

Una volta che il supporto SEM è nella fase fredda, sganciare il VTD spingendo e ruotando. Ritrarre completamente l'asta VTD nella camera a vuoto VTD e chiudere la camera di compensazione interna, la camera di compensazione esterna e la guarnizione VTD. A questo punto, riscaldare il gas precursore a 24-26 gradi Celsius e posizionare il sistema di iniezione del gas o l'ago GIS a un'altezza di circa un millimetro sopra la superficie del campione.

Durante l'imaging con il fascio di elettroni, aprire la valvola del gas per alcuni secondi. Quindi polimerizzare il deposito sulla regione di interesse, o ROI, utilizzando un fascio di ioni ampo da 1000 pico a basso ingrandimento. Dopo l'indurimento, inclinare il campione a 52 gradi in modo che la superficie sia perpendicolare al fascio ionico.

Macina via. Due trincee terroristiche. Su entrambi i lati della ROI, inclinare il campione all'indietro a zero gradi e utilizzare il fascio ionico per tagliare via i lati e la parte inferiore della lamella, assicurandosi che i segni di taglio passino attraverso l'intera lamella.

Una volta inserito l'ago GIS, manovrare il nano manipolatore fino a quando la sua punta non è a contatto fisico con la lamella, preferibilmente lateralmente. Aprire la valvola GIS per alcuni secondi e monitorare la criodeposizione mediante imaging continuo con il fascio di elettroni. Quando un ulteriore strato di platino da uno a due micrometri è stato depositato criogenico, chiudere la valvola seguendo questa polimerizzazione del platino solo nei pochi micrometri intorno al punto in cui il nano manipolatore è a contatto con la lamella.

Quindi utilizzare un'elevata corrente del fascio ionico per tagliare la lamella. Manovrare con cautela il nano manipolatore per estrarre la lamella dalle trincee e spostarla di almeno 500 micrometri sopra la superficie del campione. Dopo aver ritirato l'ago, abbassare il tavolino di alcuni millimetri e spostarlo fino a quando una delle griglie TEM non è in vista.

Spostare l'area di attacco sulla griglia in posizione di lavoro e inserire l'ago GIS. Successivamente, manovrare con attenzione il nano manipolatore per portare la lamella attaccata a contatto fisico con l'area di attacco sulla griglia TEM, aprire la valvola del gas per alcuni secondi e depositare criogenicamente uno strato aggiuntivo di platino da uno a due micrometri per polimerizzare il platino solo in pochi micrometri attorno al punto di contatto tra la lamella e la griglia TEM. Quindi utilizzare un'elevata corrente del fascio ionico per liberare la lamella dal nano manipolatore.

Inclinare il campione a 52 gradi e utilizzare il fascio ionico per assottigliarlo fino alla trasparenza degli elettroni. Dopo aver lavato la stazione di criotrasferimento con azoto gassoso secco, inserire il supporto TEM di criotrasferimento nell'apposita fessura della stazione di criotrasferimento e riempirlo con azoto liquido. Successivamente, immergere un cacciavite, lo strumento di bloccaggio del campione TEM e una pinzetta in una tazza criogenica riempita di azoto liquido per raffreddare le punte alla temperatura desiderata.

Una volta che il VTD è stato abbinato alla camera di compensazione esterna, portare lo stadio freddo all'altezza di trasferimento di 16 millimetri. Dopo aver disattivato l'alta tensione, aprire la guarnizione VTD, la camera di compensazione esterna e la camera di compensazione interna. Quindi utilizzare l'asta VTD per bloccarla nel supporto di trasferimento SEM spingendo e ruotando in senso orario.

A questo punto, ritrarre il supporto di trasferimento SEM nella camera di preparazione criogenica. Utilizzare il coltello freddo per chiudere i coperchi protettivi delle griglie TEM. Quindi utilizzare l'asta VTD per spostare il campione nella camera a vuoto del VTD e sigillare la camera di equilibrio.

Quindi sfiatare la camera di equilibrio esterna e staccare il VTD. Abbinare il VTD alla porta SEM della stazione di trasferimento criogenico. Durante il lavaggio con azoto secco, utilizzare il perno sulla stazione per aprire la guarnizione del VTD e far scorrere il supporto di trasferimento SEM nell'esecutore della stazione di trasferimento criogenico.

Utilizzando il cacciavite raffreddato, aprire uno dei coperchi e allentare la vite corrispondente, mantenendo la griglia TEM in posizione. Quindi raccogli la griglia TEM e posizionala nel supporto TEM usando le pinzette raffreddate. Successivamente, fissare la griglia TEM sul supporto TEM.

Utilizzando l'anello esagonale raffreddato, chiudere l'otturatore del supporto TEM per il trasferimento criogenico e scollegare la stazione di trasferimento criogenico dal sistema di pompaggio. Trasportare la stazione e il controller del riscaldatore del supporto TEM vicino al TEM e ricollegarli. Impostare lo stadio di campionamento TEM su un'inclinazione di -70 gradi.

Quindi, impostare il tempo di pompaggio più breve per la camera di compensazione con un solo ciclo di spurgo con azoto gassoso secco. Rimuovere il supporto TEM dalla stazione di trasferimento criogenico e inserirlo nel primo stadio del goniometro inclinato, che avvierà il ciclo di pompaggio. Una volta completato il ciclo, impostare il goniometro in modo che si inclini all'indietro a zero gradi tenendo il supporto TEM in modo che non ruoti con il goniometro.

Quindi inserire il supporto attraverso il goniometro completamente all'interno del TEM. Infine, ricaricare l'esecutore del supporto TEM per il trasferimento criogenico con azoto liquido. In questo metodo, le spore di aspergillus Niger vengono prima acquisite mediante SEM per identificare il sito di estrazione.

Una sezione trasversale di qualsiasi spora è sufficiente, ma è possibile posizionare il ROI per l'estrazione con precisione submicrometrica per affettare una cellula specifica a una distanza specifica dalla membrana cellulare. Una volta identificata la caratteristica di interesse, viene implementata la prima fase della criodeposizione Per proteggere il campione dai danni al fascio durante la macinazione ionica, il campione viene inclinato di 52 gradi, seguito dallo sputtering di due trincee su entrambi i lati della mella. Il campione viene quindi inclinato all'indietro e ulteriormente fresato, lasciando solo due piccoli ponti che lo collegano alla massa.

Il nano manipolatore raffreddato viene messo a contatto con la mella e un'altra criodeposizione di platino li salda insieme. I piccoli ponti di collegamento vengono fresati e il nano manipolatore sposta la lamella vicino all'area di attacco del grado TEM, dove viene saldata con una criodeposizione finale di platino. Il nano manipolatore viene quindi separato dalla lamella, che viene assottigliata fino alla trasparenza degli elettroni.

Con il fascio ionico, la lamella viene trasferita al TEM dove possono essere impiegate spettroscopia di imaging ad alta risoluzione, tomografia e altre tecniche. Questo metodo contribuirà a comprendere le interfacce della materia soffice del cuore in sistemi come le sonde neurologiche o gli impianti ossei. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni di criogenica TM che sono artefatto tre e che possono essere estratti da una regione specifica di un campione di insetto con precisione submicrometrica.