Molecular Profiling del microambiente tumorale invasiva in un modello 3-Dimensional delle cellule del cancro colorettale e

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare la biologia distintiva all'interfaccia tra cellule epiteliali maligne nel fronte tumorale invasivo e cellule stromali associate al cancro. Questo viene ottenuto innanzitutto stabilendo colture primarie di fibroblasti da impianti colici. Il secondo passaggio consiste nella costruzione di modelli di co-coltura organotipica utilizzando fibroblasti colici primari e cellule tumorali del colon-retto in coltura.

I successivi modelli organotipici vengono fissati in formalina, sezionati su vetrini con membrana e colorati con violetto di cresile. Il passaggio finale è la microdissezione laser, al fine di separare le cellule tumorali invasive da quelle non invasive e dalle cellule stromali associate al cancro. Infine, possono essere utilizzate tecniche di profilazione molecolare per caratterizzare la biologia delle cellule tumorali invasive e non invasive e delle cellule stromali nell'ambiente tumorale circostante.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo capito quanto siano chiaramente distinguibili le cellule invasive da quelle non invasive nei modelli tridimensionali di co-coltura organotipica del cancro del colon-retto. Per iniziare, ottenere campioni di tessuto della mucosa del colon umano normale direttamente dal blocco operatorio chirurgico in laboratorio. Posizionare un campione al centro di una piastra per colture di 10 centimetri, quindi lavare la coltura tre volte con soluzione salina tamponata al fosfato o PBS integrata con penicillina, streptomicina e fungizone.

Non aspirare dopo l'ultimo lavaggio; con pinze sterili e bisturi, tagliare il tessuto in piccoli pezzi. Quindi posizionare ogni pezzo al centro di una croce disegnata con la lama del bisturi. In una piastra a 12 pozzetti, muovere delicatamente il bisturi sul tessuto per favorirne l'adesione alla coltura.

I campioni in 750 microlitri di mezzo di crescita primario per fibroblasti, che deve ricoprire completamente il tessuto senza permettergli di galleggiare. Successivamente, posizionare i campioni in un incubatore a 37 gradi Celsius, con una concentrazione di CO2 compresa tra il 5 e il 10%, per i successivi cinque giorni. I fibroblasti inizieranno gradualmente a crescere a partire dai margini del tessuto dopo circa sette giorni.

Questo sarà più visibile dopo circa tre o quattro settimane. E se sono presenti un numero sufficiente di fibroblasti in crescita, aggiungere 750 microlitri di tripsina in ogni pozzetto dopo che le cellule si sono staccate, raccoglierle e trasferirle in un fiasco per colture tessutali T 25 per il gel organotipico impregnato di fibroblasti. Preparare innanzitutto una sospensione cellulare di fibroblasti contenente 500.000 cellule per gel in dmm supplementato.

Preparare i gel organotipici sul ghiaccio nei rapporti indicati nel protocollo testuale per nove gel da un millilitro ciascuno. Preparare 10 millilitri e mescolare delicatamente per evitare bolle d'aria. Aggiungere quindi un millilitro in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata.

Per consentire ai gel di solidificare dopo un'ora, aggiungere un millilitro di DMEM integrato in cima ai gel e riposizionare in incubatrice per tutta la notte. Il giorno seguente, aspirare il mezzo sovrastante i gel e seminare un millilitro di mezzo contenente 500.000 cellule epiteliali di carcinoma colorettale sulle membrane di nylon rivestite di gel.

Preparare in anticipo fogli sterili di nylon per autoclave di dimensioni 1,5 centimetri per 1,5 centimetri utilizzando pinze sterili. Posizionare il numero richiesto di fogli di nylon in una piastra di coltura da 10 centimetri. Preparare la miscela di gel su ghiaccio come descritto nel protocollo del testo e aggiungere idrossido di sodio 0,1 M alla miscela di gel fino a quando non diventa rosa, indicando che la soluzione è stata neutralizzata.

Quindi aggiungere 250 microlitri di questa soluzione a ciascun foglio di nylon. Successivamente, incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 per 30 minuti per consentire al gel di solidificare. Poi, aggiungere 10 millilitri di una soluzione al 1% di glutaraldeide in PBS a ciascuna piastra di coltura da 10 centimetri.

Una volta che il gel si è solidificato, incubare a quattro gradi Celsius per un'ora, quindi lavare le membrane di nylon tre volte in PBS e una volta in dme supplementato. Incubare le membrane tutta la notte nello stesso tampone a quattro gradi Celsius per innalzare i gel organotipici su griglie di acciaio, griglie di sostegno sterili preparate ripiegando fogli di acciaio inossidabile in una formazione a treppiede. Quindi utilizzare pinze, sterili e trattate con etanolo, per posizionare una griglia di acciaio in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Posizionare un foglio di nylon rivestito di gel con il lato al collagene rivolto verso l'alto su ciascuna griglia. Trasferire con attenzione i gel organotipici dalla piastra a 24 pozzetti al foglio di nylon rialzato utilizzando una spatola, sterilizzata ed etanolo. Riempire il pozzetto con D mem integrato fino a quando il foglio di nylon entra in contatto con il mezzo ma non è sommerso.

Assicurarsi che il mezzo non entri in contatto con il gel organotipico. Incubare per 14 giorni a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2. Sostituire il mezzo ogni due giorni.

Rimuovere l'intero preparato organotipico, compresa la pellicola di nylon, dal pozzetto e posizionarlo su un film aderente. Dividere a metà il preparato organotipico e la pellicola di nylon utilizzando un bisturi monouso pulito e fissare entrambe le metà in formaldeide per 24 ore. A temperatura ambiente, dopo 24 ore sostituire la formaldeide con etanolo al 70% e lasciare in overnight prima dell'inclusione in paraffina, sezionamento e colorazione per eseguire la microdissezione laser.

Prima sezione, l'organotipico a uno spessore di 10 micron su vetrini con membrana. Dopo aver trattato le sezioni come descritto nel protocollo del testo, prepararsi a eseguire la microdissezione laser utilizzando la piattaforma scelta. Posizionare il vetrino di vetro con la sezione colorata da microdissezionare.

In posizione prona sul palchetto del microscopio, montare un tubo microcentrifuga da 0,5 millilitri nella cassetta di raccolta e aggiungere 50 microlitri di buffer di lisi cellulare nel cappuccio, dove il tessuto microdissecato si raccoglierà sotto visione diretta. Utilizzare il joystick per identificare il tessuto di interesse e, tramite l'interfaccia software, annotare la sezione organica colorata, evidenziando le cellule da microdissezionare al fronte di invasione tumorale. Istruire il laser a sparare, in modo da tagliare la sezione evidenziata e contemporaneamente a lanciare il tessuto microdissecato all'interno del cappuccio del tubo microcentrifuga.

Procedere con l'elaborazione dei campioni mediante un metodo appropriato per estrarre l'analita di interesse. Qui vengono mostrate immagini di microdissezione laser di cellule tumorali colorettali SW 480 in fase di invasione della stroma organotipica. Il violetto di cresta viene utilizzato per evidenziare le cellule epiteliali tumorali colorettali.

Gli isolotti tumorali invasivi vengono quindi definiti prima della dissezione laser e il frammento tagliato viene trasportato su un dispositivo di raccolta. Le cellule non invasive e le cellule stromali vengono identificate e isolate utilizzando la stessa metodologia. Le colture co-tridimensionali sono state analizzate mediante profilazione di microRNA per confrontare i microRNA differenzialmente espressi tra le cellule presenti al fronte invasivo del tumore e quelle localizzate nelle zone stratificate del tumore.

I dati sono stati ordinati in base alla variazione completa e ai valori dei dati superiori o inferiori al doppio. Vengono presentate le variazioni di un esperimento rappresentativo che mostrano l'espressione differenziale dei geni di microRNA tra le cellule del margine invasivo e le cellule del margine non invasivo. Dopo aver visto questo video, dovreste avere un'idea chiara di come costruire modelli organotipici anatomicamente appropriati e di come utilizzare la microdissezione laser per isolare popolazioni specifiche di cellule da sottoporre a ulteriori analisi. Wow.