Molecular Profiling del microambiente tumorale invasiva in un modello 3-Dimensional delle cellule del cancro colorettale e Ex vivo fibroblasti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare la biologia distintiva all'interfaccia tra le cellule epiteliali maligne al fronte tumorale invasivo e le cellule stromali associate al cancro. Ciò si ottiene stabilendo prima colture primarie di fibroblasti da impianti del colon. Il secondo passo consiste nella costruzione di modelli di co-coltura organotipici utilizzando fibroblasti primari del colon e cellule tumorali del colon-retto in coltura.

I modelli organotipici successivi sono fissati in formina, sezionati su vetrini montati su membrana e colorati con viola crestale. Il passaggio finale è la microdissezione laser al fine di separare le cellule tumorali invasive dalle cellule tumorali non invasive e dalle cellule stromali associate al cancro. In definitiva, le tecniche di profilazione molecolare possono essere utilizzate per caratterizzare la biologia delle cellule tumorali invasive e non invasive e delle cellule stromali nel microambiente tumorale circostante.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto di quanto siano chiaramente distinguibili le cellule invasive dalle cellule non invasive in modelli tridimensionali di co-coltura organotipica del cancro del colon-retto. Per iniziare, prelevare campioni di tessuto normale della mucosa del colon umano direttamente dalla sala operatoria chirurgica in laboratorio. Posizionare un campione al centro di una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri, quindi lavare la coltura tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato o PBS integrato con penicillina, streptomicina e zona fungina.

Non aspirare dopo il lavaggio finale con pinze sterili e bisturi, tagliare il fazzoletto in piccoli pezzi. Posizionate poi ogni pezzo al centro di una croce disegnata con la lama del bisturi. In una piastra a 12 pozzetti, far oscillare delicatamente il bisturi sul tessuto per consentirgli di aderire alla coltura.

I campioni in 750 microlitri di terreno di coltura primario di fibroblasti, che dovrebbero immergere il tessuto senza consentirgli di galleggiare. Quindi posizionare i campioni in un incubatore a 37 gradi Celsius, dal 5 al 10% di CO2 nei prossimi cinque giorni. I fibroblasti inizieranno lentamente a crescere dal bordo del tessuto a circa sette giorni.

Questo sarà più visibile dopo circa tre o quattro settimane. E se ci sono abbastanza fibroblasti in crescita, aggiungere 750 microlitri di tripsina a ciascun pozzetto dopo che le cellule si sono staccate e trasferirli in un pallone di coltura tissutale T 25 per il gel organotipico impregnato di fibroblasti. Innanzitutto, preparare una sospensione di cellule fibroblastiche contenente 500.000 cellule per gel in dmm integrato.

Comporre i gel organotipici su ghiaccio nei rapporti che si trovano nel protocollo di testo per nove gel a un millilitro per gel. Preparare 10 millilitri e mescolare delicatamente per evitare bolle. Quindi aggiungere un millilitro a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata.

Per consentire ai gel di solidificarsi dopo un'ora, aggiungere un millilitro di DM EM integrato sopra i gel e rimetterli nell'incubatrice durante la notte. Il giorno seguente. Aspirare il terreno dalla parte superiore dei gel e impiattare un millilitro di terreno contenente 500.000 cellule epiteliali del cancro del colon-retto per i fogli di nylon rivestiti in gel.

Preparare in anticipo autoclavi sterili fogli di nylon di 1,5 centimetri per 1,5 centimetri utilizzando una pinza sterile. Mettere il numero richiesto di fogli di nylon in un piatto di coltura di 10 centimetri. Preparare la miscela di gel con ghiaccio come descritto nel protocollo di testo e aggiungere 0,1 molari di idrossido di sodio alla miscela di gel fino a quando non diventa rosa, indicando che la soluzione è stata neutralizzata.

Quindi aggiungere 250 microlitri di questa soluzione a ciascun foglio di nylon. Quindi incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 per 30 minuti per consentire al gel di solidificarsi. Quindi, aggiungere 10 millilitri di una soluzione di glutaraldeide all'1% in PBS a ciascuna piastra di coltura da 10 centimetri.

Una volta che il gel si è solidificato prima di incubare a quattro gradi Celsius per un'ora, lavare i fogli di nylon tre volte in PBS e una volta in dme integrato. Incubare i fogli per una notte nello stesso tampone a quattro gradi Celsius per sollevare i gel organotipici su griglie di acciaio per griglie di ponteggio sterilizzate per invasione che sono state preparate piegando fogli di acciaio inossidabile in una formazione a treppiede. Quindi utilizzare una pinza, sterilizzato ed etanolo per posizionare una griglia d'acciaio in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Posiziona un foglio di nylon rivestito di gel con il lato di collagene rivolto verso l'alto su ciascuna griglia. Trasferire con cura i gel organotipici dalla piastra a 24 pozzetti al foglio di nylon rialzato utilizzando una spatola, sterilizzato ed etanolo. Riempire il pozzetto con D mem integrato fino a quando il foglio di nylon è a contatto con il fluido ma non è sommerso.

Assicurarsi che il terreno non tocchi il gel organotipico. Incubare per 14 giorni a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2. Sostituendo il terreno ogni due giorni.

Togliere tutto il foglio di nylon organico, compreso il foglio, dal pozzetto e posizionarlo su pellicola trasparente. Dividere in due l'organotipico e il foglio di nylon utilizzando un bisturi monouso pulito e fissare entrambe le metà in formaldeide per 24 ore. A temperatura ambiente, sostituire la formaldeide con etanolo al 70% dopo 24 ore e lasciare riposare per una notte prima dell'inclusione nella paraffina, del sezionamento e della colorazione per eseguire la microdissezione laser.

Prima sezione, l'organotipico a 10 micron di spessore su vetrini montati su membrana. Dopo aver trattato le sezioni come descritto nel protocollo di testo, prepararsi a condurre la microdissezione laser utilizzando la forma della piattaforma scelta. Posizionare il vetrino con la sezione colorante da microsezionare.

A faccia in giù sul tavolino del microscopio, montare una provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri nella cassetta di raccolta e aggiungere 50 microlitri di tampone di lisi cellulare al tappo in cui si raccoglierà il tessuto microsezionato sotto visione diretta. Utilizzare il joystick per identificare il tessuto di interesse e, utilizzando l'interfaccia software, annotare la sezione organica colorata, evidenziando le cellule da microsezionare sul fronte dell'invasione tumorale. Istruire il laser a sparare, che dovrebbe sia ritagliare la sezione evidenziata che spingere il tessuto del microfiltro nel tappo della provetta della microcentrifuga.

Procedere all'elaborazione dei campioni con un metodo appropriato per estrarre l'analita di interesse. Qui sono mostrate le immagini di microdissezione laser delle cellule tumorali del colon-retto SW 480 che invadono lo stroma organotipico. Il viola crestale viene utilizzato per evidenziare le cellule epiteliali del cancro del colon-retto.

Le isole tumorali invasive vengono quindi definite prima che avvenga la dissezione laser e il pezzo tagliato viene trasportato a un dispositivo di raccolta. Le cellule non invasive e le cellule stromali vengono identificate e isolate utilizzando la stessa metodologia. Le cocolture tridimensionali sono state analizzate mediante profilazione di micro RNA per il confronto di microRNA espressi in modo differenziale tra le cellule al fronte tumorale invasivo e quelle nelle zone tumorali stratificate.

I dati sono stati ordinati in base alla modifica completa e i valori dei dati sono più o meno il doppio. Vengono presentati i cambiamenti di un esperimento rappresentativo che mostrano l'espressione genica differenziale del micro RNA tra le cellule a margine invasive e le cellule a margine non invasive. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come costruire modelli organotipici anatomicamente appropriati e di come utilizzare la microdissezione laser per isolare singole popolazioni di cellule per ulteriori studi. Ehi.