Valutazione della funzione vascolare nei pazienti con malattia renale cronica
16 giugno 2014
Il grado di disfunzione vascolare e contribuendo meccanismi fisiologici può essere valutata in pazienti con malattia renale cronica, misurando brachiale dilatazione dell'arteria flusso-mediata, velocità di propagazione dell'onda aortica e vascolare espressione della proteina delle cellule endoteliali.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la funzione vascolare nei pazienti con malattia renale cronica, ciò si ottiene raccogliendo prima le cellule endoteliali vascolari dai pazienti. La velocità dell'onda del polso aortico viene quindi valutata per misurare la rigidità dell'arteria elastica di grandi dimensioni. Successivamente, viene misurata la dilatazione mediata dal flusso dell'arteria brachiale per valutare la funzione endoteliale vascolare.
In definitiva, si possono ottenere risultati che caratterizzano la funzione endoteliale vascolare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo vascolare, come ad esempio cosa succede a livello cellulare all'espressione di varie proteine. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è necessaria una vasta pratica e formazione per padroneggiare l'imaging a ultrasuoni.
A dimostrare la procedura sarà Lonnie Perino, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare, prepara il sito con un antisettico topico. Successivamente, posizionare teli fenestrati sterili sul sito.
Un infermiere o un medico qualificato dovrebbe posizionare una flebo e collegare un adattatore per blocco epatite. Posiziona due fili a J sulle tende per srotolare la forma a J. Tirare l'arco della J su entrambi i fili.
Una volta srotolato, stappare l'hep lock e inserire il JWI nella vena di circa otto centimetri. Spingere il filo avanti e indietro più volte prima di rimuoverlo per evitare di accumulare troppo sangue sul filo. Quindi, usa delle tronchesi per tagliare i fili in modo che si inseriscano in un tubo conico da 50 millilitri contenente circa 30 millilitri di tampone di dissociazione.
Ripetere questi passaggi per il secondo filo al termine della raccolta del campione. Ritorno al laboratorio umido. Stringere i fili con un paio di pinze e tenerli all'interno del tubo ma sopra la soluzione per 10 minuti.
Utilizzare un pipettatore motorizzato per sciacquare i fili con il tampone di dissociazione dal tubo. Rilasciare il tampone in modo che scorra lungo la lunghezza dei fili e scrollarsi di dosso il liquido in eccesso nel tubo. Rimuovere i fili e centrifugare il campione in pellet.
Recuperare i campioni e risospendere il pellet in PBS prima della centrifugazione. Per altri cinque minuti dopo, utilizzare una punta per pipetta all'estremità di un tubo di aspirazione per lasciare circa due millilitri nel tubo. Aspirare il resto senza disturbare il pellet.
Risospendere il pellet e pipettare il campione in modo uniforme nelle aree ovali di otto vetrini precedentemente etichettati. Posizionare i vetrini nell'incubatore a 37 gradi Celsius per cinque ore prima di conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'inizio dell'analisi. Il soggetto dovrebbe cambiarsi in pantaloncini usa e getta e sdraiarsi supino in una stanza tranquilla, buia e climatizzata.
Quando sei pronto per iniziare, posiziona gli elettrodi per l'ecografia e il nostro dispositivo per la rigidità arteriosa. Quindi, posizionare il bracciale per la pressione sanguigna sul soggetto. Iniziare le letture della pressione sanguigna dopo 20 minuti, ripetere le letture fino a quando le misurazioni non sono entro cinque millimetri dal mercurio.
Riposando due minuti tra ogni lettura ed eseguendone almeno tre. Quindi palpare per il polso dell'arteria brachiale e posizionare il sonometro per registrare le forme d'onda brachiale. Ripetere per le arterie radiale, femorale e carotide.
Misura la distanza da ciascuno di questi siti dalla super tacca sternale usando un metro a nastro per le arterie brachiale, radiale e carotide e un righello personalizzato per il femorale. Successivamente, calcola la velocità dell'onda dell'onda del polso carotideo brachiale, carotideo, radiale e femorale carotideo utilizzando un software specializzato. Posizionare il bracciale per la pressione sanguigna dell'avambraccio appena distale rispetto al processo di reon.
Imposta il software vascolare sulla modalità trigger e registra almeno 10 cicli cardiaci dell'arteria brachiale di base, immagini ecografiche e misurazioni della velocità del flusso sanguigno. Se lo si desidera, è possibile utilizzare un braccio meccanico per stabilizzare la sonda a ultrasuoni. Quindi, gonfiare il bracciale per la pressione sanguigna dell'avambraccio a 250 millimetri di mercurio.
E inizia un timer. Istruire il partecipante a rimanere molto fermo. Inizia a registrare le velocità quando il timer segna quattro minuti e 45 secondi.
Rilasciare il bracciale dopo cinque minuti e modificare l'ecografia per registrare le immagini in modalità B. Quando l'orologio segna cinque minuti e 10 secondi. Continua a registrare fino a quando l'orologio segna sette minuti.
Quindi, prendi la pressione sanguigna del soggetto. Se la pressione arteriosa sistolica è maggiore o uguale a 100 millimetri di mercurio, posizionare 0,4 milligrammi di nitroglicerina sublinguale sotto la lingua del soggetto e avviare il timer. Avviare la registrazione in modalità B quando l'orologio segna tre minuti e interrompere la registrazione.
Quando l'orologio segna otto minuti. Per analizzare le cellule endoteliali colorate, un singolo sperimentatore in cieco dovrebbe scansionare i vetrini Sistematicamente, le cellule endoteliali sono identificate dalla colorazione positiva per la caderina VE e l'integrità nucleare è confermata dalla colorazione positiva per il dapi. Inoltre, le cellule devono essere colorate per la proteina di interesse.
È necessario eseguire l'imaging di un totale di 30 cellule per vetrino per un'analisi successiva. Ripetere questo processo per ogni vetrino del lotto colorato, incluso il vetrino di controllo VE. Il software qualitativo viene utilizzato per analizzare l'intensità della colorazione per l'anticorpo primario di interesse.
Questa immagine mostra il diametro basale dell'arteria brachiale ottenuto durante la valutazione di un paziente con malattia renale cronica dopo il rilascio della cuffia per due minuti. Questa registrazione mostra una variazione di diametro con gate dell'onda R. Queste forme d'onda sono state ottenute in ciascuna delle arterie carotide e femorale.
La differenza di tempo e distanza è stata utilizzata per calcolare un rapporto sulla velocità dell'onda del polso aortico. Qui, le cellule di controllo e quelle del paziente sono state analizzate per l'integrità nucleare con l'espressione di cellule endoteliali DPI con caderina VE e per l'enzima ossidante N-A-D-P-H ossidasi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottenere immagini ecografiche, forme d'onda e immagini delle cellule endoteliali della massima qualità possibile per una valutazione accurata e quantitativa.
Non dimenticare che lavorare con campioni umani può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati.
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Panoramica
Questo studio valuta la funzione vascolare in pazienti con malattia renale cronica misurando diversi parametri fisiologici. Le metriche principali includono la dilatazione mediata dal flusso dell'arteria brachiale e la velocità dell'onda del polso aortico, che forniscono informazioni sulla funzione endoteliale vascolare e sulla rigidità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Salute cardiovascolare
- Malattia renale cronica
Sfondo
- La disfunzione vascolare è comune nella malattia renale cronica.
- Comprendere la funzione endoteliale è fondamentale per la gestione del paziente.
- La misurazione della rigidità arteriosa aiuta a caratterizzare lo stato di salute vascolare.
- Le tecniche di imaging ecografico sono essenziali per queste valutazioni.
Scopo dello studio
- Valutare la funzione endoteliale vascolare in pazienti con malattia renale cronica.
- Misurare la velocità dell'onda del polso aortica per la valutazione della rigidità arteriosa.
- Migliorare la comprensione dell'espressione proteica a livello cellulare.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di cellule endoteliali vascolari dai pazienti.
- Valutazione della velocità dell'onda del polso aortico.
- Misurazione della dilatazione mediata dal flusso dell'arteria brachiale.
- Analisi dei risultati per caratterizzare la funzione vascolare.
Risultati principali
- È stata ottenuta la caratterizzazione della funzione endoteliale vascolare.
- I risultati hanno indicato variazioni nella rigidità arteriosa tra i pazienti.
- Sono state ottenute informazioni sui cambiamenti nell'espressione proteica.
- La metodologia ha evidenziato la necessità di una formazione approfondita nell'imaging ecografico.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un quadro di riferimento per la valutazione della salute vascolare nella malattia renale cronica.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi fisiologici del danno vascolare.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi metodi per esplorare ulteriori implicazioni vascolari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La disfunzione vascolare nella malattia renale cronica rappresenta un fattore di rischio cardiovascolare non tradizionale che influisce sulle valutazioni della sicurezza e dell'efficacia dei farmaci. La misurazione della funzione endoteliale e della rigidità arteriosa fornisce informazioni meccanicistiche utili per ridurre i rischi legati a complicanze cardiovascolari nello sviluppo preclinico e clinico. Queste valutazioni supportano la validazione del bersaglio terapeutico collegando i percorsi fisiopatologici all'intervento terapeutico nelle popolazioni affette da malattia renale cronica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verificare ipotesi terapeutiche quantificando la dilatazione dipendente dall'endotelio come parametro funzionale della biodisponibilità di ossido nitrico.
- Valore operativo: Consentire la chiarificazione dei percorsi metabolici attraverso la correlazione tra marcatori dello stress ossidativo e risultati funzionali vascolari.
- Valore predittivo: Supportare la selezione del portafoglio identificando composti che aggravano o attenuano la disfunzione vascolare in sistemi pertinenti alla malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Preparare sistemi di cellule endoteliali validati per lo screening di composti mediante protocolli standardizzati di isolamento e colorazione.
- Risultati quantitativi: Ottenere misurazioni riproducibili della dilatazione mediata dal flusso e della velocità dell'onda del polso per la modellizzazione dose-risposta.
- Riutilizzo della piattaforma: Stabilire flussi di lavoro scalabili per la valutazione della funzione vascolare in diversi ambiti terapeutici che coinvolgono la salute endoteliale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Utilizzare cellule derivate da pazienti con malattia renale cronica per modellare la patofisiologia vascolare umana e migliorare la fedeltà traslazionale.
- De-risking meccanicistico: Collegare le variazioni nell'espressione proteica (ad esempio, ossidasi NADPH) agli esiti vascolari funzionali per chiarire il meccanismo d'azione.
- Avanzamento basato sul rischio: Informare le decisioni di proseguimento o interruzione integrando precocemente segnali di sicurezza vascolare nel percorso scoperta.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo integra la valutazione della funzionalità vascolare nel flusso di lavoro della scoperta, collegando i fenotipi cellulari a risultati a livello di tessuto e supportando un affinamento iterativo dei candidati terapeutici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando i percorsi dello stress ossidativo alla funzione endoteliale attraverso modifiche misurabili nell'espressione proteica.
- Screening: Fornisce cellule endoteliali pronte per saggi, con vitalità ed espressione dei marcatori confermate, per applicazioni di screening di composti.
- Analisi: Offre letture quantitative e indipendenti (FMDBA, aPWV) che permettono il confronto tra diverse condizioni e il rilevamento di segnali.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica utilizzando cellule di origine umana per modellare la disfunzione vascolare associata alla malattia renale cronica (CKD).
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione del rischio vascolare in diversi programmi terapeutici cardiovascolari, metabolici e renali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica tra bersagli molecolari e fenotipi vascolari.
- Valore operativo: Standardizza la valutazione della funzione vascolare attraverso procedure riproducibili di isolamento cellulare, acquisizione di immagini e analisi.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'identificazione precoce di potenziali criticità vascolari, riducendo il rischio di fallimento nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione dei candidati in base al rischio, basandosi sui profili di sicurezza vascolare ottenuti in modelli rilevanti per la malattia renale cronica (CKD).
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging vascolare mediante ultrasuoni, nell'isolamento di cellule endoteliali e nelle tecniche di immunofluorescenza.
- È subordinato all'accesso a dispositivi per la misurazione della rigidità arteriosa, sistemi ecografici ad alta risoluzione e microscopia a fluorescenza.
- Necessita di una standardizzazione congiunta tra i team clinici, di laboratorio e di imaging per garantire la coerenza nella gestione dei campioni e nei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il protocollo a diversi distretti vascolari o modelli animali.
- È limitato dalla necessità di un'ampia formazione per ottenere un'acquisizione affidabile di onde e immagini, in particolare nei passaggi dipendenti dall'ecografia.
