A Modified In vitro Invasion test per determinare il ruolo potenziale di ormoni, citochine e / o fattori di crescita nella mediazione Cancer Invasion cellulare

Questo articolo video descrive un metodo in vitro modificato per esaminare il ruolo di ormoni, citochine e/o fattori di crescita nel guidare l'invasione delle cellule tumorali.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di stabilire un test in vitro per esaminare il ruolo di ormoni, citochine e/o fattori di crescita nel guidare l'invasione delle cellule tumorali. Ciò si ottiene determinando se esiste una differenza tra l'indice di invasione di diverse varianti cellulari o mutanti come secondo passo. Il test di invasione viene ripetuto utilizzando un terreno di coltura spogliato al carbone, che rimuove ormoni, fattori di crescita o citochine dal siero.

Il test di invasione viene quindi ripetuto con l'aggiunta di uno specifico fattore noto al terreno spogliato al carbone per determinare se la migrazione verso tale fattore aumenta o inibisce l'invasione. I risultati mostrano i cambiamenti nell'indice di invasione per specifiche popolazioni cellulari che si verificano durante la migrazione verso fattori sperimentali noti basati sulla normalizzazione dei risultati rispetto all'indice invasivo delle popolazioni cellulari non invasive. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavo eseguendo un test di invasione tradizionale e ho notato che c'era una differenza significativa tra gli indici di invasione per i diversi mutanti cellulari.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il tradizionale saggio di invasione, è che con questa tecnica è possibile studiare in modo specifico il ruolo di ormoni, fattori di crescita specifici e citochine nel promuovere o inibire l'invasione cellulare. Questo metodo può essere utile per rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro, inclusi i fattori che portano alle metastasi del cancro. Le implicazioni di questa tecnica possono fornire un approccio terapeutico alla futura progettazione di farmaci Per ogni linea cellulare da testare, utilizzare una piastra a 24 pozzetti con 12 inserti.

Etichettare quindi le lastre in base alle condizioni da analizzare. Successivamente, con attenzione, erogare 75 microlitri di una soluzione di matrice di collagene appena preparata in ciascun inserto che verrà utilizzato per un test di invasione facendo attenzione a non formare bolle. Quindi incubare le piastre con gli inserti rivestiti di collagene a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per 30 minuti per consentire al gel di solidificarsi.

Dopo aver staccato le cellule sperimentali con tripsina, aggiungere un terreno integrato con il 10% di FBS per inattivare l'enzima e lavare le cellule tre volte in PBS. Quindi risospendere il pellet in terreno privo di siero e contare le cellule. Aggiungere terreni privi di siero a una concentrazione finale di 50.000 cellule per millilitro quando la matrice di collagene si è solidificata.

Dopo 30 minuti, aggiungere 700 microlitri di terreno con FBS 2% definito, FBS smontato al carbone o FBS spogliato al 2% più il componente aggiuntivo in ciascuno. Aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare in terreno privo di siero nella parte superiore di ogni migrazione o invasione. Inserire, incubare i saggi per 22 ore a 37 gradi Celsius.

Quindi aggiungere metanolo, fissativo, eoina ed ematina in tre dei pozzetti vuoti della piastra della camera. Quindi, rimuovere le cellule e la matrice dalla parte superiore di ciascun inserto con due tamponi di cotone sequenziali. Quindi usando il forcipe.

Immergere ogni inserto cinque volte per un secondo ogni volta in ciascuna delle tre soluzioni coloranti in successione e lasciare asciugare gli inserti per una notte capovolti. Il giorno dopo. Utilizzare un obiettivo 20x per acquisire immagini delle cellule sugli inserti visualizzando direttamente gli inserti colorati.

Vengono scattate cinque immagini per ogni campione, di cui quattro dai campi esterni della membrana e una dal centro. Infine, utilizzando il software per immagini J, contare le cellule per ogni immagine e calcolare l'indice di invasione normalizzato in una linea cellulare non invasiva. Questo modello dimostra i potenziali risultati che si possono incontrare durante un test di invasione e come interpretare i dati corrispondenti.

Ogni cerchio illustra un risultato rappresentativo per un filtro colorato da una delle tre condizioni testate, e ogni punto rappresenta una cellula che è passata attraverso la matrice di invasione ed è stata colorata sul fondo della membrana. L'indice di invasione viene quindi calcolato per ciascuna condizione in base alla sua normalizzazione in una linea cellulare non invasiva. Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, sono stati testati tre ormoni per identificare un possibile fattore x.

Due degli ormoni non hanno avuto alcun effetto sull'indice di invasione, ma uno è stato identificato per esibire proprietà inibitorie una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in circa quattro ore il primo giorno e un'ora il secondo giorno se tutti i passaggi vengono eseguiti correttamente. Durante l'utilizzo di questa tecnica, è importante etichettare correttamente ogni singolo inserto cellulare con cura.

Abbiamo utilizzato un sistema di codifica a colori e diversi punti per etichettare accuratamente ogni inserto di cella. Altri metodi, come i modelli murini in vivo per le metastasi, potrebbero essere utilizzati per convalidare i risultati in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la rilevanza fisiologica di fattori come ormoni, fattori di crescita e citochine come potenziatori o inibitori dell'invasione cellulare in un modello in vitro.

Grazie per il tuo interesse per il nostro video e buona fortuna per i tuoi esperimenti.