Name: Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l In vitro Replica Capacità di HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4 chimerici virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Scopri un metodo di clonazione basato su enzima di restrizione per valutare la capacità replicativa in vitro di virus chimerici HIV-1 Gag-MJ4. Questa tecnica consente di studiare il ruolo delle variazioni del gene gag nella patogenesi virale.

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I ricercatori ringraziano tutti i volontari in Zambia che hanno partecipato a questo studio e tutto il personale dello Zambia Emory HIV Research Project a Lusaka che ha reso possibile questo studio. Gli investigatori desiderano ringraziare Jon Allen, Smita Chavan e Mackenzie Hurlston per l'assistenza tecnica e la gestione dei campioni. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Mark Brockman per le sue discussioni e la generosa donazione delle cellule GXR25.
Questo studio è stato finanziato da R01 AI64060 e R37 AI51231 (EH) e dall'International AIDS Vaccine Initiative. Questo lavoro è stato reso possibile in parte dal generoso sostegno del popolo americano attraverso l'Agenzia degli Stati Uniti per lo Sviluppo Internazionale (USAID). I contenuti sono sotto la responsabilità degli autori dello studio e non riflettono necessariamente le opinioni dell'USAID o del governo degli Stati Uniti. Questo lavoro è stato anche supportato, in parte, dal Virology Core presso l'Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC e JP sono stati sostenuti in parte da Action Cycling Fellowships. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione di base dello Yerkes National Primate Research Center (2P51RR000165-51). Questo progetto è stato anche finanziato in parte dal National Center for Research Resources P51RR165 ed è attualmente supportato dall'Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

A causa della lunghezza e la natura tecnica di questo protocollo, ci sono diversi passaggi che sono fondamentali sia per la costruzione di successo di plasmidi chimerici Gag-MJ4 nonché per la quantificazione della capacità di replicazione virale. Anche se la strategia di clonazione basata enzima di restrizione per l&#39;introduzione di geni gag estera in MJ4 descritto in questo protocollo ha numerosi vantaggi rispetto ai metodi basati ricombinazione utilizzati in precedenza, il protocollo può essere tecnicament...

Determinare l&#39;host e le caratteristiche virali che influenzano HIV-1 patogenesi e nella progressione della malattia è fondamentale per la progettazione razionale di vaccini. La risposta immunitaria cellulare è un componente chiave della risposta immunitaria umana HIV-1. Linfociti T citotossici (CTL) sono necessari per il controllo iniziale della viremia acuta, e permettono l&#39;host di stabilire uno stato di equilibrio (set point) carica virale 1,2. Deplezione sperimentale di queste cellule effettrici si traduce in perdita di controllo virale 3,4. Nonostante questo, sfuggono le mutazioni sorgono all&#39;interno del genoma virale che sovvertire CTL riconoscimento delle cellule infettate da virus 5-9. Alcuni alleli HLA sono stati associati con una carica virale inferiore e la progressione della malattia più lenta tra cui B * 57, B * 27 e B * 81 10-15. Parte del beneficio protettivo di alleli HLA di classe I può essere attribuito al fatto che esse mirano regioni funzionalmente vincolati del genoma come Gage selezionare per le mutazioni di fuga che riducono la capacità del virus di replicarsi in vitro 16-21. Sebbene fuga dal sistema immunitario cellulare è vantaggioso per il virus nel contesto della classe I allele HLA selezione, l&#39;effetto di queste mutazioni può avere conseguenze differenziali per l&#39;host dopo la trasmissione a un HLA-non corrispondenti individuale 22,23. Pertanto, la comprensione degli effetti delle mutazioni trasmesse fuga HLA-associato sulla capacità di replicazione virale sarà importante per migliorare la nostra comprensione dei primi HIV-1 patogenesi. Sebbene siano stati compiuti molti progressi per identificare e caratterizzare i difetti di fitness di mutazioni di fuga individuali associati con particolare HLA di classe I alleli 24-29, naturalmente HIV-1 isolati sono impronte uniche e complesse di polimorfismi HLA-associato, probabilmente derivanti dalla HLA pressione immunitaria mediata di diversa provenienza immunogenetici 30. In apanalisi revious, Goepfert et al. ha dimostrato che un accumulo di mutazioni HLA-associati nelle sequenze Gag trasmessi derivate da 88 Zambians infezione acuta era associato ad una riduzione della carica virale set point 31. Questo suggerisce che la trasmissione di mutazioni deleterie di fuga, in particolare in Gag, ai destinatari HLA-non corrispondenti fornisce un beneficio clinico, e può essere dovuto ad attenuare la replicazione virale. Andando avanti, è imperativo studiare come complesso combinazioni di polimorfismi Gag all&#39;interno isolati naturali lavorano in concerto per definire le caratteristiche del virus trasmesso come la capacità di replicazione, e come la replicazione precoce potrebbe a sua volta influenzare HIV-1 parametri clinici e di fase tardo- patogenesi. Brockman et al. Prima dimostrato un legame tra la capacità di replicazione di sequenze gag-pro isolato durante l&#39;infezione fase cronica e la carica virale sia nel sottotipo C e le infezioni B32-35. L&#39;approccio sperimentale presentato in questi studi, anche se adeguato per esaminare la capacità di replicazione in vitro di sequenze derivate da individui cronicamente infetti, ha diversi avvertimenti tecnici e limitazioni che rendere lo studio di HIV-1 capacità replicativa nel sottotipo C individui con infezione acuta difficile. Questo metodo si basa sulla ricombinazione di base di popolazione sequenze PCR-amplificate nel sottotipo B NL4-3 provirus, che è stato derivato in parte da LAV, un laboratorio adattato virus magazzino 36. Generazione di virus è stato realizzato da co-trasfezione di una base-CEM linea di cellule T 37 con ampliconi della PCR e digerito delta- NL4-3 DNA gag-pro. Questo metodo richiede l&#39;escrescenza di virus in un periodo di settimane o mesi, potenzialmente alterando la natura del virus magazzino recuperati rispetto ai quasispecie virale in vivo, e quindi alterare la misurazione della capacità di replicazione in vitro. Questo metodo is più appropriato per studiare gli individui cronicamente infette, dove seleziona efficacemente per virus con la più alta capacità replicativa, e dove clonazione numerose varianti virali differenti da un gran numero di individui cronicamente infette è piuttosto intenso lavoro e quindi non fattibile. Tuttavia, all&#39;interno di un individuo infetto acutamente, ci sono generalmente 01:59 varianti presenti, ed eliminando così il rischio di inclinazione della natura del virus magazzino recuperato, attraverso pressioni della selezione in vitro, consente una valutazione più accurata della capacità di replicazione in vitro. In secondo luogo, questo metodo richiede ricombinazione sottotipo C sequenze gag-pro in un sottotipo B dorsale derivato, e potrebbe introdurre distorsioni backbone incompatibilità nell&#39;analisi. A causa di queste limitazioni, un gran numero di sequenze devono essere analizzati al fine di superare eventuali distorsioni introdotte potenziali. Qui si descrive un appro sperimentale alternativaach appropriata per studiare le sequenze derivate dal sottotipo C individui con infezione acuta. Usiamo una strategia di clonazione basata enzima di restrizione per introdurre il gene gag derivato dal acuti momenti di infezione da HIV-1 sottotipo C individui infetti nella spina dorsale provirale sottotipo C, MJ4. L&#39;uso di MJ4 come una spina dorsale comune in cui clonare i geni gag è cruciale per l&#39;analisi di sottotipo C sequenze derivate. MJ4 è derivato da un isolato primario 38, e quindi sarebbe meno probabilità di introdurre bias dovuto al sottotipo incompatibilità tra la spina dorsale e il gene gag. Inoltre, l&#39;approccio di clonazione mediante restrizione basata enzima permette la provirale costruisce essere trasfettate direttamente nelle cellule 293T, e per il recupero di un virus magazzino clonale identica alla sequenza di gag clonata. Il metodo presentato qui di seguito è un metodo ad alta produttività per la valutazione della capacità di replicazione del sottotipo C derivato Gag-MJ4virus chimerici. Trasfezione in cellule 293T è semplice e il recupero di virus richiede solo tre giorni. In vitro la capacità di replica viene analizzato sulla stessa base linea di T-cellule CEM-CCR5 creato da Brockman et al. 37, ma con importanti modifiche di protocollo necessario per la replica di successo di sottotipo C MJ4 virus chimerici. L&#39;utilizzo di una linea di T-cella appropriata piuttosto che PBMC permette un gran numero di sottotipo C virus MJ4-chimerico per essere testati con alto dosaggio riproducibilità. Infine, utilizzando un radiomarcato test trascrittasi inversa per la quantificazione del virus nel surnatante è più conveniente rispetto all&#39;utilizzo di kit ELISA disponibile in commercio P24. Inoltre, dà una gamma dinamica superiore, che era importante per rilevare i virus male e altamente replicare all&#39;interno dello stesso test e per la rilevazione di sottili differenze nella replica tra gli isolati. In conclusione, il metodo qui presentato ha permessolo studio approfondito della capacità di replicazione di sequenze gag derivati ​​da HIV-1 sottotipo C acutamente infettato individui dallo Zambia, e come scritto, potrebbe anche essere esteso a studiare altri sottotipo C popolazioni infettato. È stato osservato un alto grado di variazione capacità di replica tra i diversi isolati Gag. Inoltre, siamo stati in grado di dimostrare un&#39;associazione statistica tra la capacità di replicazione del Gag trasmessi e set point carica virale così come con CD4 + declino nel corso di un periodo di tre anni 39. Tali risultati sottolineano l&#39;importanza di studiare le caratteristiche virali come trasmesso, come la capacità di replica, interagiscono con il sistema immunitario ospite di influenzare patogenesi durante l&#39;infezione precoce e saranno parte integrante per lo sviluppo di interventi di vaccini efficaci e trattamento.

<table><tbody><tr><td colspan="4">PCR Reagents</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCCTTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalinizzazione standard</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalinizzazione standard</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Prodotto da Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 provette a strisce, blu (tappo piatto)</td><td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III sistema RT-PCR in un solo passaggio</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II DNA polimerasi</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucleotide Mix</td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, alta resistenza del gel</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb Scala DNA</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Prodotto da Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10.000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel e Sistema di pulizia PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba, a taglio singolo</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Prodotto da Surgical Design</td></tr><tr><td>Thermocycler, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microbiology & Reagenti di clonazione</td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Sterili 100 x 15 mm Piastre di Petri in polistirene</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Polipropilene tubi a fondo tondo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>endonucleasi di restrizione NgoMIV</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasi di restrizione BclI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasi di restrizione HpaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi, 5 U/&mu; l</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109 cellule competenti, >108 cfu/&mu; g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di miniprep plasmidico PureYield</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Transilluminatore a luce blu</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagenti per colture cellulari</td></tr><tr><td>Pulitore/disinfettante per anfile</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Prodotto da Promega</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Costar Plates, 6 pozzetti, piatto</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Prodotto da Corning Life</td></tr><tr><td>Costar Plates, 24 pozzetti, piatto</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Prodotto da Corning Life</td></tr><tr><td>Piastre Costar, 96 pozzetti, rotonde</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Prodotto da Corning Life</td></tr><tr><td>Flasks, Filtro Corning superiore/collo inclinato, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Flask, Filtro Corning superiore/collo inclinato, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Prodotto da Corning Life</td></tr><tr><td>Tubi conici, 50 ml, tappo blu</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Prodotto da BD Biosciences</td></tr><tr><td>Tubi conici, 15 ml, tappo blu</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>Prodotto da BD Biosciences</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Prodotto da Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/ Streptomicina/Glutammina, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS con magnesio e calcio, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza magnesio e calcio</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Provette Sarstedt, colori assortiti</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Vassoi serbatoio per Multicanale, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 micropiastra trattata con coltura tissutale a V trasparente</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Prodotto da Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES, soluzione tampone 1 M</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, definito, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Prodotto da Promega</td></tr><tr><td>Glutaraldeide, Grado II, 25% in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M Soluzione di cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide, per biologia molecolare, 36,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potassio esacianoferrato(II) triidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Esacianoferrato di potassio(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Allegra X15-R</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 contatore cellulare automatizzato</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito VistaVision</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagenti per saggi di quantificazione della trascrittasi inversa </td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8.0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Deve essere regolato a pH 7.8 con KOH</td></tr><tr><td>2 M Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Adjust a 1 soluzione M</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Acido poliadenilico (Poly rA) sale di potassio&nbsp;</td><td>Midland Reagente Co.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) primer</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, schermo al fosforo a super risoluzione, piccolo</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell 96-well plate model (M) Policarbonato</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>Prodotto da Corning Life</td></tr><tr><td>Nastro sigillante in alluminio per micropiastre Corning a 96 pozzetti, Fisher non sterile</td><td></td><td>07-200-684</td><td>Prodotto da Corning Life</td></tr><tr><td>DE-81 carta a scambio anionico</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta per autoradiografia</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Schermo di fosforo di stoccaggio a ciclone</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l&#39;<em&gt; in vitro</em&gt; replica capacità di hiv-1 sottotipo c gag-mj4 chimerici virus

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

L'effetto protettivo di molti alleli HLA di classe I sulla patogenesi dell'HIV-1 e sulla progressione della malattia è, in parte, attribuito alla loro capacità di colpire porzioni conservate del genoma dell'HIV-1 che sfuggono con difficoltà. I cambiamenti di sequenza attribuiti alla pressione immunitaria cellulare si verificano in tutto il genoma durante l'infezione e, se trovati all'interno di regioni conservate del genoma come il Gag, possono influenzare la capacità del virus di replicarsi in vitro. La trasmissione di polimorfismi legati all'HLA in Gag a riceventi HLA-mismatched è stata associata a una riduzione delle cariche virali del set point. Abbiamo ipotizzato che ciò possa essere dovuto a una ridotta capacità di replicazione del virus. Qui presentiamo un nuovo metodo per valutare la replicazione in vitro di HIV-1 come influenzato dal gene gag isolato da punti temporali acuti da zambiani infetti da sottotipo C. Questo metodo utilizza il clonaggio basato su enzimi di restrizione per inserire il gene gag in una spina dorsale provirale comune dell'HIV-1 di sottotipo C, MJ4. Ciò lo rende più appropriato per lo studio delle sequenze del sottotipo C rispetto ai precedenti metodi basati sulla ricombinazione che hanno valutato la replicazione in vitro di sequenze gag-pro di derivazione cronica. Tuttavia, il protocollo potrebbe essere facilmente modificato per studi di virus di altri sottotipi. Inoltre, questo protocollo descrive un metodo robusto e riproducibile per valutare la capacità di replicazione dei virus chimerici Gag-MJ4 su una linea cellulare T basata su CEM. Questo metodo è stato utilizzato per lo studio dei virus chimerici Gag-MJ4 derivati da 149 zambiani infettati in modo acuto dal sottotipo C e ha permesso l'identificazione di residui in Gag che influenzano la replicazione. Ancora più importante, l'implementazione di questa tecnica ha facilitato una comprensione più profonda di come la replicazione virale definisca i parametri della patogenesi precoce dell'HIV-1, come la carica virale e il declino longitudinale delle cellule T CD4+.

Per eseguire correttamente questo protocollo, che crea un plasmide provirale in grado di assemblare completamente funzionale, infettive chimere Gag-MJ4, grande cura deve essere presa per generare le opportune ampliconi della PCR. Determinare se la PCR ha generato all&#39;amplicon bavaglio di dimensioni appropriate è fondamentale. I prodotti dovrebbero essere meno di 100 paia di basi (bp) del amplicone circa 1.700 bp rappresentato nella figura 1A. La lunghezza esatta di questo frammento varierà ...

La patogenesi dell'HIV-1 è definita sia dalle caratteristiche virali che dai fattori genetici dell'ospite. Qui descriviamo un metodo robusto che consente misurazioni riproducibili per valutare l'impatto della variazione della sequenza genica gag sulla capacità di replicazione in vitro del virus.

Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l&#39;<em&gt; In vitro</em&gt; Replica Capacità di HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4 chimerici virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

L'obiettivo generale di questa procedura è inserire geni gag derivati da individui infetti da HIV1 sottotipo C in un plasmide HIV1 con capacità replicativa, al fine di valutare l'effetto delle polimorfismi della sequenza gag sulla capacità replicativa dell'HIV1 in vitro. Questo viene ottenuto innanzitutto amplificando il gene gag dal plasma del paziente. Il secondo passaggio consiste nel clonare la sequenza gag derivata dal paziente nel clone molecolare infettivo con capacità replicativa MJ-four. Successivamente, il plasmide quimera gag-MJ-four viene trasfettato per generare ceppi virali infettivi e titolati per valutare l'infettività su una linea cellulare indicatore. L'ultimo passaggio prevede la misurazione della capacità replicativa in vitro nella linea cellulare T GXR-25. Infine, un saggio di trascrittasi inversa marcata radioattivamente viene utilizzato per quantificare la produzione di virioni nel tempo al fine di visualizzare la cinetica della replicazione virale.Il metodo che descriveremo oggi può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'HIV. Tra queste, definire i determinanti della capacità replicativa dell'HIV e comprendere come la fitness dell'HIV influisca sulla patogenesi a lungo termine. La descrizione dei metodi sarà effettuata oggi da Jessica Prince e Dan Claiborne, due dei miei studenti universitari.Per iniziare questa procedura, effettuare la trascrizione inversa del cDNA dall'RNA e amplificare i prodotti di DNA del primo ciclo utilizzando la trascrittasi inversa e una DNA polimerasi termo-stabile in una reazione RT-PCR in un unico passaggio. Successivamente, utilizzando un microlitro dell'amplificazione PCR del primo ciclo come stampo di DNA, eseguire un'amplificazione PCR nested di secondo ciclo. Quindi, aggiungere tre microlitri di colorante di carico 5X a cinque microlitri del volume di reazione del secondo ciclo.Eseguire a 120 volt su un gel di agarosio TAE al 1% contenente un colorante fluorescente per DNA attivabile con UV fino alla separazione delle bande. Quindi visualizzare le bande di 1,6 kb su un illuminatore a luce blu. Successivamente, eseguire il volume residuo della reazione di 45 microlitri su un gel di agarosio TAE al 1% contenente il colorante per DNA. Escidere le bande appropriate con una lama pulita e combinare tre reazioni positive per singolo individuo. Successivamente, estrarre il DNA dal frammento di gel utilizzando un kit di purificazione da gel e eluirlo in acqua priva di nucleasi. Congelare il prodotto a meno 20 gradi Celsius per un uso successivo. In questo procedimento, dopo aver amplificato la regione del lungo ripetitore terminale (LTR) e della regione terminale cinque prime UTR del plasmide MJ-quattro, visualizzare i prodotti PCR di 1,3 kb sull'illuminatore. Escidere gli ampliconi positivi, quindi purificarli e congelarli come descritto in precedenza. Successivamente, creare gli ampliconi fusi MJ-quattro LTR-gag mediante PCR di estensione con sovrapposizione degli estremi (splice overlap extension PCR). Visualizzare, escidere, purificare e congelare l'amplicone lungo di 3,2 kb. Ora digerire 1,5 microgrammi del plasmide MJ-quattro e 1,5 microgrammi del prodotto PCR purificato LTR-gag con l'endonucleasi di restrizione BCL-uno per 1,5 ore a 50 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere un microlitro di NGOM-quattro alla reazione di digestione e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopodiché, aggiungere il colorante di caricamento 5x alle reazioni di digestione. Eseguire lentamente l'elettroforesi del volume totale su un gel di agarosio 1%, TAE, contenente un colorante per DNA per una o due ore a 100 volt. Visualizzare, escidere e purificare le bande indicate per il clonaggio come descritto in precedenza.Successivamente, preparare le reazioni di ligazione utilizzando l'inserzione purificata LTR-gag e il DNA del vettore MJ-four in un rapporto di tre a uno tra inserzione e vettore. Incubare le reazioni di ligazione tutta la notte a quattro gradi Celsius.Quindi, trasformare batteri chimicamente competenti JM-109 con i prodotti di ligazione, distribuendoli su piastre di agar LB contenenti 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Far crescere i batteri trasformati a 30 gradi Celsius per almeno 22 ore. Per confermare la fedeltà del clonaggio, digerire il DNA ottenuto con mini prep con gli enzimi di restrizione NGOM-quattro e HPA-uno in una doppia digestione a 37 gradi Celsius per due ore.In seguito, analizzarlo su un gel di agarosio TAE al 1%. Calcolare il volume di virus necessario da ciascun ceppo in base al titolo in UI per microlitro ottenuto da un saggio su cellule TZM-BL, al fine di infettare cinque volte 10 alla quinta cellule GXR-25 a una multiplicità di infezione di 0,05. Assicurarsi di indossare l'adeguata protezione individuale per lavorare con HIV in grado di replicarsi, che comprende camice integrale, mascherina facciale e doppi guanti. Nel giorno dell'infezione, prelevare le scorte di virus dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelarle. Successivamente, diluire il virus in mezzo C-R-P-M-I fino a un volume di 100 microlitri, al fine di ottenere un MOI di 0,05. Aggiungerlo alla piastra a fondo v di coltura cellulare da 96 pozzetti, includendo in ogni serie di esperimenti di replicazione un controllo positivo e uno negativo, e predisporre la piastra in modo che ogni colonna alternata sia vuota per limitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. In seguito, contare le cellule GXR-25 mediante un contatore cellulare automatico e calcolare il numero totale di cellule necessarie per tutte le infezioni. Aliquotare il volume richiesto in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare per ottenere il pellet cellulare. Quindi aspirare con attenzione il mezzo e risospendere in C-R-P-M-I a una concentrazione di cinque volte 10 alla quinta cellule per 100 microlitri. Trasferire le cellule in un serbatoio sterile e mescolare accuratamente. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente il virus diluito e mescolare accuratamente. Dopodiché, aggiungere due microlitri di soluzione di polibrene a cinque milligrammi per millilitro in ogni pozzetto e mescolare accuratamente le cellule. Infine, incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari con 5%CO2 per tre ore.Per lavare le cellule infette, centrifugare la piastra a 96 pozzetti con fondo a V per formare il pellet cellulare. Rimuovere quindi con attenzione 150 microlitri di mezzo e sostituirli con 150 microlitri freschi di C-R-P-M-I senza disturbare il pellet cellulare. Ripetere la procedura altre due volte per lavare adeguatamente le cellule; dopo l'ultima centrifugazione e l'aggiunta di 150 microlitri di C-R-P-M-I, risospendere il pellet cellulare utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere la miscela di ogni pozzetto a 800 microlitri di C-R-P-M-I in un pozzetto di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti. Successivamente, posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari con 5% CO2 a 37 gradi Celsius. Ogni due giorni, trasferire 100 microlitri di sopranatante dalla superficie del pozzetto di coltura a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo e congelare per analisi successive mediante saggio RT. Quindi risospendere accuratamente le cellule e rimuovere metà del volume rimanente per prevenire una sovraproliferazione cellulare. Successivamente, ripristinare il volume originale aggiungendo 550 microlitri di C-R-P-M-I fresco a ciascun pozzetto.In questo procedimento, aggiungere da uno a due microlitri di DTTP a 10 millicurie per millilitro e quattro microlitri di DTT a un molarità a ciascuna aliquota da un millilitro della miscela maestra di RT. Mescolare accuratamente ogni tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente la miscela maestra di RT, DTT e DTTP con una pipetta da 1000 microlitri e trasferire in una vaschetta sterile.Successivamente, distribuire 25 microlitri di mix di RT marcato in ogni pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti con pareti sottili. Aggiungere 5 microlitri di ciascun sopranatante alla piastra PCR contenente il mix master di RT. Sigillare quindi la piastra PCR con un coperchio in foglio adesivo e incubare per due ore a 37 gradi Celsius in un termociclatore. Al termine dell'incubazione, praticare piccoli fori nel coperchio in foglio con una pipetta multicanale da 200 microlitri. Mescolare i campioni per cinque volte. Trasferire 5 microlitri di ciascun campione su carta DE-81 e lasciare asciugare tutti i campioni all'aria per 10 minuti. Posizionare le macchie in contenitori per lavaggio separati. Lavare successivamente le macchie cinque volte con SSC 1X. Successivamente, due volte con etanolo al 90% per cinque minuti per ogni lavaggio, prima di lasciarle asciugare all'aria. Una volta asciutte, avvolgere con cura la macchia in pellicola trasparente e esporla allo schermo fosforescente in una cassetta ermeticamente chiusa per tutta la notte a temperatura ambiente.Una volta pronti, analizzare gli schermi fosfo con un lettore di fosfori e quantificare i trascritti radioattivi.Mostrati qui sono immagini rappresentative di gel che illustrano la separazione elettroforetica dei diversi ampliconi PCR necessari per generare un amplicone gag derivato da paziente, clonabile nel plasmide con struttura portante MJ-four. Questa immagine rappresentativa di gel mostra la separazione elettroforetica dei digesti di restrizione per il clonaggio dei geni gag del paziente in MJ four.E questa immagine rappresentativa del gel mostra la separazione elettroforetica dei digesti ottenuti da un plasmide purificato di DNA chimerico gag MJ-quattro dopo digestione con enzimi di restrizione. Questo grafico illustra la riproducibilità del saggio di replicazione nel tempo nella linea cellulare GXR-25. Gli stessi virus chimerici gag MJ-quattro sono stati utilizzati per infettare le cellule GXR-25 in due esperimenti indipendenti eseguiti a distanza di circa un anno l'uno dall'altro.I punteggi di replicazione sono stati ottenuti calcolando la pendenza dei valori DLU sottoposti a trasformazione logaritmica e normalizzando tale pendenza rispetto al ceppo wild type MJ-four. Le due misurazioni indipendenti sono fortemente correlate e mettono in evidenza la riproducibilità dei saggi eseguiti in tempi diversi e con cellule a passaggi differenti. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'HIV AIDS per esplorare i determinanti virali della patogenesi, nell'infezione acuta del sottotipo C, il sottotipo più diffuso a livello mondiale. Lavorare con HIV dotato di capacità replicativa può essere estremamente pericoloso. Tutti i passaggi che coinvolgono il virus vivo devono essere eseguiti in un laboratorio di livello di sicurezza biologica due plus (BSL due plus). Tutte le superfici devono essere regolarmente decontaminate e devono essere indossati guanti doppi in ogni momento.

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