Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l' In vitro Replica Capacità di HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4 chimerici virus

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di incorporare i geni gag derivati da individui infetti da sottotipo CHIV one in un plasmide HIV one competente per la replicazione. Al fine di valutare l'effetto dei polimorfismi della sequenza gag sulla capacità di replicazione dell'HIV uno in vitro, ciò si ottiene amplificando prima il gene gag dal plasma del paziente. Il secondo passo consiste nel clonare la sequenza gag derivata dal paziente nel clone molecolare infettivo MJ four competente per la replicazione.

Successivamente, il plasmide chimera gag MJ four viene trasfettato al fine di generare stock virali infettivi e titolato per valutare l'infettività su una linea cellulare indicatrice. Il passo finale consiste nel misurare la capacità di replicazione in vitro nella linea di cellule T G XR 25. In definitiva, viene utilizzato un saggio di trascrittasi inversa radiomarcato per quantificare la produzione di virione nel tempo al fine di visualizzare la cinetica di replicazione virale.

Il metodo che descriveremo oggi può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'HIV. Questi includono la definizione dei determinanti dell'idoneità replicativa dell'HIV e la comprensione di come l'idoneità dell'HIV influenzi la patogenesi a lungo termine. A descrivere i metodi oggi saranno Jessica Prince e Dan Klaban, due dei miei studenti laureati.

Per iniziare questa procedura, trascrivere inversamente il CDNA dall'RNA e amplificare i primi prodotti di DNA utilizzando la trascrittasi inversa e una DNA polimerasi termostabile in una RT PCR in un solo passaggio. Quindi, utilizzando un microlitro del primo ciclo di amplificazione PCR come modello di DNA, eseguire un secondo ciclo di amplificazione PCR nidificato. Quindi, aggiungere tre microlitri di cinque x colorante di caricamento a cinque microlitri del volume di reazione del secondo round.

Eseguilo a 120 volt su un gel TAE all'1% contenente una colorazione di DNA fluorescente UV fino a quando le bande non si sono risolte. Quindi visualizza le bande da 1,6 KB su un illuminatore a luce blu. Successivamente, eseguire il restante volume di reazione di 45 microlitri su un gel TAE all'1% contenente la colorazione del DNA.

Accida le bande appropriate con una lama di rasoio pulita e combina tre reazioni positive per individuo. Successivamente estrarre il DNA dalla fetta di gel utilizzando un kit di purificazione in gel e immergerlo nell'acqua priva di nucleasi. Congelare il prodotto a meno 20 gradi Celsius per utilizzarlo successivamente in questa procedura.

Dopo aver amplificato il terminale lungo, ripetere cinque regioni UTR prime del plasmide MJ quattro. Visualizzare i prodotti PCR da 1,3 KB sull'illuminatore, asportare gli ampliconi positivi, quindi purificarli e congelarli come descritto in precedenza. Quindi, crea gli ampliconi gag MJ four LTR fusi tramite PCR di estensione di sovrapposizione di giunzione.

Visualizzare, asportare, purificare e congelare l'amplicone lungo 3,2 kb. Ora digerisci 1,5 microgrammi di plasmide MJ four e 1,5 microgrammi di prodotto purificato LTR gag PCR con endonucleasi di restrizione BCL one per 1,5 ore a 50 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere un microlitro di NGOM quattro alla reazione di digestione e incubarlo a 37 gradi Celsius per un'ora.

Successivamente, aggiungi cinque coloranti di carico alle reazioni di digestione della restrizione. Elettroforesi lenta del volume totale su un gel TAE all'1% di aros contenente una colorazione di DNA per una o due ore a 100 volt. Visualizzare, asportare e purificare le bande indicate per la clonazione come descritto in precedenza.

Successivamente, prepara le reazioni di legatura utilizzando il bavaglio LTR purificato. Inserire un DNA a quattro vettori MJ con un rapporto inserto/vettore di tre a uno. Incubare le reazioni di legatura durante la notte a quattro gradi Celsius.

Quindi trasformare JM 1 0 9 batteri chimicamente competenti con prodotti di legatura sparsi su piastre a coclea LB con 100 microgrammi per millilitro. L'ampicillina fa crescere batteri trasformati a 30 gradi Celsius per almeno 22 ore. Per confermare la fedeltà della clonazione, tagliare il DNA di mini preparazione con gli enzimi di restrizione NGO M four e HPA one in una doppia digestione a 37 gradi Celsius per due ore.

Successivamente, analizzalo su un 1%aros. Gel TAE. Calcolare il volume di virus necessario da ciascun ceppo in base al titolo UI per microlitro da un test di cellule TZM BL per infettare da cinque volte 10 al quinto G XR due cinque cellule con una molteplicità di infezione di 0,05.

Assicurati di indossare dispositivi di protezione individuale adeguati per lavorare con l'HIV competente per la replicazione, che include un camice completo, una maschera facciale e doppi guanti il giorno dell'infezione. Rimuovere le scorte di virus dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelare. Successivamente, diluire il virus in terreni C-R-P-M-I a un volume di 100 microlitri.

Per ottenere un MOI di 0,05, aggiungerlo alla piastra da 96 pozzetti trattata con coltura tissutale vbo, includendo sia un controllo positivo che uno negativo in ogni serie di esperimenti di replicazione e impostare la piastra in modo che ogni altra colonna sia vuota per limitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. Successivamente, conta le due cinque cellule GXR utilizzando un contatore di cellule automatizzato e calcola il numero di cellule necessarie in totale per tutte le infezioni. Aliquotare il volume richiesto in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugare per pellettare le cellule.

Quindi aspirare attentamente il terreno e risospendere in C-R-P-M-I a una concentrazione di cinque volte 10-5 cellule per 100 microlitri, pipettare le cellule in un trogolo sterile e mescolare accuratamente. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti contenente il virus diluito e miscelare accuratamente. Successivamente, aggiungi due microlitri di cinque milligrammi per millilitro di soluzione di poli cervello a ciascun pozzetto e mescola accuratamente le cellule.

Quindi incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale con il 5% di CO2 per tre ore al fine di lavare la centrifuga delle cellule infette. La piastra inferiore a V a 96 pozzetti per pellettare le cellule. Quindi rimuovere con cura 150 microlitri di terreno e sostituirlo con 150 microlitri freschi di C-R-P-M-I senza disturbare il pellet cellulare.

Ripetere la procedura altre due volte per lavare sufficientemente le cellule dopo l'ultima centrifugazione e l'aggiunta di 150 microlitri di C-R-P-M-I risospendere il pellet cellulare con una pipetta multicanale. Aggiungere la miscela di ciascun pozzetto a 800 microlitri di C-R-P-M-I in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti. Quindi posizionare la piastra in un incubatore per colture tissutali al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius ogni due giorni.

Trasferire 100 microlitri di surnatante dalla superficie del pozzetto di coltura a un pozzetto di una piastra inferiore da 96 pozzetti e congelare per la successiva analisi utilizzando il saggio RT, quindi risospendere accuratamente le cellule e rimuovere metà del volume rimanente per prevenire la crescita eccessiva delle cellule. Dopodiché, ripristinare il volume originale aggiungendo 550 microlitri di C-R-P-M-I fresco a ciascun pozzetto in questa procedura, aggiungere da uno a due microlitri di 10 millicurie per millilitro di DTTP e quattro microlitri di un molare DIO tre etolo a ciascun millilitro di aliquota del nostro master mix. Miscelare accuratamente ciascuna provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri di RT master mix DTT e DTTP con una pipetta da 1000 microlitri e trasferirla in una mangiatoia sterile.

Quindi erogare 25 microlitri di RT etichettato. Mescolare in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti a parete sottile. Aggiungere cinque microlitri di ciascun surnatante alla piastra PCR contenente la miscela master RT. Quindi sigillare la piastra PCR con un coperchio di alluminio adesivo e incubare per due ore a 37 gradi Celsius in un termociclatore dopo l'incubazione, praticare piccoli fori nel coperchio di alluminio utilizzando una pipetta multicanale da 200 microlitri.

Mescola i campioni cinque volte. Trasferire cinque microlitri di ciascun campione su carta DE 81 e lasciare asciugare tutti i campioni all'aria per 10 minuti. Metti le macchie in contenitori di lavaggio separati.

Successivamente lavare le macchie cinque volte con un XSSC. Quindi due volte con etanolo al 90% per cinque minuti per lavaggio prima di lasciarli asciugare all'aria. Una volta asciutto, avvolgere con cura la macchia in un involucro Saran ed esporla allo schermo fosfofatico in una cassetta ermeticamente sigillata per una notte a temperatura ambiente.

Una volta pronti, analizza gli schermi fosfoattivi con un imager fosfometrico e quantifica i trascritti radioattivi. Mostrato. Ecco le immagini rappresentative del gel che raffigurano la separazione elettroforetica dei vari ampliconi PCR necessari per generare un amplicone gag derivato dal paziente in grado di essere clonato nella spina dorsale del plasmide MJ four. Questa immagine rappresentativa del gel raffigura la separazione elettroforetica dei digest di restrizione per la clonazione dei geni gag del paziente in MJ four.

E questa immagine rappresentativa del gel raffigura la separazione elettroforetica dei digesti di restrizione un DNA plasmidico purificato MJ a quattro chimere. Questo grafico mostra la riproducibilità del saggio di replicazione nel tempo nella linea cellulare G XR two five. Gli stessi virus chimerici MJ quattro gag sono stati utilizzati per infettare G XR due cinque cellule in due esperimenti indipendenti eseguiti a circa un anno di distanza.

I punteggi di replicazione sono stati generati calcolando la pendenza dei valori DLU trasformati in log e normalizzando tale pendenza a MJ four di tipo selvaggio. Le due misure indipendenti sono fortemente correlate ed evidenziano la riproducibilità di saggi eseguiti in tempi diversi e con cellule in passaggi diversi. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'HIV AIDS per esplorare i determinanti virali della patogenesi.

Nell'infezione acuta da sottotipo C, il sottotipo più diffuso in tutto il mondo. Lavorare con l'HIV competente per la replicazione può essere estremamente pericoloso. Tutte le fasi che coinvolgono il virus vivo devono essere eseguite in una struttura BSL two plus.

Tutte le superfici devono essere regolarmente decontaminate e devono essere indossati sempre doppi guanti.