Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l'

L'obiettivo generale di questa procedura è inserire geni gag derivati da individui infetti da HIV1 sottotipo C in un plasmide HIV1 con capacità replicativa, al fine di valutare l'effetto delle polimorfismi della sequenza gag sulla capacità replicativa dell'HIV1 in vitro. Questo viene ottenuto innanzitutto amplificando il gene gag dal plasma del paziente. Il secondo passaggio consiste nel clonare la sequenza gag derivata dal paziente nel clone molecolare infettivo con capacità replicativa MJ-four. Successivamente, il plasmide quimera gag-MJ-four viene trasfettato per generare ceppi virali infettivi e titolati per valutare l'infettività su una linea cellulare indicatore. L'ultimo passaggio prevede la misurazione della capacità replicativa in vitro nella linea cellulare T GXR-25. Infine, un saggio di trascrittasi inversa marcata radioattivamente viene utilizzato per quantificare la produzione di virioni nel tempo al fine di visualizzare la cinetica della replicazione virale.

Il metodo che descriveremo oggi può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'HIV. Tra queste, definire i determinanti della capacità replicativa dell'HIV e comprendere come la fitness dell'HIV influisca sulla patogenesi a lungo termine. La descrizione dei metodi sarà effettuata oggi da Jessica Prince e Dan Claiborne, due dei miei studenti universitari.

Per iniziare questa procedura, effettuare la trascrizione inversa del cDNA dall'RNA e amplificare i prodotti di DNA del primo ciclo utilizzando la trascrittasi inversa e una DNA polimerasi termo-stabile in una reazione RT-PCR in un unico passaggio. Successivamente, utilizzando un microlitro dell'amplificazione PCR del primo ciclo come stampo di DNA, eseguire un'amplificazione PCR nested di secondo ciclo. Quindi, aggiungere tre microlitri di colorante di carico 5X a cinque microlitri del volume di reazione del secondo ciclo.

Eseguire a 120 volt su un gel di agarosio TAE al 1% contenente un colorante fluorescente per DNA attivabile con UV fino alla separazione delle bande. Quindi visualizzare le bande di 1,6 kb su un illuminatore a luce blu. Successivamente, eseguire il volume residuo della reazione di 45 microlitri su un gel di agarosio TAE al 1% contenente il colorante per DNA. Escidere le bande appropriate con una lama pulita e combinare tre reazioni positive per singolo individuo. Successivamente, estrarre il DNA dal frammento di gel utilizzando un kit di purificazione da gel e eluirlo in acqua priva di nucleasi. Congelare il prodotto a meno 20 gradi Celsius per un uso successivo. In questo procedimento, dopo aver amplificato la regione del lungo ripetitore terminale (LTR) e della regione terminale cinque prime UTR del plasmide MJ-quattro, visualizzare i prodotti PCR di 1,3 kb sull'illuminatore. Escidere gli ampliconi positivi, quindi purificarli e congelarli come descritto in precedenza. Successivamente, creare gli ampliconi fusi MJ-quattro LTR-gag mediante PCR di estensione con sovrapposizione degli estremi (splice overlap extension PCR). Visualizzare, escidere, purificare e congelare l'amplicone lungo di 3,2 kb. Ora digerire 1,5 microgrammi del plasmide MJ-quattro e 1,5 microgrammi del prodotto PCR purificato LTR-gag con l'endonucleasi di restrizione BCL-uno per 1,5 ore a 50 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere un microlitro di NGOM-quattro alla reazione di digestione e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopodiché, aggiungere il colorante di caricamento 5x alle reazioni di digestione. Eseguire lentamente l'elettroforesi del volume totale su un gel di agarosio 1%, TAE, contenente un colorante per DNA per una o due ore a 100 volt. Visualizzare, escidere e purificare le bande indicate per il clonaggio come descritto in precedenza.

Successivamente, preparare le reazioni di ligazione utilizzando l'inserzione purificata LTR-gag e il DNA del vettore MJ-four in un rapporto di tre a uno tra inserzione e vettore. Incubare le reazioni di ligazione tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Quindi, trasformare batteri chimicamente competenti JM-109 con i prodotti di ligazione, distribuendoli su piastre di agar LB contenenti 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Far crescere i batteri trasformati a 30 gradi Celsius per almeno 22 ore. Per confermare la fedeltà del clonaggio, digerire il DNA ottenuto con mini prep con gli enzimi di restrizione NGOM-quattro e HPA-uno in una doppia digestione a 37 gradi Celsius per due ore.

In seguito, analizzarlo su un gel di agarosio TAE al 1%. Calcolare il volume di virus necessario da ciascun ceppo in base al titolo in UI per microlitro ottenuto da un saggio su cellule TZM-BL, al fine di infettare cinque volte 10 alla quinta cellule GXR-25 a una multiplicità di infezione di 0,05. Assicurarsi di indossare l'adeguata protezione individuale per lavorare con HIV in grado di replicarsi, che comprende camice integrale, mascherina facciale e doppi guanti. Nel giorno dell'infezione, prelevare le scorte di virus dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelarle. Successivamente, diluire il virus in mezzo C-R-P-M-I fino a un volume di 100 microlitri, al fine di ottenere un MOI di 0,05. Aggiungerlo alla piastra a fondo v di coltura cellulare da 96 pozzetti, includendo in ogni serie di esperimenti di replicazione un controllo positivo e uno negativo, e predisporre la piastra in modo che ogni colonna alternata sia vuota per limitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. In seguito, contare le cellule GXR-25 mediante un contatore cellulare automatico e calcolare il numero totale di cellule necessarie per tutte le infezioni. Aliquotare il volume richiesto in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare per ottenere il pellet cellulare. Quindi aspirare con attenzione il mezzo e risospendere in C-R-P-M-I a una concentrazione di cinque volte 10 alla quinta cellule per 100 microlitri. Trasferire le cellule in un serbatoio sterile e mescolare accuratamente. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente il virus diluito e mescolare accuratamente. Dopodiché, aggiungere due microlitri di soluzione di polibrene a cinque milligrammi per millilitro in ogni pozzetto e mescolare accuratamente le cellule. Infine, incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari con 5%CO2 per tre ore.

Per lavare le cellule infette, centrifugare la piastra a 96 pozzetti con fondo a V per formare il pellet cellulare. Rimuovere quindi con attenzione 150 microlitri di mezzo e sostituirli con 150 microlitri freschi di C-R-P-M-I senza disturbare il pellet cellulare. Ripetere la procedura altre due volte per lavare adeguatamente le cellule; dopo l'ultima centrifugazione e l'aggiunta di 150 microlitri di C-R-P-M-I, risospendere il pellet cellulare utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere la miscela di ogni pozzetto a 800 microlitri di C-R-P-M-I in un pozzetto di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti. Successivamente, posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari con 5% CO2 a 37 gradi Celsius. Ogni due giorni, trasferire 100 microlitri di sopranatante dalla superficie del pozzetto di coltura a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo e congelare per analisi successive mediante saggio RT. Quindi risospendere accuratamente le cellule e rimuovere metà del volume rimanente per prevenire una sovraproliferazione cellulare. Successivamente, ripristinare il volume originale aggiungendo 550 microlitri di C-R-P-M-I fresco a ciascun pozzetto.

In questo procedimento, aggiungere da uno a due microlitri di DTTP a 10 millicurie per millilitro e quattro microlitri di DTT a un molarità a ciascuna aliquota da un millilitro della miscela maestra di RT. Mescolare accuratamente ogni tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente la miscela maestra di RT, DTT e DTTP con una pipetta da 1000 microlitri e trasferire in una vaschetta sterile.

Successivamente, distribuire 25 microlitri di mix di RT marcato in ogni pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti con pareti sottili. Aggiungere 5 microlitri di ciascun sopranatante alla piastra PCR contenente il mix master di RT. Sigillare quindi la piastra PCR con un coperchio in foglio adesivo e incubare per due ore a 37 gradi Celsius in un termociclatore. Al termine dell'incubazione, praticare piccoli fori nel coperchio in foglio con una pipetta multicanale da 200 microlitri. Mescolare i campioni per cinque volte. Trasferire 5 microlitri di ciascun campione su carta DE-81 e lasciare asciugare tutti i campioni all'aria per 10 minuti. Posizionare le macchie in contenitori per lavaggio separati. Lavare successivamente le macchie cinque volte con SSC 1X. Successivamente, due volte con etanolo al 90% per cinque minuti per ogni lavaggio, prima di lasciarle asciugare all'aria. Una volta asciutte, avvolgere con cura la macchia in pellicola trasparente e esporla allo schermo fosforescente in una cassetta ermeticamente chiusa per tutta la notte a temperatura ambiente.

Una volta pronti, analizzare gli schermi fosfo con un lettore di fosfori e quantificare i trascritti radioattivi.

Mostrati qui sono immagini rappresentative di gel che illustrano la separazione elettroforetica dei diversi ampliconi PCR necessari per generare un amplicone gag derivato da paziente, clonabile nel plasmide con struttura portante MJ-four. Questa immagine rappresentativa di gel mostra la separazione elettroforetica dei digesti di restrizione per il clonaggio dei geni gag del paziente in MJ four.

E questa immagine rappresentativa del gel mostra la separazione elettroforetica dei digesti ottenuti da un plasmide purificato di DNA chimerico gag MJ-quattro dopo digestione con enzimi di restrizione. Questo grafico illustra la riproducibilità del saggio di replicazione nel tempo nella linea cellulare GXR-25. Gli stessi virus chimerici gag MJ-quattro sono stati utilizzati per infettare le cellule GXR-25 in due esperimenti indipendenti eseguiti a distanza di circa un anno l'uno dall'altro.

I punteggi di replicazione sono stati ottenuti calcolando la pendenza dei valori DLU sottoposti a trasformazione logaritmica e normalizzando tale pendenza rispetto al ceppo wild type MJ-four. Le due misurazioni indipendenti sono fortemente correlate e mettono in evidenza la riproducibilità dei saggi eseguiti in tempi diversi e con cellule a passaggi differenti. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'HIV AIDS per esplorare i determinanti virali della patogenesi, nell'infezione acuta del sottotipo C, il sottotipo più diffuso a livello mondiale. Lavorare con HIV dotato di capacità replicativa può essere estremamente pericoloso. Tutti i passaggi che coinvolgono il virus vivo devono essere eseguiti in un laboratorio di livello di sicurezza biologica due plus (BSL due plus). Tutte le superfici devono essere regolarmente decontaminate e devono essere indossati guanti doppi in ogni momento.