Name: In vitro delle cellule Cultura modello per Tossico per inalazione Chemical Testing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-08T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Scopri un modello di coltura cellulare in vitro per testare la tossicità dei gas inalati. Questo metodo utilizza cardiomiociti di ratto e cellule epiteliali umane per studiare gli effetti del cloro su cuore e polmoni.

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Questa ricerca è sostenuta dal Programma CounterACT, National Institutes of Health (NIH), Ufficio del Direttore, e l&#39;Istituto Nazionale delle Scienze di Salute ambientale (NIEHS) Sovvenzione Numero U54 ES015678 (CWW). SA è supportato anche da ospedale per bambini Colorado / Colorado School of Mines collaborazione Pilot Award # G0100394 e Ospedale Pediatrico Colorado Research Institue Pilot Award # G0100471.

1. Culture Rat cardiomiociti <ol><li> Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale, IACUC. </li><li> Ottenere cardiomiociti di ratto dal cuore (ventricoli) di ratti maschi (240-260 g) utilizzando metodi descritti in precedenza 4. Brevemente, anestetizzare animali con una iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100 mg / kg; confermare anestesia metodo pizzico piedi) e quindi rimuovere cuori in 10,0 ml, Ca 2 + contenente tampone Krebs Ringer, pH 7,4 1 mM. </li><li> Sciacquare i cuori 5-6x per rimuovere il sangue e poi passare a un buffer di Ca 2 + libero Krebs Ringer contenente 0,02% della proteasi e 0,06% collagenasi A (5.0 ml / cuore). Incubare i cuori in questa soluzione per 10-15 minuti a 37 ° C con agitazione intermittente. </li><li> Dopo 10-15 minuti, lavare la soluzione enzimatica con tampone di Ca 2 + libero Krebs Ringer per un ulteriore 5 min. Rilasciare le cellule dal tessuto flaccido noizione di una pipetta 25 ml pipettando sospensione su e giù parecchie volte. </li><li> Separare le cellule dal tessuto per filtrazione attraverso una rete di nylon 70 micron e permettono loro di stabilirsi in tampone Krebs Ringer contenente 0,1 mM Ca 2 +. Sospendere il pellet di cellule in 1,0 ml di tampone Krebs Ringer contenente 0,2 mM Ca 2 +. </li><li> Strato con cautela over 5,0 ml 60 mg / ml di albumina sierica bovina, BSA, in 15 ml provette per centrifuga per separare cardiomiociti da nonmyocytes e permettere loro di accontentarsi di 30 min. I cardiomiociti sono più pesanti e si portano sul fondo della provetta. Rimuovere accuratamente le cellule surnatante e dei media. Ripetere questo passaggio una volta per purificare ulteriormente le cellule. </li><li> A poco a poco la transizione da lavare (in gradini con 0,25 mm, 0,5 mm 0,75 mm e 1,0 mM Ca 2 + contenente tampone) le ventricolari miociti / cardiomiociti a 1,0 mM Ca 2 + contenente tampone e risospeso in mezzo ACCT composto da Dulbecco Modified Eagle Medium , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-carnitina, creatina 5 mM, taurina 5 mM, 100 IU / ml di penicillina, e 100 pg / ml streptomicina. </li><li> Piastra cardiomiociti in ACCT mezzo ad una densità da 100 a 150 cellule / mm 2 sul 100 o 35 mm laminina capsule di Petri di plastica o 40 x 22 mm coprioggetto di vetro rivestiti con laminina (1 mg / cm 2) rivestite. Dopo 1 ora, lavare i piatti con 2,0 ml ACCT per rimuovere le cellule che non sono collegati. Aggiungere 10,0 ml di mezzo fresco e incubare le cellule. </li></ol> 2. Differenziata aria-liquido Interface (ALI) La cultura di cellule umane Airway epiteliali basali <ol><li> Procurarsi tessuti tracheobronchiale umani da National Disease Research Interchange sotto Institutional Review Board protocolli approvati. La raccolta delle cellule ed eseguire cultura utilizzando una procedura 5,6 pubblicata. Questa procedura utilizza colture di cellule in quanto sono un preciso modello per le esposizioni inalatorie umana verso TIC, tuttavia, se necessario, si può isolare e crescere a mo ALIutilizzare e / o cellule epiteliali delle vie aeree di ratto 7,8. </li><li> In breve, fare piccoli pezzi (~ ¼ pollice) del tessuto dopo aver rimosso tutti i nodi del tessuto connettivo e linfonodi. Lavare il tessuto più volte in soluzione di Ringer lattato. Aggiungere tessuti in una provetta da 50 ml e aggiungere la soluzione di proteasi (1% Protease/0.01% DNasi in terreno minimo essenziale, MEM, tessuto a rapporto fluido (1,10)). </li><li> Muovere il tessuto a 4 ° C per tutta la notte. Terminare la dissociazione del tessuto con l&#39;aggiunta di siero bovino fetale al 10%. Raschiare la superficie epiteliale con un bisturi chirurgico e raccogliere le cellule per centrifugazione (2000 rpm per 10 min). </li><li> Cellule piastra a passaggio uno snapwells collagene rivestite in mezzo speciale ALI preparati come descritto in dettaglio da Fulcher et al 9. Culture per 5 giorni prima di cambiare all&#39;interfaccia aria-liquido (ALI) rimuovendo i media apicali. </li><li> Nutrire le cellule utilizzando mezzi ALI ogni giorno si alternano e permettono alle cellule di differenziarsi per ulteriori 2-3 settimane (osservare numerose ciglia battitura e secrezione di muco) prima di eseguire le esposizioni. Lavare la superficie apicale con il caldo PBS con i cambiamenti dei media. </li></ol> 3. Cloro esposizione <ol><li> Contenere il sistema di esposizione cloro (CES) all&#39;interno di una cappa chimica qualificato con velocità frontale operativa di 100 fpm che fornisce il contenimento secondario necessaria per evitare l&#39;esposizione del personale in caso di perdite accidentali di cloro. </li><li> Utilizzare il sistema sotto una leggera pressione positiva (0,5 pollici di acqua). Aria secca viene alimentata a 15 L / min e un adeguato livello di cloro viene alimentato per raggiungere la concentrazione di cloro finale desiderata. Le camere hanno un coperchio di chiusura con 4 mini serrature BCU e un basso durometro guarnizione siliconica per realizzare la tenuta a pressione. </li><li> Consegnare la miscela Cl 2 attraverso un controller di portata massica. Il CES utilizza una bombola di gas compresso contenente 1,0% Cl 2 in azoto secco. </li><li> Regolare il flusso d&#39;aria di diluizione con l&#39;progettato su misura del pannello di controllo e, analogamente, regolare la concentrazione di Cl 2 consegnato alle camere di esposizione. Una pompa di campionamento a volume basso tira scarico dalle camere in un analizzatore di cloro per monitorare le concentrazioni che vengono poi registrati su un registratore di dati collegato all&#39;analizzatore. </li><li> Misurare le portate all&#39;interno delle camere di prima dell&#39;esposizione utilizzando un misuratore di flusso per assicurare parità di tassi di consegna e di scarico. </li><li> Preparare le colture cellulari per l&#39;esposizione rimuovendo il materiale surnatante e l&#39;aggiunta di mezzi freschi (supporti basolaterali nelle culture ALI). Tutti i pretrattamenti con agenti potrebbero essere eseguite in questo momento. </li><li> Esporre le colture ALI di cellule epiteliali delle vie aeree a Cl 2 gas (50, 100, o 300 ppm per 30 min) nelle due camere polisulfone biocontenimento sigillati. I cardiomiociti (immersi o culture sulle membrane confluente) sono esposti per 50 o 100 ppm Cl 2 per 15 min. </li><li> Dopo l&#39;esposizione irrigare le camere con aria fino alla Cl 2 livello scende al di sotto di 1 ppm e può essere aperta in modo sicuro per rimuovere le cellule (entro 5 minuti). </li></ol> 4. Transepiteliale resistenza elettrica (TER) Misura <ol><li> Misurare il TER di aria-liquido-interfaccia, ALI, culture usando un voltohmmeter epiteliale con un paio di argento cloruro elettrodi &quot;bacchette&quot;. </li><li> Equilibrare l&#39;elettrodo bacchette nel ALI mezzi 15 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Aggiungi mezzi di caldo al apicale (1,0 ml) e basolaterale (2,0 ml) di superficie e misurare la TER utilizzando gli elettrodi bacchette del voltohmmeter. </li><li> Immergere il braccio più corto del elettrodo in apicali e il braccio più lungo nei media basolaterale. Fare clic sul pulsante &#39;misura&#39; sul voltohmmeter per valutare la resistenza elettrica. </li><li> Il voltohmmeter ha la possibilità di misurare ohm o ohm k. Sottrarre la resistenza attraverso un supporto di coltura privo di cellule dalla resistenza misurata su ogni strato di cellule a cedere il transresistenza epiteliale (TER). </li></ol> 5. Caspase misura <ol><li> Aggiungere mezzi freschi ALI (2,0 ml) alla superficie basolaterale post esposizione e incubare la cella a temperatura ambiente. Raccogliere i media surnatante a 4 e 24 ore. </li><li> Misurare caspasi 3/7 attività nei surnatanti Media mediante una caspasi commerciale 3/7 kit di analisi. </li></ol> 6. Western Blot e Immunocytochemistry <ol><li> Eseguire western blot utilizzando lisati cellulari come descritto in precedenza 10. Sospendere il lisato proteico (20 mg) a 5x tampone campione ridotto e far bollire per 5 min. Sottoporre il lisato proteico di SDS-PAGE (4-15%) e trasferire le proteine ​​separate da una membrana di nitrocellulosa blotting elettroforetico. </li><li> Bloccare il legame non specifico incubando la membrana con 5% di latte in tampone di lavaggio (PBS + 0,1% di detergente) e sondare le membrane con anticorpi primari contro SERCA2 o actina sarcomerica a 1:1000 diluizione, overnight a 4 ° C. Avanti, lavare e incubare le membrane con i rispettivi anticorpi secondari coniugati con perossidasi e sviluppare per il rilevamento come descritto in precedenza 10 utilizzando kit per il rilevamento perossidasi commerciale. </li><li> Per immunocitochimica trattano cellule vive coltivate su inserti o vetrini in piastre da 6 pozzetti con 0,4% Triton-X-100 in 10 mM tampone citrato di sodio per 20 minuti dopo risciacquo con PBS. </li><li> Blocco legame non specifico trattando le cellule con siero asino 5% per 20 minuti, e poi incubare le cellule con IgG non specifiche o di singoli anticorpi primari specifici per actina sarcomerica o Ki-67. </li><li> Lavare le cellule con PBS e incubare con anticorpi secondari coniugati fluorescenti per rilevare l&#39;anticorpo primario e un colorante nucleare (1 mg / ml DAPI). </li><li> Lavare con PBS e montare coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio commerciali. </li><li> Visualizza la colorazione utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li></ol>

<ol><li>Mohan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+accidental+exposure+to+chlorine+gas%3A+clinical+presentation%2C+pulmonary+functions+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Chest+Dis+Allied+Sci%22%5BJournal%5D)">Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes.</a> Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).</li>
<li>Kose, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction%2C+acute+ischemic+stroke%2C+and+hyperglycemia+triggered+by+acute+chlorine+gas+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation.</a> Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).</li>
<li>Das, R., Blanc, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+gas+exposure+and+the+lung%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Ind+Health%22%5BJournal%5D)">Chlorine gas exposure and the lung: a review.</a> Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).</li>
<li>Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+the+terminally+differentiated+adult+cardiac+muscle+cell%3A+a+light+and+scanning+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study.</a> Dev Biol. 80, 466-482 (1980).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+suppresses+sarcoplasmic%2Fendoplasmic+reticulum+Ca2%2B-ATPase+expression+in+cystic+fibrosis+airways%3A+role+in+oxidant-mediated+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death.</a> Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+signals+airway+epithelial+basal+cell+survival+via+coagulation+and+protease-activated+receptor+isoforms+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).</li>
<li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+respiratory+epithelial+cells+and+exposure+to+experimental+cigarette+smoke+at+air+liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+tracheal+basal+cells+to+ciliated+cells+and+tissue+reconstruction+on+the+synthesized+basement+membrane+substratum+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro.</a> Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).</li>
<li>Fulcher, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Med. , 107-183 (2005).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCA2+regulates+non-CF+and+CF+airway+epithelial+cell+response+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone.</a> PloS One. 6, e10(2011).</li>
<li>Martin, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine-induced+injury+to+the+airways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Chlorine-induced injury to the airways in mice.</a> Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).</li>
<li>Evans, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Lung%22%5BJournal%5D)">Chlorine: state of the art.</a> Lung. 183, 151-167 (2005).</li>
<li>Vliet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+reactive+nitrogen+species+during+peroxidase-catalyzed+oxidation+of+nitrite.+A+potential+additional+mechanism+of+nitric+oxide-dependent+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity.</a> J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cells+release+ATP+during+ozone+exposure%3A+signaling+for+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival.</a> Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).</li>
<li>Allen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+exposure+of+cultured+cells+and+other+materials+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Inhal+Toxicol%22%5BJournal%5D)">An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone.</a> Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il tipo più comune di esposizioni tossiche acuta si verifica quando si respira una sostanza chimica velenosa nei polmoni. Queste sostanze chimiche possono anche essere rapidamente assorbiti nel flusso sanguigno e possono influenzare altri organi come il cervello e il cuore. Tossicità per inalazione di vari agenti utilizzando modelli animali è stata studiata e riportata ampiamente, ma i meccanismi sono meno conosciuti. Questo è un grande ostacolo nello sviluppo di terapie efficaci. Assenza di sistemi di esposizione i...

Esposizione a sostanze chimiche tossiche inalatoria (tic) / gas come cloro (Cl 2) rimane un problema sanitario in corso in esposizioni accidentali che nel loro uso potenziale come agente minaccia chimica. Anche se i polmoni sono l&#39;obiettivo primario, organi come cuore e cervello sono anche colpiti 1-3. Modelli in vivo sono generalmente utilizzati per la tossicità di test da tic, ma in vitro per la valutazione della tossicità sono più semplici, più veloci e più conveniente. In modelli in vitro consentono anche vasto studio delle interazioni agente-cellulari che possono essere difficili da valutare in vivo. Tali sistemi di esposizione in vitro sono rari e inoltre, in alcuni modelli convenzionali dove gli agenti tossici vengono aggiunti al mezzo di coltura in cui le cellule sono sommersi, le proprietà degli agenti possono cambiare a causa di interazioni di legame e dai componenti del mezzo. In tali scenari sistemi di coltura cellulari come interfaccia aria-liquido (ALI) colture di cellule primarie umane epiteliali delle vie aeree, qui proposte, che possono essere direttamente esposti ad agenti gassosi potrebbero essere promettenti. Cellule epiteliali che rivestono le vie respiratorie sono le prime linee di difesa contro le sostanze chimiche tossiche inalate. L&#39;epitelio delle vie aeree umano forma una barriera fisica tra il lume e le celle sottostanti nel polmone e partecipa alla risposta del polmone. Si produce una serie di citochine e altri agenti pro e anti-infiammatori e secerne muco liquido superficie / vie aeree (ASL) che copre l&#39;epitelio. Una delle limitazioni nella convenzionale sommerso in sistemi di coltura in vitro è anche che l&#39;ASL e muco che copre la superficie epiteliale viene rimosso o diluite. Questo non riflette lo stato fisiologico delle cellule epiteliali del polmone che sono esposte all&#39;aria. Così, un sistema ideale in vitro per test di tossicità TIC dovrebbe replicare questa architettura. C&#39;è grande interesse per lo sviluppo rapido di screening metodi che predicono tossicità vivo. Le cellule epiteliali coltivate nella ALI differenziare e hanno strutture e funzioni ben differenziati rispetto alle cellule coltivate sommerse e servire un modello superiore delle vie respiratorie. In questo studio, descriviamo l&#39;uso della cultura aria-liquido-interfaccia vie respiratorie umane (tracheobronchiale), le cellule epiteliali per testare la tossicità velenoso gas inalato e lo confrontiamo con una cultura di cellule sommerso di cardiomiociti, quindi studiando un altro obiettivo importante di tossicità.

<table><tbody><tr><td>Ratti</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Sprague-Dawley&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>cloro</td><td>AirGas, Inc</td><td>X02NI99CP163LS1</td><td></td></tr><tr><td>kit caspasi 3/7</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>Voltohmmetro epiteliale ed elettrodo a bacchetta</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM e STX2</td><td></td></tr><tr><td>Inserti Snapwell</td><td>Corning</td><td>07-200-708</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare in nylon da 70 micron</td><td>Corning</td><td>#352360</td><td></td></tr><tr><td>Camere di biocontenimento in polisulfone&nbsp;</td><td>BCU, Allentown Cage Equipment</td><td>BCU</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo actina sarcomerico</td><td>Abcam Cambridge, MA</td><td>ab28052</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo SERCA2</td><td>Bioreagenti di affinità, Golden, CO</td><td>MA3-9191</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Ki-67</td><td>Dako, Carpinteria, CA</td><td>M7248</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario coniugato Alexa 488</td><td>Invitrogen, Grand Island, NY</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Carnitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Creatinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6257</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Ringer Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4002</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DNAasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ringer lattato</td><td>Abott Laboratories</td><td>7953</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Fisher Scientific</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>4-15% gel SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocellulosica</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Dergent, Tween&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rilevamento della perossidasi</td><td>Pierce</td><td>3402</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di montaggio, Fluormount G</td><td>eBiosciences</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Collagene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD biosciences</td><td>354259</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>200-6140AJ</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro delle cellule cultura modello per tossico per inalazione chemical testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Le colture cellulari sono indispensabili per sviluppare e studiare l&#39;efficacia di agenti terapeutici, prima del loro utilizzo in modelli animali. Abbiamo la capacità unica di modellare cellule dell&#39;epitelio delle vie respiratorie umane e del muscolo cardiaco ben differenziate. Questo potrebbe essere uno strumento prezioso per studiare gli effetti deleteri delle sostanze chimiche tossiche per via inalatoria, come il cloro, che può normalmente interagire con le superfici delle cellule e formare vari sottoprodotti su reagendo con l&#39;acqua, e limitare i loro effetti nelle culture sommerse. Il nostro modello utilizzando colture di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane ben differenziati a interfaccia aria-liqiuid aggira questa limitazione, nonché offre la possibilità di valutare i meccanismi critici di tossicità delle sostanze chimiche potenzialmente tossiche per via inalatoria. Descriviamo una maggiore perdita dell&#39;integrità della membrana, il rilascio caspasi e morte su tossica chimica per via inalatoria come l&#39;esposizione al cloro. In questo articolo, vi proponiamo i metodi per modellare l&#39;esposizione cloro nel cuore dei mammiferi e delle vie respiratorie epiteliale cells di cultura e di semplici test per valutare il suo effetto su questi tipi di cellule.

Cardiomiociti forma di bastoncello primaria attaccano su matrici laminina e si diffondono e si differenziano in colture confluenti (Figure 1A e il suo inserto). Queste cellule sono state ulteriormente caratterizzate in base actina sarcomerica ed espressione SERCA2 (Figure 1B e 1C). Cardiomiociti di ratto sono molto sensibili alla tossicità del cloro come 15 minuti di esposizione a 100 ppm di cloro causato ingenti arrotondamento e morte cellulare nelle culture sommerse e...

Questo protocollo è progettato per dimostrare metodo di esposizione di colture cellulari a sostanze chimiche tossiche inalate. Esposizione di differenziata interfaccia aria-liquido (ALI) colture di cellule epiteliali delle vie aeree fornisce un modello unico di esposizione vie aeree per gas tossici quali cloro. In questo manoscritto descriviamo effetto dell&#39;esposizione cloro su colture di interfaccia aria-liquido di cellule epiteliali e coltura sommersa di cardiomiociti. Sistemi di esposizione in vitro consentono importanti studi meccanicistici per valutare percorsi che possono poi essere utilizzati per sviluppare nuovi agenti terapeutici.

In vitro delle cellule Cultura modello per Tossico per inalazione Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'effetto dell'esposizione al cloro in modelli di colture cellulari in vitro di polmone, vie aeree e cuore. Questo viene raggiunto innanzitutto coltivando cardiomiociti di ratto o cellule epiteliali delle vie aeree umane. Le colture di cardiomiociti di ratto verranno esposte a gas cloro per valutare la tossicità del cloro su organi vitali come il cuore, mentre l'esposizione di colture differenziate di cellule epiteliali delle vie aeree umane al cloro consente una modellizzazione più accurata dell'esposizione umana a gas tossici.In definitiva, il rilascio della caspasi 3/7 e la resistenza elettrica transepiteliale possono essere misurati per determinare rispettivamente la morte cellulare apoptotica dei cardiomiociti e la rottura della membrana e la morte cellulare dei cellule epiteliali delle vie aeree umane. Il vantaggio principale di questo metodo è che utilizza colture cellulari di tessuti primari anziché animali interi, consentendo così un semplice metodo di prova chimica in vitro. Consiglio quattro: eseguire esperimenti sull'esposizione al cloro.Il sistema di esposizione al cloro deve essere contenuto all'interno di una cappa chimica qualificata con una velocità operativa frontale di 100 FPM prima dell'inizio dell'esposizione. Per prima cosa, regolare il sistema a una leggera pressione positiva con mezzo pollice di colonna d'acqua, quindi immettere aria secca e un livello appropriato di cloro nel sistema a 15 litri al minuto attraverso un regolatore di flusso massico; il sistema di esposizione al cloro utilizza una bombola di gas compresso contenente il 1% di cloro in azoto secco. Successivamente, bloccare il coperchio della camera mediante i quattro lucchetti dell'unità di contenimento mini biocon e la guarnizione in silicone a bassa durezza per garantire la tenuta ermetica.Quindi, utilizzando il pannello di flusso appositamente progettato, regolare il flusso d'aria di diluizione e la concentrazione di cloro nelle camere di esposizione. Una pompa di campionamento a basso volume aspira l'aria di scarico dalle camere verso un analizzatore di cloro per monitorare le concentrazioni, che vengono successivamente registrate su un datalogger collegato all'analizzatore. Utilizzare un flussimetro per misurare le portate all'interno delle camere prima dell'esposizione, al fine di garantire portate di somministrazione e di scarico uguali.Ora, rimuovere il mezzo sovrannatante dalle cellule di interesse e aggiungere mezzo fresco alla coltura cellulare. Quindi esporre le colture cellulari al gas cloro alla concentrazione appropriata in PPM e per il periodo di esposizione indicato all'interno delle due camere di contenimento Biocon sigillate per cellule polifunzionali.Dopo l'esposizione, lavare le camere con aria per circa cinque minuti, fino a quando il livello di cloro scende al di sotto di 1 PPM, per consentire l'apertura in sicurezza del sistema e la rimozione delle cellule. Per misurare la resistenza elettrica transepiteliale delle colture cellulari esposte al cloro, utilizzare un ometro epiteliale con una coppia di elettrodi a bacchetta di cloruro d'argento. Prima di usarli, equilibrare gli elettrodi a bacchetta nel mezzo all'interfaccia aria-liquido per 15 minuti.Quindi aggiungere un millilitro di mezzo tiepido alla superficie apicale e due millilitri alla superficie basolaterale della coltura cellulare. Immergere ora il braccio più corto dell'elettrodo nel mezzo apicale e il braccio più lungo nel mezzo basolaterale, quindi fare clic sul pulsante di misurazione sul voltmetro per valutare la resistenza elettrica. Per determinare la resistenza elettrica transepiteliale, sottrarre la resistenza attraverso un supporto di coltura privo di cellule dalla resistenza misurata attraverso ciascuno strato cellulare.Cardiomiociti primari grezzi modellati si attaccano, si espandono e si differenziano in colture confluenti su matrici di laminina. In questo esperimento rappresentativo, i cardiomiociti RAC sono stati ulteriormente caratterizzati in base alla loro actina sarcomerica ed espressione circadiana. I cardiomiociti di ratto sono altamente suscettibili alla tossicità del cloro. Un'esposizione di 15 minuti a 100 PP M di cloro provoca un marcato arrotondamento cellulare e morte nelle colture immerse, nonché una rottura degli strati confluenti nelle cellule osservate sulle membrane rivestite di laminina.Le cellule mostrano inoltre una morte cellulare apoptotica potenziata, come indicato dal rilascio della caspasi 3/7 nei cardiomiociti coltivati su inserti. Nelle prossime figure è mostrato un esperimento rappresentativo con epitelio delle vie aeree umane differenziato esposto al cloro.L'esposizione dell'epitelio delle vie aeree umane al cloro provoca distacco e sollevamento delle membrane cellulari sia a basse che ad alte concentrazioni; il danno causato da una bassa concentrazione di cloro viene rapidamente invertito. Tuttavia, nelle cellule esposte a concentrazioni più elevate di cloro, la capacità di riprendersi dall'esposizione al gas è ritardata o assente, come osservato mediante ispezione visiva o valutazione della proliferazione cellulare tramite colorazione per KI 67. Le misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale e dell'attività della caspasi confermano ulteriormente questi risultati e forniscono evidenze di una perdita dell'integrità della membrana e di morte cellulare apoptotica in seguito all'esposizione al cloro. Pertanto, questi studi descrivono lo sviluppo di un sistema di esposizione al cloro in vitro che provoca perdita dell'integrità della membrana e morte cellulare di epitelio delle vie aeree e cardiomiociti dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare i meccanismi di danno provocati dai gas tossici in organi complessi come il polmone e il cuore.

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