Name: Analisi fosfopeptide di roditori Epididymal spermatozoi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Scopri l'analisi fosfopeptide degli spermatozoi epididimali di roditori per studiare i cambiamenti di fosforilazione durante la maturazione. Questo metodo combina retrograde back flushing, digestione con tripsina e arricchimento con TiO2.

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Gli autori desiderano ringraziare il NHMRC per il premio per lo sviluppo della carriera e il sostegno alle sovvenzioni APP1066336 che hanno sostenuto questo lavoro.

1. Preparazione della Cultura media e Piatti <ol><li> Rendere 200 ml di Biggers Whitten Whitten e (BWW) 17 soluzione di lavoro aggiungendo 5,54 g di NaCl, KCl 0,356 g, 0,25 g CaCl 2, 0,162 g H 2 KO 4 P, e 0,294 g MgSO 4 a 1 L di acqua Milli-Q . Questa è la soluzione madre e può essere conservato a 4 ° C per un mese. </li><li> Dalla soluzione di riserva, aggiungere 420 mg di NaHCO 3 -, 200 mg di glucosio, piruvato 6 mg di sodio, 600 mg albumina sierica bovina, 0,74 ml di lattato di sodio, e 4,0 ml di tampone HEPES a 193 ml di BWW magazzino. Questa è la soluzione di lavoro ed è sempre fatta fresca nel giorno e equilibrati a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Per rendere la cannula, prendere polietilene (PE) tubi con un diametro interno di 0,4 mm e un diametro esterno di 1,1 mm e tenere a fuoco basso (tipicamente fiamma metanolo) tale che il tubo inizia a fondere. Tirare subito il tubo OUTWard per allungare e rendere il diametro esterno stretto. </li><li> Tagliare a produrre un restringimento di una estremità, che consente una più facile incannulamento dei vasi deferenti. </li><li> Tagliare l&#39;altra estremità della cannula per circa 15 cm. Inserire un ago da 30 G nel estremità smussata, e allegare una siringa da 3 ml di esso (completamente ritratto). </li><li> Fare un boccaglio di aspirazione tagliando una lunghezza 20 centimetri di tubo in PE (4,2 mm di diametro interno, 6.4 mm di diametro esterno). Inserire un boccaglio in una fine. </li><li> Inserire il supporto tubo di vetro micro-capillare e il vetro micro-capillare stesso (tipicamente 3 ml di un mouse, 40 microlitri di un topo). </li></ol> 2. Rimozione di epididimi da mouse <ol><li> Euthanize topi secondo procedure IACUC approvati specifici per ogni istituzione. </li><li> Prendere l&#39;animale e fare una piccola incisione nello scroto per esporre epididimo. Estrarre testicolo e epididimo fuori della cavità con un paio di orologiai # 5 pinze. </li><li> Tagliare il dotto deferente tale che almeno 1-2 cm rimangono attaccate alla epididimo cauda. Inoltre, tagliare i dotti efferenti prossimali e tessuto connettivo dell&#39;epididimo al testicolo e rimuovere l&#39;intera traccia riproduttivo maschile. </li><li> Inserire l&#39;intera traccia riproduttivo maschile sotto un microscopio da dissezione con un intervallo di ingrandimento nell&#39;ordine di 5-40X. </li></ol> 3. Cannulating il Epididimo <ol><li> Nastro lungo la cannula al microscopio, tale che 1-2 cm del ristretta (a forma di cono) estremità è libera e visibile attraverso la lente. </li><li> Prendete un paio di orologiai # 5 pinze e stringere con delicatezza ogni lato dei vasi deferenti e tirare il dotto deferente sulla cannula, in modo tale che la cannula va in vasi deferenti. </li><li> Prendete una lunghezza di non riassorbibile seta trattata nera intrecciata (dimensioni 5-0) e fare un nodo attorno ai vasi deferenti cannulate. Assicurarsi che il nodo viene tirato strettamente per tenere la cannula all&#39;interno dei vasi deferenti quando la pressione dell&#39;aria from la siringa viene applicato. </li></ol> 4. retrograda o backflush di Caudal Epididymal spermatozoi <ol><li> Utilizzando orologiai # 5 pinze, afferrare l&#39;estremità distale dei epididimi cauda e rimuovere la tunica albuginea, al fine di esporre un singolo tubulo dell&#39;epididimo. </li><li> Utilizzando le pinze, tirare delicatamente il tubulo fuori per esporre e poi prendere in giro a parte in modo da creare un&#39;apertura per lo sperma per essere rilasciato. </li><li> Spingere delicatamente sui 3 ml (mouse) o 20 ml (ratto) siringa in modo da espellere l&#39;aria dalla siringa in vasi deferenti. Alla pressione appropriata, spermatozoi inizierà a venire lentamente del tubulo rotto all&#39;estremità distale del epididimo cauda. In questo momento, applicare il vuoto al boccaglio per disegnare spermatozoi nel capillare di vetro. Nota: Tipicamente in un topo, 2-3 ml di spermatozoi può essere ottenuto a seconda dell&#39;età dell&#39;animale. Una volontà di ratto, a resa media 30-40 ml. </li></ol> 5. Lavaggioe lisi gli spermatozoi in preparazione Proteomica <ol><li> Espellere gli spermatozoi dal capillare di vetro in 1 ml di soluzione di BWW (37 ° C) soffiando delicatamente nel boccaglio o attaccare una siringa e di espellere l&#39;aria in modo da spingere il spermatozoi indietro del capillare. </li><li> Una volta che le cellule spermatiche sono diffusi, lavare 3x (300 xg, 5 min) con 1 ml BWW per rimuovere le proteine ​​contaminanti. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante. Nota: A questo punto, le cellule spermatiche possono essere congelati per un uso successivo. </li><li> Solubilizzazione proteine ​​usando 4% CHAPS, 2 M tiourea, e 50 Tris mM, pH 7.4 per 1 ora con vortex intermittente. </li><li> Dopo la lisi delle cellule, centrifuga (10.000 xg, 20 min), prendere surnatante e trasferire ad un nuovo tubo. Nota: A questo punto, la quantificazione delle proteine ​​può essere eseguita. </li></ol> 6. legame disolfuro Riduzione e Alchilazione <ol><li> Aggiungi DTT 10 mM come una concentrazione finale di proteine ​​lisati, vortex e incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aggiungere 50 mM idodoacetamide come concentrazione finale di lisato, vortex e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. </li></ol> 7. Precipitazione <ol><li> Metanolo cloroformio precipitare il campione aggiungendo 1 volume di lisato (400 microlitri come esempio), aggiungere un volume (400 ml) di metanolo e 0,5 volumi (200 microlitri) cloroformio. </li><li> Vortex il campione e di spin (10.000 xg, 2 min). </li><li> Si noti che due fasi appariranno dopo centrifugazione. Eliminare tutti ma 2 mm di strato superiore (facendo attenzione a non disturbare l&#39;interfaccia). </li><li> Aggiungere 1 volume (400 ml) di metanolo, tubo invertito 1-2x delicatamente per mescolare e centrifugare di nuovo (10.000 xg, 15 min). Gettare il surnatante sprecare e pellet asciugare all&#39;aria per 3-4 min. </li></ol> 8. tripsina Digestione <ol><li> Ricostituire tripsina in 25 mM di bicarbonato di ammonio contenente 1 M urea ad un rapporto di 50: 1 (W / W; proteine: tripsina) e incubate overnight a 37 ° C, preferibilmente a 700 rpm su un thermomixer. </li><li> Spin (10.000 xg, 15 min) a pellet materiale digerito. Trasferire il surnatante in nuova provetta. </li></ol> 9. fosfopeptide Enrichment <ol><li> Eseguire purificazione e arricchimento fosfopeptidi dal triptico digest come descritto in precedenza 18. Diluire peptidi triptici 10 volte in tampone DHB [DHB tampone costituito da: 350 mg / ml di acido 2,5 dihydrobenzesulfonic (DHB), 80% (v / v) ACN (acetonitrile), 2% (v / v) TFA (trifluoroacetico L&#39;acido)] e si applicano a secco TiO2 perline (200 mcg). </li><li> Lasciare in un rotatore a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare il campione con il tampone DHB, ruotare e rimuovere il surnatante. Quindi lavare il campione tre volte con tampone di lavaggio [80% ACN (v / v), 2% TFA (v / v)] per rimuovere il DHB. </li><li> Dopo la centrifuga finale, eluire direttamente le fosfopeptidi utilizzando tampone di eluizione aggiungendo 25 ml di idrossido di ammonio 2,5%, pH ≥ soluzione 10.5. Spin e rimuovere il surnatante. Neutralizzare immediatamente con ~ 0,3 ml di acido formico. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I passaggi critici per il successo e riproducibile analisi proteomica di spermatozoi sono: 1) la purezza del materiale di partenza; 2) la rimozione dei sali e detergenti indesiderati; 3) denaturazione proteine ​​per la loro estensione in modo da consentire tripsina per digerire un alto rendimento di proteine ​​e 4) minimizzando campione movimentazione per ridurre la perdita di peptide. Per backflush successo l&#39;epididimo cauda, ​​è essenziale per individuare la zona da cui spermatozoi uscirà. In caso di ratto e topo, questo è all&#39;apice della zona concava, nel mezzo della regione caudale dell&#39;epididimo (vedi figura 2A). Se uno viene ulteriormente verso i vasi deferenti, risciacquo è più facile e il tasso di successo è generalmente superiore. Tuttavia, questo ha la perdita di numero di spermatozoi. In alternativa, se si tenta di muoversi più prossimale al corpus, allora la quantità di pressione necessaria per spingere il spermatozoi indietro attraverso il epididymcondotti Al è spesso così alta, che danno ai epididimo avviene inevitabilmente. Backflush dell&#39;epididimo avviene tradizionalmente con acqua satura di olio minerale e una soluzione salina bilanciata nella siringa stessa come un mezzo per rimuovere gli spermatozoi 22-25. Entrambe le procedure sono potenzialmente problematici di LC-MS. In primo luogo, minerale rischia di bloccare le nano-C18 nano-colonne che sono essenzialmente utilizzati in tutto il mondo per l&#39;analisi e la cura proteomica devono essere prese in modo che nessuno sia portato avanti nella procedura. In questo caso, non è possibile proseguire e il campione viene sostanzialmente perso. Questo può essere superato con l&#39;uso di BWW o altre soluzioni saline bilanciate nella siringa, tuttavia, anche se questo è successo, presto riconosciuto che molti degli spermatozoi mobili diventano non appena la soluzione BWW entra in contatto e mescolato con il epididimale caudale cellule. Per aggirare questo problema semplicemente backflush gli spermatozoi con l&#39;aria. Non solo è la quallità di spermatozoi paragonabile a quella dei metodi a base liquida, ma la quantità è identico. Fosfoproteomica è forse uno dei pochi modi per stabilire quali vie di segnalazione si verificano in spermatozoi post-eiaculazione. Una delle principali vie che stiamo indagando è il processo di capacitazione. Gli spermatozoi deve sottoporsi &quot;capacitazione&quot; prima che sia in grado di legarsi ad un uovo. In pratica, questo è realizzato sostanzialmente incubando spermatozoi per un periodo di tempo (topo 40 min; ratto 1,5 ore; umana 3-24 ore) in soluzione BWW con albumina sierica. In precedenza, noi ed altri hanno dimostrato un ruolo per diverse chinasi coinvolte in capacitazione. Di interesse, la cancellazione della PKA μ II produrre topi i cui spermatozoi nuotare spontaneamente in vitro, ma non può subire iperattivazione 26. Quest&#39;ultima è una caratteristica di capacitazione, per cui gli spermatozoi cambiare il loro modello di nuoto da una velocità elevata, bassa ampiezza, a un minimovelocità, ampiezza alta battuto frequenza. Abbiamo dimostrato chinasi a valle coinvolti in questo processo sono PP60-CSRC (SRC) 13,27 c-yes 28 e c-ABL 14. È interessante notare che l&#39;inibizione di SRC ferma capacitazione-dipendente fosforilazione della tirosina 13. Tuttavia, questo può essere superato con l&#39;acido okadaico, suggerendo che SRC non è direttamente coinvolto nella insorgenza generale di fosforilazione della tirosina 29, ma possono disciplinare una fosfatasi 29. Il problema con l&#39;utilizzo BWW come mezzo per forzare spermatozoi fuori dell&#39;epididimo è che, una volta attivato, mouse spermatozoi richiedono soltanto circa 40 min a capacitate. Dato che l&#39;isolamento di spermatozoi può prendere 5 min / mouse e spesso diversi topi sono utilizzati in un esperimento, allora spermatozoi sarà a diversi stadi di maturazione all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Per ovviare a questo, la pressione dell&#39;aria può essere utilizzato per spingere il spermatozoi dall&#39;epididimo caudali in una cannula di vetro. Non solo tutte le inact spermaive ed essenzialmente come sarebbero trovate nell&#39;ambiente caudale, rende possibile il confronto fosfoproteomica non mobili e mobile. La gestione per fosfoproteomica campione deve essere ridotto al minimo quando si confrontano spermatozoi in due diversi stati funzionali. L&#39;uso di metanolo cloroformio rispetto ad altri metodi tradizionali di proteine ​​precipitazione 1) riduce la necessità di ulteriori fasi di lavaggio, 2) rimuove quasi tutte le tracce di sali e grassi e 3) ha una comprovata capacità di precipitare proteine ​​poco abbondanti su TCA 19. Protein precipitazioni prima tripsina digestione è consigliato dal momento che non solo fa questo aiuto per denaturare proteine ​​(che aiuta la digestione tripsina), ma rimuove molti dei metaboliti MS-compatibili presenti nella cellula. Il confronto di fosfopeptidi sperma può essere fatto in diversi modi. Al livello di base, un semplice confronto della fosfopeptide identificato in un campione, a quella in un&#39;altracampione nel processo noto come &quot;conteggio spettrale&quot; può essere fatto. Tuttavia la critica è stata in questo approccio fondamentalmente perché i primi studi di proteomica usavano basse repliche (per una discussione più vedere Lundren et al. 30). Un approccio più sofisticato è quello di esaminare l&#39;intensità della massa genitore peptide e confrontarlo con gli altri campioni (di confronto libero-label). Nell&#39;esempio illustrato nella figura 4, un peptide assente dal da non mobili (figura 4 in alto), ma presenti nella mobili (Figura 4 in basso) spermatozoi da m / z 650-670 può essere visto. Questo processo, denominato etichetta MS quantificazione libera è una strategia senza etichetta. Una strategia alternativa comunemente usato per ridurre la quantità di piste richiesti per la quantificazione proteomica è utilizzare isotopi. Poiché la massa di un isotopo è diverso, lo spettrometro di massa può essere utilizzata per confrontare le intensità del Eluting peptidi. Tuttavia, a differenza di molti altri tipi di cellule, alcune etichettatura isotopica non può essere applicato a spermatozoi. Ad esempio, l&#39;aggiunta di isotopi stabili (un isotopo pesante viene aggiunto un campione, mentre una versione più leggera viene aggiunto ad un altro) può essere utilizzato in coltura tissutale. Quando gli isotopi vengono incorporati nella proteina, un&#39;analisi proteomica può essere eseguita combinando i due campioni (multiplazione). Tuttavia, nel caso di spermatozoi, ciò non può essere fatto, semplicemente in virtù del fatto che 1) marcatura isotopica richiede diversi passaggi (fino a 8) in coltura tissutale e 2) gli spermatozoi senza trascrizione genica nucleare e traduzione e quindi, essi non possono incorporare comunque isotopi in tutte le loro proteine. Un modo per aggirare questo è quello di ordinare i topi radiomarcati, tuttavia, questi sono notoriamente costosi. Un approccio alternativo è di utilizzare un tag chimica. Questo è stato fatto quando i topi non capacitati sono stati confrontati con i topi capacitati. In questo caso, un D 0 e D <sub&gt; 3 -label stato utilizzato per distinguere tra un campione e l&#39;altro nello spettrometro di massa 31. Altri approcci possono includere l&#39;uso di iTRAQ (tag isobarica per la quantificazione relativa e assoluta), per cui lisine sono etichettati chimicamente con diversi isotopi di massa; iCAT (isotopo codificato tag affinità) per cui cisteine ​​sono etichettati con diversi isotopi di massa e l&#39;etichettatura di acqua pesante e leggero. In ogni caso, comunque, una cosa deve essere tenuto a mente. La MS riporta solo ciò che è presente in un campione, e questo è un riflesso di tutto ciò che è accaduto a quel campione fino a quel momento. Minimizzare la manipolazione del campione, mentre massimizzando il rendimento ad ogni passo è necessario per un successo analisi proteomica.

Uscito dal testicolo, spermatozoi sono molto differenziati ancora notevolmente, queste cellule sono immature 1,2. Come tali, non hanno completa funzionalità, tra cui la possibilità di nuotare e si legano ad un ovocita 3. Anche se è necessaria ulteriore maturazione della cellula sperma, questo non può avvenire tramite percorsi canonici, poiché in questa fase del loro processo di differenziazione cellulare, sono incapaci di trascrizione genica e in seguito biosintesi delle proteine ​​4. È conferita la competenza biologica su spermatozoi che lasciano testicolo ed entrano una parte del sistema riproduttivo maschile noto come epididimo 5. L&#39;epididimo è una stretta spirale, tubo altamente differenziato che collega i condotti efferenti (del testicolo) per le deferenti ed è presente in tutti i mammiferi maschi 6. Gli spermatozoi progressivamente acquisire il loro potenziale di concimazione durante la discesa epididimale, basandosi sull&#39;ambiente luminale continua evoluzione che è created da parte delle cellule epiteliali dell&#39;epididimo locali 7. Le varie attività secretoria e ri-assorbenti presenti nell&#39;atto epididymal milieu di modificare lo sperma in sé, cambiando il suo proteine, carboidrati e lipidi composizione 6. L&#39;importanza dell&#39;epididimo, in particolare la regione iniziale &#39;caput&#39; di questa struttura è stata esemplificata utilizzando tecniche chirurgiche legatura 8. Gli spermatozoi conservati all&#39;interno del testicolo da efferente condotto legatura sono completamente privo di qualsiasi capacità di fecondare l&#39;ovocita 9-11. Oltre all&#39;ambiente epididimale, trasduzione del segnale all&#39;interno dell&#39;opera spermatozoi al post-traslazione modificare il complemento spermatozoo esistente. Ad esempio, gli spermatozoi dai primi regioni dell&#39;epididimo visualizzare diversi modelli di fosforilazione di proteine ​​rispetto a queste ultime regioni 5,12. Questo non è sorprendente dal momento che ci sono grandi differenze nel capability dello sperma da queste regioni. Ad esempio, gli spermatozoi dei primi anni, caput epididimo sono immotilite. Al contrario, le cellule spermatiche della regione cauda subiranno avanti motilità progressiva volta posto in mezzo isotonico. Dato che le cellule spermatiche epididymal sono incapaci di de-novo biosintesi delle proteine, tutti i percorsi intrinseci che regolano la funzionalità degli spermatozoi deve avvenire attraverso modificazioni post-traduzionali (PTM). Quindi, è ovvio che la proteomica, e in particolare la ricerca di PTM, come la fosforilazione deve essere uno degli elementi principali, se vogliamo capire sperma maturazione delle cellule. Un metodo alternativo per ottenere spermatozoi dalle epididymidies usare retro-backflush 13-16. Sebbene questa tecnica è certamente più tempo e richiede un maggior grado di abilità da parte dell&#39;operatore, gli spermatozoi ottenuta costantemente dimostrare purezza superiore al 99,99%. Inoltre, a differenza di tutte le altre tecniche, spermatozoi can essere isolato in uno stato quiescente, rendendo possibile studiare come viene iniziata la motilità degli spermatozoi. Come preparazione del campione è l&#39;aspetto più importante per l&#39;analisi proteomica, l&#39;isolamento degli spermatozoi è diventato uno degli aspetti più importanti di studi sperma-proteomica. Questo protocollo fornisce una spiegazione su come spermatozoi sono isolati dal epididimo cauda. In seguito a questo, la procedura di arricchimento 2 fosfopeptide TiO è delineato, con specifico riferimento su come estrarre peptidi dalle spermatozoi altamente differenziate. L&#39;approccio MS può essere utilizzato per distinguere mutevoli fosfopeptidi se si dovesse confrontare la epididymal spermatozoi caudale in uno stato (immotile o non capacitati) ad un altro (mobili, capacitati, acrosoma reagito, etc.) rendendo questo un approccio potente per studiare sperma funzione.

<table><tbody><tr><td>2,5-Diidrossi-1,4-benzochinone</td><td>Aldrich</td><td>195464</td><td></td></tr><tr><td>Kit di quantificazione 2-D</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ammoniaca 25%</td><td>Merck</td><td>1.05432</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di</td> <td>calcioSigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 3-[3-(collamidopropil)dimetilammonio]-1-propansulfonato</td><td>Ricerca Organici</td><td>1300C</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>BDH</td><td>10077.6B</td><td></td></tr><tr><td>Idrogeno fosfato disodico</td><td>Merck</td><td>1.06580</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma</td><td>O6440</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina-L</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (acido libero)</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Acido iodoacetico acido libero</td><td>Sigma</td><td>I4386</td><td></td></tr><tr><td>Acido lattico</td><td>Sigma</td><td>L1750</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Res. Org.</td><td>0090M</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Merck</td><td>10158.6B</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (sterile)</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>GEHE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della fosfatasi Cocktail Halt</td><td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td><td>PIE78420</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato acido di potassio</td><td>Medical Store</td><td>CH 600</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogeno fosfato di sodio</td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato acido di sodio</td><td>BDH</td><td>10247.4V</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tris, grado ultra puro</td><td>Amresco (Astral)</td><td>AM0497</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina Oro, grado di spettrometria di massa</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di zinco</td><td>Sigma</td><td>Z0173</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm Tubo in polietilene</td><td>Goodfellow</td><td>ET317100</td><td></td></tr><tr><td>30 G ago</td><td>Terumo</td><td>NN2038R</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Siringa</td><td>Terumo</td><td>SS035</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene da 4,2 mm</td><td>Goodfellow</td><td>ET317640</td><td></td></tr><tr><td>Seta intrecciata (5-0)</td><td>Dynek</td><td>CSS0100</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico</td><td>Sigma</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>Perline TiO2 (da colonna smontata)</td><td>Titansphere</td><td>6HT68003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>C7B30</td><td>Sigma</td><td>C0856</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi fosfopeptide di roditori epididymal spermatozoi

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Gli spermatozoi sono abbastanza unico tra i tipi di cellule. Sebbene prodotta nel testicolo, sia la trascrizione del gene nucleare e la traduzione sono spenti una volta la cella rotonda pre-cursore comincia ad allungarsi e differenziarsi in ciò che è morfologicamente riconosciuto come uno spermatozoo. Tuttavia, lo spermatozoo è molto immaturo, non avendo capacità di motilità o riconoscimento uovo. Entrambi questi eventi si verificano una volta il transito spermatozoi un organo secondario noto come epididimo. Durante il passaggio ~ 12 giorni che ci vuole per una cella di sperma di passare attraverso l&#39;epididimo, modificazioni post-traduzionali delle proteine ​​esistenti svolgono un ruolo fondamentale nella maturazione della cellula. Un aspetto importante di questa è fosforilazione proteica. Al fine di caratterizzare gli eventi di fosforilazione che si svolgeranno durante la maturazione degli spermatozoi, devono essere stabiliti due popolazioni di cellule di sperma puri e pre-frazionamento di fosfopeptidi. Utilizzando tecniche di lavaggio indietro, un metodo per l&#39;isolamento di puro spermatozoi of alta qualità e la resa dei epididimi distali o caudale è delineato. Sono spiegati i passaggi per solubilizzazione, la digestione, e pre-frazionamento di fosfopeptidi spermatozoi attraverso TiO2 cromatografia di affinità. Una volta isolato, fosfopeptidi possono essere iniettati in MS per identificare entrambi gli eventi di fosforilazione di proteine ​​su specifici aminoacidi e quantificare i livelli di fosforilazione che si svolgono durante i processi di maturazione degli spermatozoi.

La qualità dei risultati di un&#39;analisi proteomica è fortemente dipendente dal materiale di partenza. Con MS moderni, lievi contaminazioni in preparazione del campione sono facilmente raccolti. Pertanto, è fondamentale, in caso di proteomica spermatozoo, scegliere un metodo che dà spermatozoi altamente puro. Come illustrato nella figura 1, risciacquo retrograda viene utilizzato per recuperare spermatozoi dall&#39;epididimo cauda. Ciò comporta cannulating deferenti con tubi in PE che permette di applicare lentamente la pressione dell&#39;aria dalla siringa attaccata. Figura 1A mostra l&#39;epididimo cauda insieme ai vasi deferenti. Figura 1B è un primo piano colpo di come i vasi deferenti è legata in cui il È inserito cannula. In tal modo, gli spermatozoi vengono rilasciati al termine di una tubulo asportato dagli epididimi caudale. Come mostrato in Figura 2A, gli spermatozoi vengono estratti dalle regioni apice della caudun epididimo e vengono aspirati in un capillare di vetro in uno stato quiescente (Figura 2B). Questo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali &quot;swim-up&quot;, non ultimo dei quali è la possibilità di eseguire un&#39;analisi phoshoproteomic di spermatozoi prima e dopo l&#39;attivazione di motilità. Gli spermatozoi può essere espulso in mezzi di propria scelta. Figura 2C (lato sinistro), dimostra come lo sperma guardare subito dopo l&#39;espulsione in BWW media. Molte delle cellule sono raggruppate insieme. Tuttavia, dopo 10 min di competenza delle cellule è dimostrato perché nuotare verso l&#39;omogeneità nella soluzione (Figura 2C, giuste cellule lato). Dal momento che la tecnica di risciacquo ha un impatto minimo sulle cellule spermatiche, otteniamo quasi il 100% la motilità e le cellule disperdono rapidamente nella media senza provocazione esterna. In un tipico esperimento risciacquo, lo sperma recuperato dalla Swiss-Mouse contienetra 1-5 x 10 6 cellule. Questo è fortemente dipendente dall&#39;età dell&#39;animale e può variare da diversi ceppi di topi. In un ratto norvegese, si ottiene tipicamente 200 x 10 6 spermatozoi, ± 20%. Figura 2D rappresenta la purezza degli spermatozoi ottenuti dal epididimo ratto cauda. Oltre al campione stesso, uno dei principali problemi riguardanti la preparazione del campione è la resa di tripsina digestione. Protein precipitazione gioca un ruolo importante, non solo nel rimuovere detergenti e sali indesiderati, entrambi i quali sono incompatibili con MS, ma anche proteine ​​denaturazione. Abbiamo trovato la precipitazione metanolo-cloroformio per funzionare al meglio. Non solo è stato segnalato questa procedura per precipitare bassa abbondanti proteine ​​meglio di altri compreso TCA precipitazioni 19, ma ha ulteriori vantaggi. Dopo precipitazione TCA, è spesso necessario regolare il pH dopo sospensione del pellet TCA che possa rimanere abbastanzaacida. Sebbene il pellet precipitato di TCA può essere lavato in soluzioni organiche alti per rimuovere l&#39;acido, questo aggiunge al campione manipolazione e irriproducibilità di risultati. La mancata neutralizzare l&#39;acido comporterà poveri rendimenti peptide triptici. Metanolo-cloroformio precipitazione non è solo veloce ma non acidificare il campione. La Figura 3 illustra il pellet di proteine ​​tipicamente visto da 100 mg di campione tra l&#39;interfase inferiore e superiore. L&#39;isolamento di fosfopeptidi può avvenire in diversi modi; tuttavia riproducibilità dipende da come il campione è stato gestito fino al questa fase. Uno dei metodi di sviluppo più comuni è TiO2, originariamente sviluppato dal gruppo di Martin Larsen 18,20,21. Sebbene descritto come un processo per utilizzare in microcolonne, possiamo ottenere dati riproducibili mediante cromatografia batch. Il successo del processo è fortemente dipendente dal tampone di eluizione, che deve essere pazza<html> e con la corretta composizione; altrimenti fosfopeptidi non vengono eluiti affatto. La riproducibilità dei dati di protocollo e rappresentativi da TiO 2 arricchito fosfopeptidi da cauda epididimale sperma in un non mobili (figura 4 in alto) e mobili (Figura 4 in basso) stato da m / z 650-670 può essere visto. Abbiamo dimostrato che questa è una tecnica estremamente riproducibile anche utilizzando repliche biologica 17. Le strisce blu che appaiono nel tempo sono peptidi eluizione da un nano-colonna C18 come aumenta la concentrazione di acetonitrile. Chiaramente, nella popolazione mobili (n = 3 mostrato, n = 8 tipicamente funzionare), vi è un gruppo peptide, con una massa monoisotopico intorno al 651,5 Da gamma che è completamente assente nell&#39;intervallo non mobili. Spettrometria di massa tandem viene quindi utilizzato per identificare questo peptide. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Incannulazione del epididymis cauda (A) Immagine del epididimo cauda. La cannula si è registrato fino a esporre di circa 1-2 cm dalla fine pre-tirato. Questo è inserito nei vasi deferenti utilizzando sottili # 5watchmakers pinze. (B) La cannula viene tenuto in posizione legando seta fine attorno a un segmento che contiene sia i vasi deferenti e la cannula. Dal murino, approssimativamente 2-3 microlitri di cellule dell&#39;epididimo caudale e fluido sono raccolti ad una concentrazione di 1 x 10 6 / ml. Dal ratto (in figura), a circa 30-40 ml di liquido si ottengono a concentrazioni simili. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Figura 2: capillare di vetro utilizzato per raccogliere competente spermatozoi dell&#39;epididimo. (A) Un tubulo dall&#39;apice della cauda e<html> pididymis è isolata e rotto. La posizione approssimata da cui ciò avviene è mostrato. (B) La parte superiore dell&#39;immagine mostra un tubo capillare di vetro vuoto e il fondo mostra uno da un ratto precedenza backflush. Non vi è alcuna contaminazione del sangue e la contaminazione delle cellule epiteliali minima. (C) Poiché gli spermatozoi sono ancora diluito nel fluido dell&#39;epididimo, non hanno iniziato ad attivare. Quando il spermatozoi vengono inizialmente espulsa in una soluzione BWW, escono come &quot;stringa&quot; compact (lato sinistro della mano). La competenza della cella è facilmente stabilito, dal momento che dopo 10 minuti la maggior parte degli spermatozoi nuotare in soluzione senza alcun disturbo esterno (lato destro della mano). (D) Una foto di una aliquota di cellule dell&#39;epididimo caudali subito dopo che sono stati lasciati a nuotare out dimostra la purezza delle cellule. g3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3:. Metanolo-cloroformio precipitazione volta spermatozoi stato solubilizzato, la frazione solubile è metanolo-cloroformio precipitato per garantire denaturazione delle proteine ​​e la rimozione di sostanze contaminanti. Il pellet di proteine ​​appare sull&#39;interfaccia tra le fasi di metanolo / acqua e cloroformio. Lo strato superiore viene rimosso attentamente in modo da non disturbare il pellet. È comune lasciare circa 2-3 mm della fase superiore in modo da nessuna proteina è persa. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Tipica TiO2 profilo fosfopeptide -enriched Utilizzando il protocollo descritto, caudale epididymal spermatozoi sono stati isolati in uno immotile (in alto, N = 3) o stati di mobili (in basso, N = 3). Un cluster peptide con una massa mono-isotopica di ~ 651,5 Dun è dimostrato di essere presente nelle popolazioni motilità ma completamente assente in quelli immotile (freccia). Confronti di questo tipo sono indicati come &quot;privo di etichetta (MS-based)&quot;. La massa peptide e tempo di ritenzione vengono poi utilizzati per indirizzare il composto per spettrometria di massa tandem e identificare la proteina da cui il peptide è stato derivato.

L'analisi proteomica di qualsiasi tipo di cellula dipende fortemente sia dalla purezza che dal pre-frazionamento del materiale di partenza al fine di de-complessare il campione prima della cromatografia liquida con spettrometria di massa (MS). Utilizzando le tecniche di back-flushing, è possibile ottenere spermatozoi puri dai roditori. Dopo la digestione, i fosfopeptidi possono essere arricchiti utilizzando il TiO2.

Analisi fosfopeptide di roditori Epididymal spermatozoi

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare le variazioni dei peptidi fosforilati che avvengono negli spermatozoi durante la maturazione della cellula spermatica. Questo viene ottenuto rimuovendo l'epididimo caudale dal topo, eseguendo un lavaggio retrogrado delle cellule spermatiche e raccogliendo le cellule in un tubo capillare microscopico. Successivamente, le cellule spermatiche vengono lasciate nuotare in una soluzione salina bilanciata, il che permette l'eliminazione delle proteine contaminanti, e poi vengono lavate, lisate e precipitate al fine di rimuovere sali e grassi contaminanti.Le proteine gulari vengono digerite utilizzando tripsina, quindi arricchite mediante biossido di titanio al fine di arricchire i peptidi fosforilati. I risultati mostrano variazioni quantitative nello stato di fosforilazione delle proteine basate sull'analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia della riproduzione, ad esempio quali sono i cambiamenti fosfoproteomici durante il passaggio degli spermatozoi attraverso le EPI o durante la capacitazione.Sebbene questo metodo abbia fornito informazioni sulla biologia delle cellule spermatiche, può essere applicato anche a organismi modello, studi su malattie come il cancro, patologie neurologiche e vie di trasduzione del segnale in generale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché è difficile determinare l'anatomia delle aree in cui verranno manipolati gli EPI. Iniziare preparando 200 millilitri di soluzione lavorativa Biggers, Whitten e Whitten o BWW aggiungendo i seguenti componenti a un litro di acqua Milli Q per ottenere una cannula.Utilizzando un tubo di polietilene con diametro interno ed esterno rispettivamente di 0,4 millimetri e 1,1 millimetro. Mantenerlo sopra una fiamma debole finché il tubo inizia a fondere. Tirare immediatamente le estremità del tubo verso l'esterno per allungarlo, riducendo così il diametro esterno.Tagliare il tubicino in modo da restringere un'estremità, il che permetterà una più facile cannuolatura del S deens. Tagliare l'estremità opposta a circa 15 centimetri. Inserire quindi un ago da 30 gauge nell'estremità smussata e fissarvi una siringa da tre millilitri completamente retratta.Preparare un boccaglio a depressione tagliando un tratto di tubo in PE lungo 20 centimetri e inserendolo in una delle estremità della cannula. Inserire il supporto per microcapillari in vetro e il microcapillare di vetro. Dopo aver soppresso un topo seguendo il protocollo indicato nel testo, praticare un piccolo taglio nello scroto per esporre l'epi.Quindi utilizzare una pinzetta da orologiaio numero cinque per estrarre il testicolo e l'epididimo dalla cavità. Tagliare in modo da rimuovere tutto tranne circa uno o due centimetri del dotto deferente dall'epididimo.Quindi tagliare per rimuovere i dotti EENT prossimali e il tessuto che collega l'epididimo al testicolo e rimuovere l'intero apparato riproduttivo maschile al microscopio stereoscopico utilizzando un ingrandimento compreso tra 5x e 40x. Posizionare uno o due centimetri dell'estremità ristretta della cannula nel campo visivo e utilizzare del nastro adesivo per fissarla con pinzette da orologiaio numero cinque. Afferrare delicatamente ciascun lato del dotto deferente e tirarlo sopra la porzione visibile della cannula.Quindi, con seta nera intrecciata trattata non assorbibile, praticare un nodo sicuro attorno al tessuto cannullato utilizzando pinzette da orologiaio numero cinque. Afferrare l'estremit&agrave; distale dei kata epi ides e rimuovere la tunica Eugenia.Per esporre un singolo tubulo epidermico, esporre delicatamente il tubulo e separarlo per creare un'apertura attraverso cui gli spermatozoi possano fuoriuscire. Successivamente, premere delicatamente lo stantuffo della siringa per espellere aria nel dotto deferente. La pressione farà uscire gli spermatozoi dal tubulo lesionato.Quindi applicare un'aspirazione al bocchino per aspirare gli spermatozoi nel capillare di vetro. Soffiare delicatamente nel bocchino oppure collegare una siringa ed espellere gli spermatozoi dal capillare di vetro in un millilitro di soluzione WW pre-riscaldata. Utilizzare quindi la soluzione per lavare le cellule per tre volte, al fine di rimuovere eventuali proteine contaminanti.Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, congelare gli spermatozoi per un uso successivo oppure utilizzare 4% CHAPS, tiourea 2 M e Tris al 50 millimolare pH 7,4 per solubilizzare le proteine, quindi incubare per un'ora con vorticosazioni intermittenti. Centrifugare quindi la soluzione a 10.000 ×g per 20 minuti e trasferire il soprannatante in un nuovo tubo per ridurre i legami disolfuro e alchilare le proteine aggiungendo DTT a una concentrazione finale di 10 millimolare alla soluzione proteica. Vorticosare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi aggiungere 50 millimolari di acetammide IO al lisato, vortexare e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Per precipitare le proteine, mescolare un volume di lisato, un volume di metanolo e 0,5 volumi di cloroformio. Dopo aver vortexato il campione, centrifugarlo a 10.000 G per due minuti, raccogliere il livello superiore lasciando circa due millimetri per evitare di aspirare l'interfaccia.Dopo aver aggiunto un volume di metanolo, capovolgere delicatamente il tubo e centrifugare nuovamente. Eliminare il soprannatante e lasciare asciugare il pellet all'aria per tre o quattro minuti per eseguire la digestione con tripsina e l'arricchimento di peptidi fosforilati. Iniziare utilizzando bicarbonato di ammonio 25 millimolare contenente urea 1 molare.Per ricostituire la tripsina, combinare F 50 in un rapporto ponderale di uno a uno tra proteina e tripsina e incubare durante la notte in un termomixer a 37 gradi Celsius e 700 giri al minuto. Dopo aver centrifugato per formare il pellet del materiale non digerito, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Utilizzando il tampone DHB preparato secondo il protocollo descritto nel testo, diluire i peptidi tripsinizzati di dieci volte e applicarli su 200 microgrammi di perle di biossido di titanio secche; incubare su un agitatore rotante per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare il campione un'ulteriore volta con il tampone DHB, quindi lavare il campione tre volte con un tampone di lavaggio costituito da 80% ACN e 2% TFA. Dopo la centrifugazione finale, eluire i peptidi fosforilati aggiungendo idrossido di ammonio al 2,5% immediatamente dopo aver centrifugato e raccolto il soprannatante.Utilizzare 0,3 microlitri di acido formico per acidificare il campione come mostrato qui. Un vantaggio di questo protocollo è che gli spermatozoi vengono isolati. In uno stato quiescente, molte cellule si aggregano subito dopo l'espulsione nel mezzo B WW.Tuttavia, dopo 10 minuti, diventano modaliali e la soluzione diventa omogenea. La preparazione descritta in questo video produce tipicamente 200 volte 10 alla sesta zoospermatozoi. Questa figura dimostra la purezza degli spermatozoi provenienti dall'epididimo di ratto AR Cota.Un problema principale relativo alla preparazione del campione è il rendimento delle estrazioni e della digestione. A differenza della precipitazione con TCA, che spesso richiede l'aggiustamento del pH del campione, la precipitazione con fenolo-cloroformio è rapida e non acidifica il campione; qui è mostrato il pellet proteico tipicamente ottenuto da 100 microgrammi di campione, situato tra l'interfaccia inferiore e superiore illustrata. Di seguito è mostrata la riproducibilità di questo protocollo.Le strisce blu che compaiono nel tempo sono peptidi eluiti da una colonna nano C 18. Man mano che la concentrazione di acetonitrile aumenta nella popolazione modale, si osserva un aggregato di peptidi a circa 651,5 Dalton che è completamente assente nel range non fosfato. Una volta che il protocollo di arricchimento dei peptidi fosfati è stato eseguito, si rivela una tecnica efficiente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la preparazione del campione è un aspetto fondamentale per ottenere risultati riproducibili in proteomica. Questo metodo può essere adattato per isolare glicoproteine, che possono essere utilizzate per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio quali proteine subiscono un cambiamento nel contenuto di acido sialico del loro proteoma.

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In questo video, dimostriamo l'immunoprecipitazione dei fosfopeptidi basata su anticorpi da una miscela di peptidi. I fosfopeptidi arricchiti sono concentrati sotto vuoto e conservati per l'analisi a valle.

Arricchimento di fosfopeptidi: una tecnica di immunoprecipitazione basata su anticorpi per separare specifici peptidi fosforilati da miscele di peptidi complessi

L'obiettivo di questa tecnica di squash del tubulo è quello di valutare velocemente le caratteristiche citologiche di sviluppare spermatociti di mouse, preservando l'integrità cellulare. Questo metodo consente lo studio di tutte le fasi della spermatogenesi e può essere facilmente implementato al fianco di altri approcci biologici biochimici e molecolari per lo studio di meiosi del mouse.

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Lo studio presente descrive un metodo semplice per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione dalla leucina-ricche ripetere chinasi 2.

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Qui, segnaliamo la localizzazione di immunofluorescenza della dinamina per illustrare i protocolli per il rilevamento delle proteine nelle sezioni dell'epididimo paraffina-incastonato del mouse e quelli di una linea di cellulari immortalizzate epididimaria (mECap18). Inoltre descriviamo i protocolli per l'isolamento delle proteine secretorie da sia fluido epididimario e media condizionato delle cellule.

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Descriviamo l'applicazione di un analizzatore di flusso extracellulare per monitorare i cambiamenti in tempo reale nella glicolisi e nel fosforilazione ossidativa durante la capitaneria dello sperma del topo.

Utilizzo di un analizzatore di flusso extracellulare per misurare i cambiamenti nella glicolisi e nel fosforo ossidativo durante la capazione dello sperma del mouse

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Analisi fosfopeptide di roditori Epididymal spermatozoi

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