Analisi fosfopeptide di roditori Epididymal spermatozoi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di quantificare i cambiamenti del fosfopeptide che si verificano all'interno degli spermatozoi durante la maturazione delle cellule spermatiche. Ciò si ottiene rimuovendo l'epididimo dal topo, eseguendo il lavaggio retrogrado degli spermatozoi e raccogliendo le cellule in un micro tubo capillare. Successivamente, gli spermatozoi vengono lasciati nuotare in una soluzione salina bilanciata, che consente la rimozione delle proteine contaminanti, e quindi vengono lavati, lisati e precipitati per rimuovere i sali e i grassi contaminanti.

Le proteine gulari vengono digerite utilizzando tripsina e arricchite con biossido di titanio per arricchirle per i fosfopeptidi. I risultati mostrano cambiamenti quantitativi nello stato di fosforilazione delle proteine sulla base della cromatografia liquida, dell'analisi della spettrometria di massa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riproduttiva, come ad esempio quali sono i cambiamenti fosfoproteomici quando gli spermatozoi attraversano gli EPI o durante la capacitazione.

Sebbene questo metodo abbia fornito una visione della biologia degli spermatozoi, può essere applicato anche a organismi modello, studi su malattie come il cancro, patologie neurologiche e vie generali di trasduzione del segnale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto è difficile determinare l'anatomia delle aree in cui verranno manipolati gli EPI. Inizia preparando 200 millilitri di soluzione per gambo di lavoro Biggers, Whitten and Whitten o BWW aggiungendo quanto segue a un litro di acqua Milli Q per creare una cannula.

Utilizzando tubi in polietilene con diametri interni ed esterni rispettivamente di 0,4 millimetri e 1,1 millimetri. Tienilo a fuoco basso finché il tubo non inizia a sciogliersi. Tirare immediatamente le estremità del tubo verso l'esterno per allungarlo, diminuendo così il diametro esterno.

Tagliare il tubo per produrre un restringimento di un'estremità, che consentirà una più facile incannulamento degli S deens. Tagliare l'estremità opposta a circa 15 centimetri. Quindi inserire un ago calibro 30 nell'estremità smussata e collegare una siringa da tre millilitri completamente retratta.

Realizzare un bocchino di aspirazione tagliando un tubo in PE lungo 20 centimetri e inserirlo in un'estremità della cannula. Inserire il supporto del tubo di vetro micro capillare e il micro capillare di vetro. Dopo l'eutanasia di un topo secondo il protocollo di testo, praticare una piccola incisione nello scroto per esporre l'epi.

Quindi usa un paio di orologiai. Numero cinque pinze per estrarre il testicolo e l'epididimo dalla cavità. Tagliare per rimuovere tutto, tranne circa uno o due centimetri, dell'enorme deferenza dal kata epididimo.

Quindi tagliare per rimuovere i dotti EENT prossimali e il tessuto che collega l'epididimo al testicolo e rimuovere l'intero percorso riproduttivo maschile al microscopio da dissezione utilizzando un ingrandimento compreso tra cinque x e 40x. Posiziona uno o due centimetri dell'estremità ristretta della cannula nel campo visivo e usa del nastro adesivo per fissarla con il numero cinque, una pinza da orologiaio. Afferra delicatamente ciascun lato dell'enorme deferenza e tiralo sopra la parte visibile della cannula.

Quindi, con seta trattata intrecciata nera non assorbibile, fare un nodo sicuro attorno al tessuto cannulato utilizzando orologiai. Pinze numero cinque. Afferrare l'estremità distale degli epicidi kata e rimuovere la tunica Eugenia.

Per esporre un singolo tubulo epidermico, esporre delicatamente il tubulo e separarlo per creare un'apertura per il rilascio degli spermatozoi. Quindi, premere delicatamente lo stantuffo della siringa per espellere l'aria nell'enorme deferenza. La pressione causerà l'uscita degli spermatozoi dal tubulo rotto.

Quindi applicare l'aspirazione al boccaglio per aspirare gli spermatozoi nel capillare di vetro. Soffiare delicatamente nel boccaglio o collegare una siringa ed espellere gli spermatozoi dal capillare di vetro in un millilitro di soluzione prebellica B WW. E usa la soluzione per lavare le cellule tre volte per rimuovere eventuali proteine contaminanti.

Dopo aver rimosso il lavaggio finale, congelare lo sperma per un uso successivo o utilizzare il 4% di screpola, due tio urea molare e 50 millimolari di tris pH 7,4 per solubilizzare le proteine incubare per un'ora con vortice intermittente. Quindi centrifugare la soluzione a 10.000 GS per 20 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta per ridurre i legami disolfuro e alchilare le proteine al DTT a una concentrazione finale di 10 millimolari nella soluzione proteica. Agitare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi aggiungere 50 millimolari di IO acetamide al vortice del lisato e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Per precipitare le proteine, combinare un volume di lisato, un volume di metanolo e 0,5 volumi di cloroformio. Dopo aver agitato il campione, farlo girare a 10.000 Gs per due minuti, raccogliere lo strato superiore, lasciando circa due millimetri per evitare di aspirare l'interfaccia.

Dopo aver aggiunto un volume di metanolo, capovolgere delicatamente il tubo e girare di nuovo. Scartare il surnatante e asciugare il pellet all'aria per tre o quattro minuti per effettuare l'arricchimento della tripsina, della digestione e del fosfopeptide. Inizia usando 25 millimolari di bicarbonato di ammonio contenenti un molare di urea.

Per ricostituire la tripsina, combinare F 50 a un rapporto peso/peso di proteine con la tripsina e incubare su un termomiscelatore a 37 gradi Celsius e 700 giri/min durante la notte. Dopo la centrifuga per pellettare il materiale non digerito, trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Utilizzando il tampone DHB preparato secondo il protocollo di testo, diluire i peptidi inizzati di prova dieci volte e applicarlo a 200 microgrammi di perle di biossido di titanio secche incubare su un rotatore per un'ora a temperatura ambiente dopo l'incubazione, utilizzare il tampone DHB per lavare il campione ancora una volta prima di utilizzare il tampone di lavaggio costituito da 80% A CN e 2% TFA per lavare il campione tre volte dopo la centrifugazione finale eluire i peptidi fosfo mediante Aggiunta del 2,5% di idrossido di ammonio subito dopo la filatura e la raccolta del surnatante.

Utilizzare 0,3 microlitri di acido formico per acidificare il campione come si vede qui. Un vantaggio di questo protocollo è che gli spermatozoi sono isolati. In uno stato quiescente, molte cellule si aggregano subito dopo l'espulsione nel terreno B WW.

Tuttavia, dopo 10 minuti, diventano modali e la soluzione diventa omogenea. La preparazione descritta in questo video produce tipicamente 200 volte 10 per i sei zoa. Questa figura dimostra la purezza degli spermatozoi del ratto AR Cota epididymus.

Uno dei problemi principali relativi alla preparazione del campione è la resa dei viaggi e della digestione. A differenza della precipitazione del TCA, che spesso richiede la regolazione del pH del campione, la precipitazione del cloroformio fenolo è rapida e non acidifica. Il campione mostrato qui è il pellet proteico tipicamente visto da 100 microgrammi di campione tra l'interfaccia inferiore e quella superiore. Ecco la riproducibilità di questo protocollo.

Le striature blu che appaiono nel tempo sono peptidi che alludono a una nanocolonna C 18. All'aumentare della concentrazione di acetonitrile nella popolazione modale, c'è un cluster peptidico a circa 651,5 Dalton che è completamente assente nel non intervallo. Una volta che il protocollo di arricchimento del peptide fosfato è una tecnica efficiente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la preparazione del campione è un aspetto chiave per ottenere risultati riproducibili per la proteomica. Questo metodo può essere adattato per isolare glicoproteine, che possono essere utilizzate per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali proteine subiscono un cambiamento nel contenuto di acido sico del loro proteoma.