Un modello di topo per patogeni indotta infiammazione cronica a siti locali e sistemici

L'obiettivo generale del seguente protocollo è quello di esaminare gli effetti dell'infezione microbica sull'infiammazione cronica in vivo utilizzando un modello animale fisiologicamente rilevante. Ciò si ottiene infettando per via orale i topi con porphyromonas gingivalis per indurre un'infiammazione cronica locale e sistemica. La risonanza magnetica può quindi essere utilizzata per misurare la progressione dell'infiammazione sistemica negli animali vivi, mentre la perdita ossea infiammatoria locale viene valutata mediante micro TC e le placche aterosclerotiche possono essere visualizzate mediante colorazione lipidica sul viso dopo il sacrificio.

In definitiva, le differenze nel volume dell'osso alveolare e l'accumulo di placche aterosclerotiche tra topi infetti da P gingivalis e controlli non infetti possono essere misurate rispettivamente sulla base dell'analisi micro CT e della colorazione lipidica del viso. Il principale vantaggio del nostro modello animale è che consente di esaminare sia l'ospite che i meccanismi patogeni coinvolti nell'infiammazione cronica e in particolare in siti distanti dall'infezione. Quindi puoi guardare i siti sistemici e i siti locali di infezione utilizzando topi transgenici e mutanti batterici definiti.

Questo modello può aiutare a identificare gli aspetti chiave della patogenesi, come l'ospite e i fattori microbici che contribuiscono alla malattia. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi specifici dell'ospite e dei patogeni coinvolti nella perdita ossea infiammatoria e nell'aterosclerosi, può anche essere adattato per altri modelli murini di malattia, tra cui l'artrite reumatoide, il diabete e il cancro. Questa è la struttura centrale per la risonanza magnetica ad alto campo per l'Università di Boston, e il mio collega post-dottorato Ning dimostrerà gli aspetti dell'imaging dei topi. Iniziare strisciando gambi congelati di pesco gengivalelis 3 81 su piastre di agar sanguigno anaerobico e incubare le piastre in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius.

Dopo tre o cinque giorni, utilizzare gli organismi cresciuti in piastra per inoculare colture liquide da cinque millilitri di brodo per infusione di cuore cerebrale, o BHI. Dopo la crescita notturna, trasferire le colture a 45 millilitri di BHI e incubare le colture in modo anaerobico per altre 18-24 ore. A metà della fase logaritmica, raccogliere i batteri mediante centrifugazione per 10 minuti a 7.000 GS e temperatura ambiente, quindi risospendere accuratamente il pellet in cinque millilitri di PBS con una pipetta sierologica dopo aver lavato il pellet tre volte in 50 millilitri di PBS Resus, il pellet in PBS in modo tale che una diluizione da uno a 10 della coltura abbia una densità ottica di 1,0 a 660 nanometri.

Quindi estrarre una quantità sufficiente di carbossimetilcellulosa a media viscosità per ottenere una soluzione del 2% in peso in volume e aggiungere lentamente l'etilcellulosa carbox alla sospensione batterica mentre si agita per evitare la formazione di grumi. Per misurare la progressione dell'infiammazione in C due. Per prima cosa posizionare un supporto per animali con la testa del mouse in posizione supina in una sonda verticale da 30 millimetri e nel foro verticale di uno scanner TMRI 11.7.

Dopo i processi di oscillazione e spessorimento, utilizzare una sequenza rara per acquisire immagini scout lungo tre orientamenti ortogonali per creare immagini coronali e sagittali assiali. Quindi, dopo aver utilizzato l'angiografia a risonanza magnetica a bassa risoluzione per confermare che le immagini acquisite si trovano all'interno della regione target, eseguire un'angiografia a risonanza magnetica ad alta risoluzione dell'arteria innominata con una sequenza di eco gradiente 3D non ungata utilizzando i seguenti parametri. Uno spessore della lastra di 1,5 centimetri, un angolo di inversione di 45 gradi, un tempo di ripetizione di 20 millisecondi, un tempo di eco di 2,2 millisecondi, un campo visivo di 1,5 x 1,5 x 1,5 centimetri, una matrice di 1 28 x 1 28 x 1 28 e un numero della media di quattro per un tempo di scansione totale di circa 22 minuti.

Quindi selezionare un'immagine assiale dell'arteria denominata da 0,3 a 0,5 millimetri sotto la biforcazione succlavia per l'analisi ROI Per bloccare l'aorta, mantenendo il tessuto coperto di PBS in ogni momento. Inizia posando l'aorta in posizione anatomica con i bulbi dell'aorta a sinistra. Quindi posizionare i perni temporanei consecutivamente nelle seguenti cinque posizioni, la parte superiore dell'aorta sotto il terzo ramo dell'arco, a metà dell'aorta discendente vicino all'estremità inferiore dell'aorta discendente e sopra il ramo dell'arteria femorale.

Quindi, usa le forbici a molla extra fini per tagliare il lato sinistro dell'aorta partendo dal ramo sinistro dell'arteria femorale fino a sotto il ramo più basso dell'aorta ascendente. Quindi, dopo aver tagliato e appuntato ogni ramo per esporne la superficie interna, continua a appuntare il tessuto. L'intera superficie interna è esposta e ben visibile dall'alto e priva di interferenze visive da parte dei perni.

Per colorare i lipidi e quantificare le lesioni, iniziare coprendo l'aorta appuntata con una soluzione di Sudan four o O rosso olio appena preparata. Dopo 50 minuti, lavare il fazzoletto con isopropanolo al 70% per uno-cinque minuti, quindi sciacquare delicatamente l'aorta con acqua distillata doppia fino a quando l'acqua che fuoriesce dal tessuto non è più rossa. Quindi, coprire l'aorta con PBS e posizionare un righello accanto al tessuto per facilitare la calibrazione dell'immagine.

Quindi acquisisci le immagini del tessuto con la fotocamera ad alta risoluzione collegata a un microscopio da dissezione, salvando le immagini come file TIFF. Infine, nel software di analisi delle immagini tracciate manualmente ogni superficie intimale per determinarne l'area. Quindi, per calcolare l'area della lesione utilizzando la soglia di colore automatizzata, impostare una soglia per ogni immagine per definire un'intensità di colore che discrimina le lesioni dalle aree normali.

La percentuale della superficie intimale coperta da lesioni aterosclerotiche può quindi essere calcolata in questo esperimento rappresentativo con topi infetti da p gengivale. L'analisi volumetrica ha rivelato che i topi infetti mostrano una significativa perdita ossea rispetto ai controlli non infetti. L'ispezione visiva della mascella Hemi ricostruita illustra un aumento della superficie esposta delle radici molari nei topi infetti rispetto ai controlli inclini all'aterosclerosi.

Un topo carente di POE. La P gengivale induce un'infiammazione cronica che determina la perdita di osso alveolare e la deposizione di placche infiammatorie all'interno del seno aortico e di un'arteria nominata già 24 ore dopo l'ultima infezione, che può essere monitorata nei topi vivi mediante risonanza magnetica seriale in vivo, risonanza magnetica in vari punti temporali dopo l'infezione come in queste immagini rappresentative. Inoltre, le misurazioni del viso dell'aorta a quattro macchie Sudan dimostrano che l'infezione da p gengivale aumenta significativamente la deposizione di lipidi e le aree lesionali sulla superficie intimale.

Inoltre, l'analisi immunoistochimica delle lesioni del seno aortico rivela un aumento dell'infiltrazione dei microfagi e un'elevata espressione del recettore immunitario innato toll-like recettore due IV nei topi infetti da IV. Durante il tentativo di questa procedura, è importante considerare che i punti temporali della durata sperimentale in cui viene valutata l'infiammazione dovrebbero allinearsi in modo appropriato con la progressione della malattia. Dopo l'imaging RM di altri, è possibile eseguire altri metodi come la posizione eretta del viso o l'istochimica immunitaria per rispondere a ulteriori domande come il carico aterosclerotico globale o i componenti cellulari della lesione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di un modello murino in vivo, che ti consente di esaminare sia l'ospite che i fattori patogeni coinvolti nell'infiammazione cronica. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso corretto dei DPI.