Il polmone bovino in ricerca biomedica: Visivamente guidata broncoscopia, intrabronchiale Semina ed

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare le interazioni tra ospite e patogeno in un modello bovino di infezione respiratoria. Questo viene ottenuto inducendo un'infezione respiratoria nei vitelli mediante inoculazione intrabronchiale con il patogeno di interesse durante il decorso della malattia. L'animale viene campionato ripetutamente mediante lavaggio broncoalveolare.

In seguito vengono prelevati spazzolamenti bronchiali e biopsie polmonari transbronchiali per recuperare rispettivamente cellule epiteliali e campioni di tessuto alveolare o polmonare. In definitiva, è possibile confermare una malattia respiratoria specifica per il patogeno, ad esempio, mediante alterazioni infiammatorie nel lavaggio, citologia e rilevamento immunohistochimico del patogeno. Nelle biopsie polmonari transbronchiali è Il principale vantaggio di questo modello animale di grandi dimensioni rispetto ad altri modelli animali esistenti e ai roditori consiste nel fatto che, nel nostro modello, siamo in grado di studiare l'andamento della malattia per un lungo periodo di tempo nello stesso individuo attraverso campionamenti ripetuti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni tra patogeno e ospite in vivo, può essere applicato anche ad altri sistemi, come patogeni alternativi o specie ospiti diverse. La gestione dell'anestesia e l'assistenza durante il campionamento saranno effettuate da una biologa ittiologa, che è una veterinaria del nostro laboratorio. Prima di iniziare la procedura, riempire tre siringhe con uno, due e cinque millilitri dell'inoculo.

Quindi, dopo aver confermato l'anestesia, estrarre la lingua dell'animale e distendere il collo. Successivamente, utilizzando lievi movimenti rotatori, inserire un espansore metallico nella bocca del vitello. Spingere in avanti l'espansore sotto controllo visivo, usando una torcia elettrica per determinare il momento in cui la laringe diventa visibile.

In seguito, inserire un tubo in teflon nel canale operativo di un endoscopio. Il tubo non deve sporgere dalla punta dell'endoscopio. Inserire l'endoscopio attraverso lo specillo.

Potrebbero essere necessari lievi aggiustamenti dello speculum per consentire il passaggio dell'endoscopio. Per superare la laringe, utilizzare la trachea bronchiale, che si dirama sul lato destro del polmone, al fine di allineare correttamente l'immagine sul monitor. Successivamente, collegare la siringa contenente cinque millilitri di inocolo all'estremità del tubo in teflon.

Introdurre il tubo nei rami in cui verrà depositato l'inoculo ed applicare la quantità appropriata di inoculo. Successivamente, collegare la siringa contenente un millilitro di inoculo al tubo. Procedere fino al bronco tracheale e depositare l'inoculo nel ramo coddle.

Rimuovere l'endoscopio e il speculum. Quindi collegare la siringa finale a un attuatore e spruzzare un millilitro dell'inoculo in ciascuna narice. Riposizionare l'animale nel suo box in posizione prona per il risveglio.

Il ricovero deve essere climatizzato. Poiché l'abilità dell'animale nella termoregolazione è ridotta sotto anestesia generale, per raccogliere campioni della valvola al momento desiderato riscaldare cinque siringhe, ciascuna contenente 20 millilitri di soluzione salina sterile isotonica, in un bagno d'acqua a 38 gradi Celsius. Successivamente inserire un catetere per lavaggio nel canale operativo dell'endoscopio e introdurre l'endoscopio nel cono metallico.

Successivamente, procedere in avanti nel bronco principale del polmone sinistro fino a raggiungere la posizione a cuneo, dove l'endoscopio non può essere spinto ulteriormente. Quindi, uno alla volta, collegare le siringhe contenenti la soluzione di cloruro di sodio calda al catetere per la lavanda, per instillare e aspirare direttamente il liquido.

Conservare il liquido di lavaggio broncoalveolare in bottiglie di vetro silanizzato su ghiaccio immediatamente dopo il recupero, per evitare che i macrofagi alveolari si attacchino alla superficie di vetro. Annotare sia la quantità di soluzione salina instillata sia la quantità di liquido recuperato. Successivamente, rimuovere il catetere di lavaggio dal canale operativo per raccogliere le cellule epiteliali.

Successivamente, portare l'endoscopio alla posizione desiderata per il campionamento. Ad esempio, in questo esperimento, alla biforcazione della trachea; quando l'endoscopio è in posizione, coprire un pennello bronchiale con il tubo ed inserirlo nel canale operativo dell'endoscopio finché la punta del pennello non appare sul monitor. Spingere in avanti il pennello e il tubo di plastica di circa cinque centimetri.

Quindi spingere l'impugnatura del pennello per estrarlo dal tubo di plastica. Una volta che il pennello è in posizione, guidarlo verso la zona da spazzolare. Successivamente, spingere e tirare delicatamente il pennello avanti e indietro mentre si manovra l'endoscopio.

Per garantire il contatto tra lo spazzolino e la parete del bronco al fine di prelevare le cellule epiteliali. Interrompere lo sfregamento in caso di sanguinamento. Quindi ricoprire lo spazzolino con il tubo ed estrarlo dal canale di lavoro.

Fare rotolare delicatamente le setole rivestite di cellule epiteliali su fino a cinque vetrini e fissare gli strisci in metanolo freddo per 10 minuti. Dopo aver lasciato asciugare i vetrini all'aria, conservarli a meno 20 gradi Celsius per eseguire una biopsia polmonare transbronchiale. Successivamente, portare l'endoscopio alla posizione desiderata per il campionamento.

Ad esempio, la pars Alis delle LOAs crans in questo esperimento, prima di inserire la pinza bioptica nel canale di lavoro, aprirla e chiuderla alcune volte per verificarne il corretto funzionamento, quindi spingere la pinza nel ramo coddle della trachea bronchiale fino a quando si avverte una leggera resistenza. A questo punto, ritirare la pinza di due o tre centimetri e aprirla. Spingere nuovamente la pinza in avanti, di circa due centimetri, quindi chiuderla.

Ritirare ed estrarre la pinza dal canale operativo. Utilizzare un ago per rimuovere con attenzione il tessuto dalla pinza bioptica e conservarlo in un adeguato mezzo di fissazione per prevenire la formazione di processi autolitici. Infine, dopo aver permesso al vitello di riprendersi nel suo box, monitorare nuovamente l'animale per la presenza di pneumotorace nelle successive 24 ore, fornendo cibo e acqua fresca.

Quando l'animale ha ripreso pienamente conoscenza, sezioni congelate di biopsie polmonari transbronchiali possono essere colorate mediante immunohistochemica. Per visualizzare il patogeno inoculato, osservare le inclusioni brune di clamidia nel polmone di questo animale, che è stato inoculato con Chlamydia C quattro giorni prima del prelievo. La colorazione immunohistochemica delle cellule del lavaggio consente la visualizzazione di patogeni intracellulari.

Ad esempio, in questa immagine, si osservano inclusioni clamidiali nei macrofagi alveolari prelevati da un vitello. Nove giorni dopo l'inoculazione intrabronchiale con Chlamydia, è possibile osservare CTAC. Le cellule del lavaggio broncoalveolare possono essere differenziate mediante colorazione citologica.

I macrofagi alveolari sono il tipo cellulare predominante nel liquido di lavaggio. Tuttavia, il numero di granulociti neutrofili aumenta in presenza di processi infiammatori. Una volta acquisita la tecnica, l'inoculazione può essere eseguita in 10-15 minuti e il campionamento in 20-30 minuti, se effettuato correttamente.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'inoculazione intrabronchiale nei vitelli e di come prelevare il liquido broncoalveolare, i tamponi bronchiali e i biopsie polmonari transbronchiali nell'animale anestetizzato.