Dimostrazione di Proteolytic attivazione della epiteliale di sodio Channel (ENAC), combinando misure di corrente con rilevamento di Decolleté Frammenti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare l'effetto delle proteasi sul canale del sodio epiteliale, o ENaC, espresso in modo eterologo in ovociti di *Xenopus laevis*. Questo viene ottenuto misurando innanzitutto la corrente amiloride-sensibile dell'intera cellula in un ovocita. Dopo aver lasciato riposare l'ovocita, questo viene esposto alla proteasi e la corrente viene misurata nuovamente.

Successivamente, in parallelo, gli oociti vengono biotinilati e sottoposti a western blotting per monitorare la comparsa di frammenti di scissione di gamma ENaC sulla superficie cellulare; i risultati ottenuti dimostrano un legame causale tra la scissione del canale e la sua attivazione, sulla base di una combinazione della tecnica di voltage clamp a due elettrodi e dell'approccio con biotina. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la misurazione non pianificata, è che la cellula può essere esposta a proteasi o ad altri agenti farmacologici tra le due misurazioni per un periodo di tempo variabile in un piccolo volume di soluzione di prova. Due giorni dopo l'isolamento degli oociti e l'iniezione con CN secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare ND 96 per riempire una siringa di un sistema di perfusione a gravità e ND 96 contenente ammide per riempire una seconda siringa.

Dopo aver montato le siringhe a 50 centimetri sopra la camera del bagno, accendere una sorgente luminosa alogena fredda da 150 watt e regolarla a 10 centimetri sopra la camera del bagno per ovociti, consentendo una buona visualizzazione con il microscopio binoculare; accendere quindi l'aspirazione e posizionare il tubo di aspirazione opposto all'adattatore del tubo di superfusione nella camera del bagno per ovociti. Successivamente, utilizzando il dispositivo di controllo del flusso per gravità endovenoso, regolare la velocità di superfusione di ogni soluzione da tre a cinque millilitri al minuto. Quindi, mediante un adattatore, collegare i tubi di superfusione alla camera del bagno per ovociti utilizzando capillari di vetro polarizzati con micropipetta per ottenere diametri delle punte inferiori a un micrometro.

Quindi utilizzare cloruro di potassio 3 M per riempirli fino a circa un quarto della loro capacità. Inserire i capillari nei supporti degli elettrodi per l'elettrodo di corrente e quello di tensione e, mediante l'uso di micromanipolatori, posizionarli nella soluzione di ND 96 contenente ammide a 2 µM. Per misurare le correnti totali cellulari sensibili all'ammide, iniziare regolando il pulsante di compensazione del VM a zero per azzerare il potenziale dell'elettrodo di tensione e il pulsante di compensazione del VE a zero per azzerare l'elettrodo di corrente.

Posizionare un sito dell'uretra ostruttiva (UO) nella camera del bagno e in prossimità dell'elettrodo di rilevamento della tensione. Quindi, utilizzando entrambi i microelettrodi, penetrare delicatamente il sito UO, impostare il potenziale di mantenimento dell'amplificatore a meno 60 millivolt e accendere il registratore grafico. Successivamente, attivare la soluzione contenente l'amide.

Successivamente, inizia la registrazione e, se necessario, regola il guadagno. Una volta che la corrente misurata raggiunge un plateau stabile, passa alla soluzione priva di ammide. Quando viene raggiunto un nuovo plateau di corrente, riporta la perfusione alla soluzione contenente ammide. Poi, quando la corrente del sito UO ritorna al valore iniziale di baseline, spegni il voltage clamp ed estrai delicatamente gli elettrodi per consentire il resealing della membrana plasmatica nei siti di impalamento.

Posizionare il sito Uoc in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente da 100 a 150 microlitri di soluzione ND 96 priva di proteasi per cinque minuti prima di trasferire il sito UOC in una soluzione contenente proteasi o in una soluzione controllo senza proteasi. Dopo l'incubazione, ripetere la misurazione della corrente per 30 minuti, scartare gli oociti difettosi al microscopio stereoscopico e preparare l'anti 96 con e senza la proteasi appropriata. Preparare le pipette Pasteur etichettandole e passando brevemente le punte alla fiamma per evitare danni agli oociti.

Riempire ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con 2,5 millilitri di ND 96 a temperatura ambiente o ND 96 contenente una proteasi. Quindi aggiungere 30 oociti per pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aggiunto 2,5 millilitri di ND 96 nei pozzetti di una nuova piastra a sei pozzetti, trasferire ogni gruppo di oociti in un pozzetto riempito con ND 96.

Spostare le cellule sequenzialmente in altre due pozzette con ND 96 per rimuovere qualsiasi proteasi residua e incubarle nella pozzetta finale per cinque minuti; preparare la biotina nel buffer di eluizione della biotina seguendo il protocollo indicato nel testo. Dopo aver posizionato ciascun gruppo di ovociti in una pozzetta contenente 2,5 millilitri di buffer di eluizione della biotina, incubare per 15 minuti con agitazione delicata. Successivamente, dopo aver posizionato ciascun gruppo di ovociti in una pozzetta contenente 2,5 millilitri di buffer di arresto per interrompere la reazione della biotina, trasferirli in una seconda pozzetta di buffer di arresto e incubare per cinque minuti.

Con un'agitazione delicata, trasferire ogni gruppo di ovociti in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e, utilizzando un millilitro di buffer di lisi, integrato con inibitori delle proteasi, lisare gli ovociti facendoli passare attraverso un ago da 27 gauge. Centrifugare i lisati per 10 minuti a 1500 × g. Trasferire il sopranatante in una nuova provetta da 1,5 millilitro contenente TRITON X-100 e MP-40, e incubare le provette sul ghiaccio per 20 minuti. Dopo aver equilibrato 100 microlitri di perle di agarosio per ogni gruppo di ovociti, aggiungerli alle soluzioni proteiche contenenti detergente, ripetutamente vorticosando le provette per sciogliere le proteine, e incubare i campioni con rotazione overhead a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, centrifugare i campioni per tre minuti a 1500 ×g. Quindi trasferire il soprannatante in un nuovo tubo per rilevare i frammenti di attivazione clivati sulla superficie cellulare. Riparare i campioni del gel utilizzando tampone di lisi per lavare le perle tre volte prima di aggiungere il tampone campione 2× SDS-PAGE. Dopo aver centrifugato i campioni per tre minuti a 20.000 ×g, pipettare il soprannatante in nuovi tubi microcentrifuga.

Analizzare i campioni mediante western blot secondo il protocollo descritto nel testo per verificare se la serina proteasi plasmina possa attivare le correnti mediate da ENaC. La ΔIE di singole cellule esprimenti ENaC è stata determinata prima e dopo un'incubazione di 30 minuti delle cellule in soluzione priva di proteasi o contenente plasmina. Utilizzando la tecnica del voltage clamp a due elettrodi qui mostrata, l'esposizione alla plasmina ha aumentato la ΔIE in tutte le cellule misurate.

Al contrario, l'incubazione in soluzione priva di proteasi ha avuto un effetto trascurabile. Questa figura confronta l'effetto della chi-tripsina sul canale ENaC di tipo selvaggio e su ENaC con siti di scissione della prostasina e del plasmina mutati. Come si osserva qui, il canale mutante ritarda e riduce l'attivazione della corrente mediata da ENaC indotta dalla chi-tripsina.

Inoltre, genera un frammento di scissione a un tasso ridotto rispetto all'ENaC di tipo selvaggio. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come una combinazione dei metodi descritti possa essere utilizzata per correlare l'effetto stimolatorio delle proteasi sull'attivazione interna con la presenza di prodotti di scissione sulla superficie cellulare. Questo può risultare utile per un'ampia gamma di applicazioni, ad esempio per affrontare domande simili riguardo alla regolazione di altri canali ionici, trasportatori o recettori transmembrana.