Name: Costruzione e caratterizzazione di un Fold bioreattore Novel Vocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Esplora la costruzione di un bioreattore vibrante per studiare l'effetto della stimolazione meccanica sulle cellule staminali mesenchimali. Questo metodo replica le condizioni fisiologiche della fonazione per analizzare le risposte cellulari a livello proteico e trascrizionale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il Dr. Jeffrey Caplan per la sua formazione e consulenza su confocale. Ringraziamo anche il Keck Electron Microscopy Lab e il Dr. Chaoying Ni per l&#39;assistenza SEM. Questo lavoro è finanziato dal National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 e R01DC011377). ABZ riconosce NSF Integrativa Graduate Education &amp; Research tirocinio programma (IGERT) per il finanziamento.

Bioreattore Assembly 1. (Video 1) <ol><li> Effettuare uno stampo di alluminio (pressofusione circolare + perno distanziale) con pre-determinati dimensioni interne ed esterne (Figura 1). </li><li> Utilizzando lo stampo dal punto 1.1, fabbricare una membrana di silicone (diametro: 42 mm, spessore: 1,5 mm Figura 1) con un manicotto radicata (diametro: 12 mm, spessore ~ 0,25 millimetri, forma dal perno distanziale in figura 1) mezzo utilizzando un kit disponibile in commercio elastomero siliconico. </li><li> Effettuare una coppia di blocchi acrilici (Figura 2 (4, 5)) con un foro circolare (diametro: 24 mm) al centro, incidere la parte superiore (spessore 1,8 centimetri) e inferiore (spessore 0,9 centimetri) blocchi con nervature ei solchi corrispondenti . 10 </li><li> Panino la membrana di silicone tra i blocchi acrilici associati. Fissare il gruppo con quattro viti d&#39;angolo con un cacciavite coppia di micro impostato su una forza costante (35 cN · m). Come risultato, una tenuta d&#39;acqua, 24 mm di larghezza e 18 mm camera di vibrazione profonda viene creato (Figura 2C). </li><li> Montare un &quot;extended range mini-woofer 3 (Figura 2D, 8 Ω/20 W) sotto la camera di vibrazione attraverso un altro set di viti d&#39;angolo sul blocco acrilico fondo. A questo punto, un singolo modulo vibrazione viene assemblato. </li><li> Replicare sette moduli aggiuntivi vibrazioni. Applicare quattro di loro in uno dei due bar in alluminio fissi (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), ponendo le basi degli altoparlanti a fori circolari equidistanti (diametro: 7 cm, spessore: 2 cm) tagliate a barre. Stabilizzare ciascun diffusore inserendo una vite attraverso il lato della barra di alluminio in ogni foro circolare. </li><li> Controllare singolarmente i diffusori da un selettore speaker. Collegare i singoli diffusori al selettore collegando fili agli ingressi positivo e negativo sul corpo diffusore poi alle uscite corrispondenti sul selettore. Il selettore altoparlante consente al segnale da tegli generatore di funzioni, dopo il passaggio attraverso un amplificatore di potenza, di raggiungere tutti otto altoparlanti contemporaneamente (Figura 2E). </li><li> Posizionare i due array da camera, il selettore speaker ed elettronica associati in un recinto anti-umidità. Casa l&#39;intero gruppo in uno spot coltura cellulare incubatore. </li><li> Far passare i cavi principali (attraverso un tubo in PVC di grado medicale) che collega l&#39;amplificatore di potenza e selettore diffusore attraverso il gruppo filtro posteriore del termostato. </li></ol> 2. Fabrication Scaffold e Caratterizzazione <ol><li> Sciogliere pellet PCL in cloroformio ad una concentrazione del 15% in peso. Caricare la soluzione in una siringa da 10 ml con tappo con un ago smussato-ended 21 G. </li><li> Bloccare la siringa su una pompa a siringa programmabile e impostare la portata a 1 ml / hr. </li><li> Posizionare il collettore foglio di alluminio coperto di fronte l&#39;ago in senso orizzontale, con un ago punta a collettore distanza di ~ 18 cm. </li><li> Bloccare il alli positivogator clip per mezzo dell&#39;ago, e il coccodrillo terra al collettore di alluminio, quindi impostare la tensione dell&#39;alimentatore ad alta tensione a 15 kV. ATTENZIONE: alta tensione, mantenere la distanza dal ago. </li><li> Sequenzialmente accendere la pompa a siringa e alimentazione; rapidamente pulito / rimuovere la soluzione di polimero residuo circonda la punta dell&#39;ago con un tovagliolo di carta asciutto prima getti fibre stabile e Taylor cono 19 sono formate. </li><li> Lasciare le fibre di accumulare sul collettore Al ad uno spessore di 250-300 micron ~ (~ 7 ore sotto le condizioni di filatura correnti). Conservare i ponteggi risultanti in un essiccatore a vuoto per 1-2 giorni per rimuovere qualsiasi solvente residuo. </li><li> Immagine i ponteggi, farfugliare ricoperti di oro, utilizzando un microscopio elettronico a scansione per mostrare fibra morfologia coerente. 10 </li></ol> 3. Assemblea bioreattore e Caratterizzazione <ol><li> Punch un disco cilindrica (diametro 8 mm), con quattro braccia (lunghezza: 2mm) dal tappeto come filato PCL (Figura 2A), utilizzando dapprima a 12 mm di diametro biopsia per tagliare il diametro esterno del disco. Quindi utilizzare un secondo, 8 millimetri biopsia per fare quattro due millimetri lunghi tacche equidistanti attorno alla lama circolare per segnare dove le braccia sono da tagliare. Dopo aver eseguito con il punzone 8 mm utilizzare una lama di bisturi per tagliare i bordi delle braccia verso l&#39;esterno. Inserire il scaffold nella scanalatura della membrana di silicone con le braccia tese (Video 1). Appiattire l&#39;impalcatura inserita premendo delicatamente la superficie con una pinzetta piatta. </li><li> Collegare un piccolo pezzo di sottile foglio di alluminio (8 mm x 2 mm forma ortogonale, Figura 2B) al patibolo PCL per aiutare la riflessione laser. </li><li> Fissare il silicone membrana / scaffold PCL assemblato (come specificato nel punto 1.4), nella camera di vibrazione. Aggiungere 1,5 ml di acqua nella camera per idratare il scaffold PCL prima vibrazione. </li><li> Utilizzando il generatore di funzioni, introdurre segno vibrazioniALS (ad esempio, 200 Hz onde sinusoidali con una tensione picco-picco, Vpp, di 0,1 V) alla camera acrilico sandwich. Utilizzare un voltmetro per misurare con precisione la tensione in ogni ingresso diffusore. Nota: la lettura Vpp dal generatore di funzione diverso dal l&#39;eventuale tensione erogata all&#39;altoparlante. </li><li> Montare l&#39;unico punto LDV e fissare il sensore laser testa in fibra ottica a un treppiede testa pan-tilt. Angle la testa del sensore in modo che sia rivolta perpendicolare al tavolo. Collegare la testa del sensore LDV al modulo di acquisizione dati via cavo coassiale quindi il modulo al portatile tramite USB. </li><li> Focalizzare il fascio laser perpendicolarmente in vari punti predeterminati sulla membrana di silicone (Figura 2B e Figura 3). </li><li> Utilizzando il software di acquisizione dati, registrare lo spostamento intermedio membrana. Fare clic su &quot;Impostazioni di acquisizione&quot; dal menu &quot;Opzioni&quot;; quindi cambiare la modalità di misura a &quot;FFT221;. Quindi, fare clic su &quot;Misura continua&quot; nella barra degli strumenti principale quindi il picco che si forma alla frequenza prescelta (Figura 6D) per registrare lo spostamento. </li><li> Graficamente lo spostamento intermedio membrana normale (w 0) in funzione della posizione relativa sul substrato. Costruire una mappa di colori 3D del profilo di vibratorio superficie con Origin software di analisi dei dati 8.5. </li></ol> 4. Cell Culture vibrante <ol><li> MSC derivate dal midollo osseo sub-cultura umana nei T150 fiasche di coltura tissutale ad una densità di semina iniziale di 4000-5000 cellule / cm 2 in MSC manutenzione media. </li><li> Dopo 7-8 giorni di coltura cellulare (a ~ 85% di confluenza), trypsinize le cellule con un reagente di dissociazione cellulare come accutase, contare con un emocitometro, centrifuga (440 xg per 5 min), e risospendere il pellet cellulare in mezzi freschi manutenzione MSC ad una concentrazione di 4,5 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Immergere la scaffo PCLld in etanolo al 70% O / N. Dopo che il solvente viene evaporato, esporre entrambi i lati del ponteggio per germicida luce UV (254 nm) per 5-8 min. </li><li> Bagnare il scaffold PCL in una soluzione fibronectina 20 ug / ml a 37 ° C per 1 ora. Inserire il scaffold fibronectina rivestite nella membrana di silicone. Montare il bioreattore come descritto al punto 1. </li><li> Distribuire 40 ml di sospensione cellulare uniformemente sulla forca PCL protetto. Permettono alle cellule di attaccarsi per 1-1,5 ore prima di aggiungere un ulteriore 1,5 ml di mezzi freschi alla camera vibrazioni. </li><li> Cultura patibolo PCL MSC-carico statico per 3 giorni e aggiornare il supporto dopo il completamento della cultura statica. </li><li> Imporre regimi di vibrazione selezionati i costrutti cellulari. Nota: Per esempio, le cellule vengono sottoposte ad un 1-hr-1-hr-off (OF) vibrazioni a 200 Hz con aw di 0 ~ 40 pm per 12 ore al giorno per 7 giorni. Costruisce sottoposti a stimoli vibratori sono designati come campioni Vib e quelli culrosso staticamente in camere vibrazioni identiche servono controlli statici (Stat). </li></ol> 5. Valutazioni Biologiche <ol><li> Raccogliere 200 microlitri di cellule di coltura da ciascuna camera ogni altro giorno (giorno 1, 3, 5 e 7) e unire le aliquote dello stesso campione insieme (800 ml ciascuna). </li><li> Quantificare la produzione cellulare di matrice metalloproteinasi-1 (MMP1) e HA utilizzando un kit ELISA MMP1 Sviluppo e acido ialuronico kit ELISA competitivo, rispettivamente seguente procedura dei costruttori. Nel frattempo, saggiare la produzione di precursore solubile elastina seguendo la procedura ELISA precedentemente riportato. 8 </li><li> Al termine dell&#39;ultimo ciclo di vibrazione al giorno 7, rimuovere rapidamente i costrutti cellulari dalle camere vibrazione usando pinzette taglienti e brevemente sciacquare con fosfato freddo salina tamponata (PBS, 4 ° C). </li><li> Per il live colorazione / morto, incubare i costrutti con ioduro di propidio (1:2.000 in PBS) eSyto-13 (1:1000 in PBS) per 5 minuti a temperatura ambiente. Immagine costrutti colorati con un microscopio confocale multiphoton. </li><li> Separatamente, snap-congelare i costrutti cellulari PBS-sciacquati in ghiaccio secco ed estrarre l&#39;RNA cellulare totale seguendo un protocollo riportato in precedenza per l&#39;analisi del gene. 9 </li><li> Verificare la quantità e la qualità del RNA estratto utilizzando un UV-Vis. Campioni di RNA con A260/A280 e A260/A230 rapporti di 1,8-2,2 sono utilizzati per la successiva analisi qPCR. </li><li> Reverse trascrivere RNA (500 ng / campione) in cDNA usando un kit disponibile in commercio trascrizione inversa. </li><li> Eseguire la reazione di PCR su un sistema di rilevamento di sequenze in tempo reale usando una miscela master PCR disponibile in commercio seguendo la procedura precedentemente descritto. 8 </li><li> Analizzare i risultati qPCR utilizzando software commerciale di analisi dei dati qPCR. Per garantire l&#39;affidabilità delle analisi dei dati, più geni di riferimento (YWHAZ, TBP, PPIA) sono impiegati come intcontrolli ernal, e la varianza dei rendimenti specifici di primer viene presa in considerazione. 8 </li></ol>

<ol><li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical-Stress+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Mechanical-Stress in Phonation.</a> J. Voice. 8, 99-105 (1994).</li>
<li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Relation+Between+Subglottal+Pressure+and+Fundamental-Frequency+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation.</a> J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).</li>
<li>Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+the+vocal+folds%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of the vocal folds.</a> Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).</li>
<li>Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+and+rheologic+characterization+of+vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring.</a> J. Voice. 16, 96-104 (2002).</li>
<li>Hansen, J. K., Thibeault, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+and+review+of+the+literature%3A+Vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring.</a> J. Voice. 20, 110-120 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Hanson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Mesenchymal+Stem+Cells+From+Human+Vocal+Fold+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts.</a> Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).</li>
<li>Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+behaviors+of+mesenchymal+stem+cells+via+the+combination+of+high-frequency+vibratory+stimulations+and+fibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds.</a> Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).</li>
<li>Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+Fibroblastic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Via+the+Combination+of+Fibrous+Scaffolds+and+Connective+Tissue+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).</li>
<li>Jones, D. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+place+like+home%3A+anatomy+and+function+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">No place like home: anatomy and function of the stem cell niche.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).</li>
<li>Wang, J. H., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+Adult+and+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+of+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of Adult and Stem Cells.</a> Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).</li>
<li>Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+tensile+culture+promotes+fibroblastic+differentiation+of+marrow+stromal+cells+encapsulated+in+poly+%28ethylene+glycol%29-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).</li>
<li>Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+regulates+the+development+of+engineered+smooth+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).</li>
<li>Webb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+increases+fibroblast+proliferation%2C+matrix+accumulation%2C+and+elastic+modulus+of+fibroblast-seeded+polyurethane+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs.</a> J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Regulation+of+Cartilage+Biosynthetic+Behavior+-+Physical+Stimuli.%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli.</a> Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration+stimulates+vocal+mucosa-like+matrix+expression+by+hydrogel-encapsulated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).</li>
<li>Farran, A. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Characterization+of+a+Dynamic+Vibrational+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).</li>
<li>Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speaking+Fundamental-Frequency+Characteristics+as+a+Function+of+Age+and+Professional%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional.</a> J. Voice. 5, 310-315 (1991).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanotransduction%3A+putting+all+the+pieces+together+again%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again.</a> Faseb J. 20, 811-827 (2006).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Moore, J., Thibeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+Into+the+Role+of+Elastin+in+Vocal+Fold+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease.</a> J. Voice. 26, 269-275 (2012).</li>
<li>Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+protein+alterations+in+rabbit+vocal+fold+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar.</a> J. Voice. 17, 377-383 (2003).</li>
<li>Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+fold+wound+healing%3A+A+review+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Vocal fold wound healing: A review for clinicians.</a> J. Voice. 20, 432-442 (2006).</li>
<li>Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+B%22%5BJournal%5D)">The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).</li>
<li>Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+the+vessel+wall%3A+The+role+of+collagen+and+elastic+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers.</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+Therapies+for+the+Vocal+Fold+Lamina+Propria%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B%3A+Rev%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria.</a> Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).</li>
</ol>

Non esistono interessi finanziari concorrenti.

Ingegneria di successo di tessuti funzionali delle corde vocali in vitro richiede la ricreazione di una piega simile microambiente vocale per mediare i comportamenti di cellule multipotenti. E &#39;generalmente accettato che le strutture dei tessuti o organi riflettono le funzioni che sono chiamati a svolgere. 22 Per i tessuti delle corde vocali, le vibrazioni ad alta frequenza che si verificano durante la fonazione sono proposti per essere importante per la maturazione del tessuto. Nel nostro studio...

La piega vocale umano, composto da uno strato epiteliale, la lamina propria (LP) e il muscolo vocalis, è un tessuto morbido specializzato che converte il flusso d&#39;aria dai polmoni in onde acustiche per la produzione del suono. 1 corde vocali oscillano regolarmente durante la fonazione normale, esibendo ceppi fino al 30% a frequenze fondamentali che vanno 100-300 Hz. 2 Adult corde vocali LP è una struttura composta da un gradiente superficiale (SLP), intermedio (ILP) e una profondità (DLP) strato. Altri gruppi di classificazione l&#39;epitelio e la SLP come lo strato mucosa, e combina la ILP e DLP nel legamento vocale. 3 Lo strato SLP contiene principalmente una matrice amorfa con fibre di collagene scarsamente disperse, mentre il legamento è arricchita con collagene maturo e fibre di elastina per fornire resistenza sufficiente. 4 La struttura e la meccanica di corde vocali neonato variano significativamente dai loro omologhi maturi. Anche se il meccanismos che regolano lo sviluppo delle corde vocali e la maturazione non sono ancora pienamente compresi, evidenze sperimentali ha sottolineato il ruolo di definizione di stress meccanico vocalizzazione-derivati. Diverse condizioni mediche, tra cui l&#39;abuso vocale, infezioni, sostanze chimiche irritanti e procedure chirurgiche, possono danneggiare la piega vocale. Patologie delle corde vocali colpiscono circa 3-9% della popolazione degli Stati Uniti. Metodi di trattamento correnti per i disturbi delle corde vocali sono limitati 5 e un tessuto approccio ingegneristico a base di cellule staminali è emerso come una strategia promettente per il ripristino della funzionalità delle corde vocali. Cellule staminali mesenchimali (MSC) sono una valida alternativa alle corde vocali fibroblasti primari per vocale ingegneria tissutale piega. 6-9 specifica destino delle cellule staminali e lo sviluppo del tessuto successivo sono mediati dalla specifica nicchia risiedono in, cui la condizione meccanica è un fattore vitale. dieci forze meccaniche sono regolatori essenziali di tessuto morfogenesi unnd omeostasi, particolarmente per tessuti che siano periodicamente sottoposti a carico. 11 Da una prospettiva ingegneria dei tessuti, è stato dimostrato che l&#39;esposizione a fisiologicamente rilevanti stimolazioni meccaniche promuove differenziazione delle cellule staminali e tessuto-specifico rimodellamento della matrice. 12-15 Bioreattori coltura tissutale sono progettati per simulare l&#39;ambiente fisiologico desiderato per cellula o tessuto crescita in vitro. Per vocale ingegneria dei tessuti piega, è particolarmente critico per ricreare l&#39;ambiente meccanico delle phonating corde vocali. Una piega ideale bioreattore vocale dovrebbe effettivamente fornire spunti vibranti di cellule in coltura, permettendo il controllo facile su frequenza, ampiezza e la durata delle vibrazioni. Titze e collaboratori hanno realizzato una piega bioreattore vocale (T1 bioreattore) 16 che combina tratto statico ad alta frequenza (20-200 Hz) oscillazioni di stimolare la produzione cellulare di proteine ​​della matrice. Using questo bioreattore, Webb e colleghi 17 hanno studiato gli effetti di 10 giorni, vibrazioni 100 Hz su fibroblasti dermici in coltura in un acido ialuronico (HA) a base di idrogel. Costrutti soggetti a vibrazioni esposte un&#39;elevata espressione di HA sintasi-2 (HAS2), decorin, fibromodulin e matrice metalloproteinasi-1 (MMP1), rispetto ai controlli statici. Gli effetti di stimolazione sono risultate essere dipendente dal tempo. Più di recente, il nostro gruppo 18 montato una piega bioreattore vocale (J1 bioreattore) utilizzando un amplificatore di potenza, un generatore di funzioni, un altoparlante chiuso e una membrana in silicone circonferenzialmente ancorato che trasferisce l&#39;aria oscillante per le cellule attaccate. Fibroblasti prepuzio neonatali coltivate nel bioreattore J1 stati sottoposti a 1 ora di vibrazione a 60, 110 o 300 Hz, con un ceppo in piano fino al 0,05%. I risultati qPCR suggerito che l&#39;espressione di alcuni geni ECM è stata moderatamente alterata in risposta alle varie frequenze vibratoriee ampiezze. Questi disegni bioreattori, mentre intrigante, hanno diverse limitazioni. Ad esempio, il sistema T1 richiede un gran numero di connettori e barre per l&#39;accoppiamento meccanico, limitando le frequenze massima raggiungibile. Inoltre, le cellule possono essere sottoposti a indesiderabile agitazione e fluido meccanica perturbazione che complicano l&#39;interpretazione dei dati. Il bioreattore J1, invece, presenta relativamente bassa efficienza di conversione energetica e non è facile da usare. Inoltre, le vibrazioni si stacca spesso i costrutti cellulari carichi dalla membrana di silicone sottostante. Il J2 vocale piega bioreattore riportato qui, sviluppata sulla base dello stesso principio della versione J1, è ottimizzata per consistenza e riproducibilità. Le vibrazioni-fonazione mimando vengono generati aerodinamicamente in camere dotate di vibrazione individuale, laddove poli fibroso MSC-popolato (ε-caprolattone) (PCL) impalcature sono effectively assicurato. Laser Doppler Vibrometry (LDV) consente all&#39;utente di verificare il profilo vibratorio del gruppo membrana / scaffold. Nella nostra dimostrazione, MSC sono esposti a 200 Hz vibrazioni sinusoidali con (OF) modello 1-hr-1-hr-off per un totale di 12 ore al giorno per 7 giorni. Risposte cellulari agli stimoli vibratori imposte sono indagati sistematicamente. Nel complesso, la piega vocale J2 offre le caratteristiche più user-friendly, che permette studi di coltura cellulare dinamica per essere condotti in un elevato throughput e della moda riproducibile.

<table><tbody><tr><td>Kit elastomero siliconico</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Polimerizzare la membrana a 100 &#176; C per 2 ore</td></tr><tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~80 kDa, dissolvere O/N</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>MSC derivate dal midollo osseo umano</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Ricevuto con passaggio 2</td></tr><tr><td>terreni di mantenimento MSC</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>10% FBS in terreno basale integrato con L-glutammina, gentamicina e amfotericina</td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione cellulare Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 Kit ELISA DuoSet</td><td>R& Kit</td> ELISA D systems <td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&nbsp; K-1200&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp;</td><td>Life Technologies</td> Kit di trascrizione inversa <td>QuantiTect S7575</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Altoparlante di ricambio</td><td>DAYTON audio (tramite Parts Express)</td><td>DS90-8</td><td>Cono di carta, gamma completa (80-13.000 Hz), 85 dB</td></tr><tr><td>Ergo Micro cacciavite dinamometrico</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>Gamma di coppia: 20-120 cN&#183; m</td></tr><tr><td>Selettore altoparlanti stereo</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td> Potenza <td>massima 50 W</td></tr><tr><td>Funzione generatore&nbsp;</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>33220A</td><td>Gamma di frequenza 1 & micro; Amplificatore di potenza Hz-20 MHz</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>PYLE audio</td><td>PylePro PT2400</td><td>Risposta in frequenza: 10 Hz-50 kHz, due canali altoparlante </td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td>Pompa a siringa <td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td></td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore ad alta tensione</td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>Tensione di uscita: 0-30 kV</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione&nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>Scrivania oro sputter coater</td><td>Denton Vacuum</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>Vibrometro laser Doppler&nbsp;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>Misurazione della velocità senza contatto (0-22 kHz)</td></tr><tr><td>Sistema di rilevamento di sequenze PCR&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7300</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale multifotone</td><td>Zeiss Zeiss</td><td>510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-VIS&nbsp;</td><td>Prodotti NanoDrop tramite Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati VibSoft</td> Larghezza di banda di acquisizione <td>Polytec</td><td></td><td>fino a 40 MHz</td></tr><tr><td>Software di analisi dati Origin 8.5</td><td>Software di</td> analisi dati qbasePlus qPCR OriginLab<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>Lega di alluminio&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>Lega 6061</td><td></td></tr><tr><td>Blocchi acrilici</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera antiumidità in policarbonato</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>Resistente agli urti&nbsp; Viti in policarbonato</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cavo elettronico / filo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi in PVC per uso medico</td><td>US Plastic Corp.</td><td>Tygon S-50-HL</td> Siringa da 10 ml <td>trasparente, biocompatibile</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G Ago con estremità smussata</td><td>Piccole parti</td><td>NE-213PL-25</td><td>1-1 / 2 "di lunghezza</td></tr><tr><td>Adattatori a coccodrillo&nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td>Punzone</td></tr> per <tr><td>biopsia da 8 mm</td> completamente isolato<td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx? DepartmentID=10& CategoryID=96">Sklar&nbsp; Strumenti chirurgici</a></td><td>96-1152</td><td>Punzone per biopsia sterile e monouso</td></tr><tr><td>da 12 mm</td><td>Acuderm (tramite Fisher Scientific)</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per colture tissutali</td><td>Corning</td><td></td><td>Coltura cellulare trattata</td></tr></tbody></table>

costruzione e caratterizzazione di un fold bioreattore novel vocal

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

L'ingegneria in vitro di tessuti meccanicamente attivi richiede la presentazione di condizioni meccaniche fisiologicamente rilevanti alle cellule in coltura. Per emulare l'ambiente dinamico delle corde vocali, è stato costruito e caratterizzato un nuovo bioreattore delle corde vocali in grado di produrre stimolazioni vibratorie alle frequenze fondamentali della fonazione. Il dispositivo è composto da un generatore di funzioni, un amplificatore di potenza, un selettore di altoparlanti e camere di vibrazione parallele. Le camere di vibrazione individuali vengono create inserendo una membrana in silicone su misura tra una coppia di blocchi acrilici. La membrana in silicone non solo funge da fondo della camera, ma fornisce anche un meccanismo per fissare l'impalcatura carica di cellule. I segnali di vibrazione, generati da un altoparlante montato sotto il blocco acrilico inferiore, vengono trasmessi aerodinamicamente alla membrana dall'aria oscillante. Otto moduli di vibrazione identici, fissati su due barre metalliche fisse, sono alloggiati in una camera antiumidità per il funzionamento a lungo termine in un incubatore per colture cellulari. Le caratteristiche di vibrazione del bioreattore delle corde vocali vengono analizzate in modo non distruttivo utilizzando un vibrometro laser Doppler (LDV). L'utilità del dispositivo di coltura dinamica è dimostrata dalla coltura di costrutti cellulari in presenza di vibrazioni sinusoidali a 200 Hz con uno spostamento medio della membrana di 40 μm. Le cellule staminali mesenchimali coltivate nel bioreattore rispondono ai segnali vibratori alterando la sintesi e la degradazione dei componenti della matrice extracellulare rilevanti per le corde vocali. Il nuovo sistema di bioreattore qui presentato offre un'eccellente piattaforma in vitro per lo studio della meccanotrasduzione indotta da vibrazioni e per l'ingegnerizzazione di tessuti funzionali delle corde vocali.

Le impalcature PCL fabbricati da elettrofilatura contengono pori interstiziali dimensioni micron e fibre aggrovigliate in modo casuale, con un diametro medio di 4,7 micron (Figura 4A). Con un ingrandimento maggiore, scanalature e nanoscala pori sono visibili su singole fibre (Figura 4B). Rivestimento dei ponteggi con fibronectina migliora idrofilia e facilita l&#39;adesione iniziale delle cellule / diffusione sul patibolo PCL (osservazione inedito). Forme d&...

Viene costruito e caratterizzato un nuovo bioreattore delle corde vocali in grado di fornire una stimolazione vibratoria fisiologicamente rilevante alle cellule in coltura. Questo dispositivo di coltura dinamico, se combinato con un'impalcatura fibrosa in poli(ε-caprolattone), crea un ambiente mimetico delle pieghe vocali che modula i comportamenti delle cellule staminali mesenchimali.

Costruzione e caratterizzazione di un Fold bioreattore Novel Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare l'effetto della stimolazione vibratoria sulle cellule staminali mesenchimali utilizzando un bioreattore progettato per emulare la fonazione. Questo viene ottenuto creando impalcature di poli epsilon Caprolattone per fornire un substrato tridimensionale per colture cellulari simile al legamento vocale. Come secondo passaggio, le impalcature vengono incorporate in membrane di silicone, che facilitano la trasduzione dell'oscillazione ai costrutti cellulari.Successivamente, viene utilizzato un vibrometro laser Doppler per determinare le caratteristiche vibratori di ciascuna combinazione di scaffold membranoso. Infine, possono essere eseguite analisi EISA e R-T-P-C-R quantitative per valutare le risposte cellulari a livello proteico e traduzionale. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della laringologia, come ad esempio il modo in cui si sviluppa la piega vocale e le conseguenze dell'uso improprio della voce.Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento dei disturbi delle corde vocali grazie al livello di controllo cellulare ora possibile con questo metodo per fabbricare l'impalcatura: sciogliere prima le pastiglie di PCL nel cloroformio a una concentrazione del 15 percento in peso. Successivamente, caricare la soluzione ottenuta in una siringa da 10 millilitri munita di un ago da 21 gauge a punta ottusa. Fissare la siringa a una pompa per siringa programmabile e impostare la portata a un millilitro all'ora.Quindi posizionare un collettore ricoperto di foglio di alluminio in posizione orizzontale rispetto all'ago, con una distanza tra la punta dell'ago e il collettore di circa 18 centimetri. Successivamente, fissare una clip positiva a coccodrillo nella parte centrale dell'ago e collegare a massa la clip verso il collettore. Impostare la tensione dell'alimentatore ad alta tensione a 15 kilovolt, avendo cura di mantenere le distanze dall'ago.Quindi accendere la pompa per siringa e l'alimentatore. Utilizzare un tovagliolo di carta asciutto per rimuovere rapidamente la soluzione polimerica residua attorno alla punta dell'ago prima che si formi un getto di fibra stabile e un cono regolabile, permettendo alle fibre di accumularsi sul collettore di alluminio per circa sette ore fino a uno spessore di 250-300 micrometri; successivamente conservare le scaffalature ottenute in un essiccatore sotto vuoto per uno o due giorni per rimuovere qualsiasi solvente residuo. Le scaffalature in PCL conterranno pori interstiziali di dimensioni micrometriche e fibre casualmente intrecciate con un diametro medio di circa 4,7 micrometri.In un'immagine a maggiore ingrandimento, saranno visibili solchi e pori su scala nanometrica sulle singole fibre che compongono il bioreattore. Utilizzare innanzitutto una punta per biopsia di 12 millimetri di diametro per tagliare il diametro esterno di un disco circolare di otto millimetri da un materassino di PCL appena elettrofilato. Successivamente, utilizzare una seconda punta per biopsia di otto millimetri per segnare i punti in cui devono essere effettuati i tagli dei bracci.Dopo aver effettuato i tagli, utilizzare una lama di bisturi per tagliare i bordi dei bracci verso l'esterno e inserire l'impalcatura nella scanalatura della membrana in silicone attraverso i bracci estesi. Appiattire l'impalcatura inserita premendo delicatamente la superficie con pinze a punta piatta, quindi applicare un pezzo di foglio di alluminio sottile di otto millimetri per due millimetri sull'impalcatura in PCL. Per facilitare la riflessione del laser, fissare l'impalcatura in PCL montata sulla membrana in silicone all'interno della camera di vibrazione.Quindi inserire la membrana in silicone tra due blocchi in acrilico accoppiati. Fissare l'insieme con quattro viti d'angolo utilizzando un cacciavite a coppia microscopica regolato su una forza costante di 35 centinewton metri, creando una camera di vibrazione stagna larga 24 millimetri e profonda 18 millimetri. Successivamente, montare un mini woofer a gamma estesa con supporto a tre piedi sotto la camera di vibrazione attraverso un altro set di viti d'angolo sul blocco in acrilico inferiore, completando così l'assemblaggio di un singolo modulo di vibrazione.Dopo aver replicato altri sette moduli di vibrazione, fissare quattro di questi moduli a una delle due barre di alluminio fisse posizionando le basi degli altoparlanti in fori circolari equidistanti ricavati nelle barre. Fissare saldamente ciascun altoparlante inserendo una vite lateralmente nella barra di alluminio, all'interno di ciascun foro circolare. Successivamente, collegare gli altoparlanti singoli al selettore attaccando dei fili ai terminali positivo e negativo del corpo dell'altoparlante e alle uscite corrispondenti sul selettore.Il selettore degli altoparlanti permette al segnale del generatore di funzione, dopo essere passato attraverso un amplificatore di potenza, di raggiungere tutti e otto gli altoparlanti contemporaneamente. Posizionare quindi i due gruppi di camere, il selettore degli altoparlanti e l'elettronica associata all'interno di un contenitore anti-umidità, alloggiando l'intero sistema in un incubatore commerciale per colture cellulari. Far passare i cavi principali attraverso un pezzo di tubo in PVC di grado medico e collegare l'amplificatore di potenza e il selettore degli altoparlanti attraverso l'insieme filtro situato sul retro dell'incubatore.Per caratterizzare inizialmente il bioreattore, aggiungere 1,5 millilitri di acqua nella camera di vibrazione per idratare l’impalcatura in PCL prima della vibrazione. Quindi, utilizzando il generatore di funzioni, applicare segnali di vibrazione alla camera in acrilico assemblata. Utilizzare un voltmetro con precisione.Misurare la tensione in corrispondenza di ciascun ingresso dell'altoparlante, quindi assemblare il vibrometro laser doppler a punto singolo. Fissare il sensore laser a fibra ottica. Portarsi verso un treppiede con testa orientabile e posizionare il sensore in modo che sia rivolto perpendicolarmente al piano del tavolo.Quindi collegare la testa del sensore al modulo di acquisizione dati tramite un cavo coassiale e il modulo a un laptop tramite la porta USB. Orientare il fascio laser perpendicolarmente su diversi punti predeterminati della membrana in silicone, quindi utilizzando il software di acquisizione dati, fare clic su impostazioni di acquisizione dal menu delle opzioni. Successivamente, modificare la modalità di misurazione in FFT e quindi fare clic sullo strumento di misurazione continua nella barra degli strumenti principale.Fare clic sul picco che si forma alla frequenza scelta per registrare lo spostamento e tracciare lo spostamento medio normale della membrana in funzione della posizione relativa rispetto al substrato. Per impostare una coltura cellulare vibrante, prima di tutto sottocolturare cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano in fiaschi da coltura tissutale T150 a una densità iniziale di semina di quattro-cinque volte 10³ cellule per centimetro quadrato in un mezzo di mantenimento per sette-otto giorni; il giorno precedente l'esperimento, immergere un impalcato in PCL in etanolo al 70% per tutta la notte.La mattina seguente, staccare le cellule con Accutase e quindi centrifugare le cellule e risospendere il pellet in un mezzo di mantenimento fresco a una concentrazione di 4,5 × 10⁶ cellule per millilitro. Dopo l'evaporazione dell'etanolo, esporre entrambi i lati dell'impalcatura alla luce UV germicida per cinque-otto minuti. Successivamente, immergere l'impalcatura in PCL in una soluzione di fibronectina a 20 µg/mL a 37 °C per un'ora.Il biorreattore come appena illustrato, quindi distribuire uniformemente 40 microlitri di sospensione cellulare sullo scaffold fissato. Lasciare attaccare le cellule per uno-due 1,5 ore, quindi aggiungere ulteriori 1,5 millilitri di mezzo fresco alla camera di vibrazione. Dopo aver coltivato lo scaffold in PCL caricato con cellule staminali mesenchimali in condizioni statiche per tre giorni, sostituire il mezzo e quindi applicare i regimi di vibrazione selezionati ai costrutti cellulari.Le frequenze di vibrazione sono scelte in modo da riflettere le frequenze fondamentali della voce umana, e vi è una relazione lineare tra lo spostamento normale e la tensione di picco nel range da zero a 0,125 volt per tutte le frequenze testate; a una data tensione di picco, lo spostamento normale diminuisce all’aumentare della frequenza da 100 a 300 hertz. Le risposte cellulari a stimolazioni vibratorie, esaminate a livello di mRNA in termini di espressione di proteine essenziali della piega vocale, come le proteine della matrice extracellulare (elastina, acido ialuronico sintasi uno, collagene di tipo tre alfa uno e metalloproteasi della matrice uno), dimostrano che una vibrazione ciclica di un’ora accesa e un’ora spenta determina un aumento di 2,3 volte dell’espressione dell’elastina rispetto ai controlli statici.Al settimo giorno, le stimolazioni vibratorie aumentano anche moderatamente l'espressione del collagene. È degno di nota che l'espressione degli enzimi principali del rimodellamento della matrice extracellulare, l'acido ialuronico sintasi uno e la metalloproteasi della matrice uno, è significativamente aumentata dai segnali vibratorie dal terzo al settimo giorno. Le cellule coltivate dinamicamente producono 4,2 più o meno 0,1 microgrammi per milligrammo per peso secco del supporto di elastina solubile, come rilevato mediante Elisa dopo sette giorni di vibrazioni.Considerando che i controlli statici accumulano solo 2,7 ± 0,2 microgrammi per milligrammo di elastina. In media, sette giorni di vibrazioni alternate a intervalli di un'ora (un'ora accesa, un'ora spenta) determinano un aumento rispettivamente di 2,2 e 4,7 volte rispetto ai corrispondenti controlli statici nella secrezione di acido ialuronico e MMP-1. Sebbene il nostro sistema sia progettato per studiare la fisiologia in forma VOCO, può essere applicato anche a molti altri sistemi.Ad esempio, tessuti auricolari e cutanei umani. Grazie per aver guardato. Buona fortuna con i vostri esperimenti.

construction-and-characterization-of-a-novel-vocal-fold-bioreactor

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

La metodologia per la realizzazione di modelli di sintesi vocale volte viene descritta. I modelli sono a grandezza naturale e imitare la struttura multi-strato delle pieghe della voce umana. I risultati mostrano i modelli di auto-oscillare a pressioni paragonabili a pressione polmonare e dimostrare risposte vibratorio flusso indotto che sono simili a quelle di umani corde vocali.

Sintetico, Multi-Layer, Auto-oscillante Fabrication Vocal modello Fold

Un rotante sistema di coltura cellulare che consente alle cellule epiteliali di crescere in condizioni fisiologiche con conseguente 3-D formazione di aggregati cellulare viene descritto. Gli aggregati di visualizzazione...

Coltura e Applicazioni di bioreattore rotante Vessel parete Derivato di modelli 3D di cellule epiteliali

I polipi di piega vocale possono interrompere la dinamica della piega vocale e quindi possono avere conseguenze devastanti sulla capacità di comunicazione di un paziente. La separazione tridimensionale del flusso indotta da un polipo modello montato a parete e il suo impatto sul carico della pressione della parete vengono esaminati utilizzando la velocimetria dell'immagine delle particelle, la visualizzazione della linea di attrito della pelle e le misurazioni della pressione della parete.

Investigare la separazione tridimensionale del flusso indotta da un modello di polipo piega vocale

Il comportamento funzionale delle cellule in coltura può essere migliorata coltivando in più in vivo -come ambienti di coltura 3 dimensioni 16-21. Questo manoscritto descrive il set-up e il funzionamento di un sistema a fibra cava bioreattore per vivo -come mammiferi coltura di tessuti in.

Bioreattori fibra cava per<em&gt; In Vivo</em&gt; -come Mammiferi Tissue Culture

L'obiettivo di questo protocollo è quello di eseguire una co-coltura dinamica di macrofagi e miofibroblasti umani in scaffold elettrofilari tubolari per studiare la rigenerazione tissutale guidata dal materiale, utilizzando un bioreattore che consente il disaccoppiamento dello stress da taglio e dell'allungamento ciclico.

Un bioreattore multi-cue per valutare la capacità infiammatoria e rigenerativa dei biomateriali sotto flusso e allungamento

Il protocollo descrive un bioreattore abilitato all'imaging che consente la rimozione selettiva dell'epitelio endogeno dalla trachea di ratto e la distribuzione omogenea di cellule esogene sulla superficie del lume, seguita da una coltura in vitro a lungo termine del costrutto cellula-tessuto.

Bioreattore guidato da imaging per la generazione di tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato

Questo studio dimostra la produzione di modelli di corde vocali non appiccicose e super morbide introducendo un modo specifico per creare gli strati delle corde vocali, fornendo una descrizione dettagliata della procedura di produzione e caratterizzando le proprietà dei modelli.

Processo di produzione per modelli di corde vocali super-morbide non adesive

Abbiamo progettato un nuovo bioreattore carico meccanico in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale per un biocomposite cartilagine prima del trapianto in un difetto della cartilagine articolare.

Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l&#39;ingegneria tissutale

Fermentatori sono utilizzati per aumentare la cultura resa e produttività delle cellule bioingegneria. Dopo la proiezione più microbiche o animali candidati colture di cellule in fiasche di scuotimento, il prossimo passo logico è quello di aumentare la biomassa della coltura selezionata con il fermentatore. Questo video dimostra l'installazione e il funzionamento di un tipico sistema di bioreattore da banco.

Il funzionamento di un bioreattore da banco

La decellularizzazione dell'intero organo produce scaffold biologici naturali che possono essere utilizzati per la medicina rigenerativa. Viene presentata la descrizione di un modello di rigenerazione polmonare di primati non umani in cui interi polmoni vengono decellularizzati e quindi seminati con cellule staminali adulte e cellule endoteliali in un bioreattore che facilita la circolazione vascolare e la ventilazione con mezzi liquidi.

Decellularizzazione e ricellularizzazione polmonare di primati non umani utilizzando un bioreattore specializzato per grandi organi

Esplora la costruzione di un bioreattore vibrante per studiare l'effetto della stimolazione meccanica sulle cellule staminali mesenchimali. Questo metodo replica le condizioni fisiologiche della fonazione per analizzare le risposte cellulari a livello proteico e trascrizionale.

Costruzione e caratterizzazione di un Fold bioreattore Novel Vocal

Esplora altri video