Name: Recupero chirurgico, Isolamento e In vitro Ampliamento anteriore umana crociati Cells Legamento di derivazione per applicazioni di ingegneria tissutale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Impara a isolare e espandere cellule derivate dal legamento crociato anteriore umano per applicazioni di ingegneria tissutale. Questo protocollo consente di sviluppare patch per la riparazione di lesioni parziali dell'ACL.

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Gli autori desiderano ringraziare l&#39;avvio del fondo e il reparto di chirurgia assegno di ricerca presso la Southern Illinois University, School of Medicine; e la concessione Memorial Medical Foundation.

1. Recupero chirurgico Nota: L&#39;approvazione IRB è stata ottenuta per raccogliere il moncone del LCA durante l&#39;intervento chirurgico di ricostruzione del LCA. Esenzione IRB è stato dato come il moncone ACL utilizzato erano generalmente scartati come rifiuti chirurgico. 20 pazienti sono stati usati per raccogliere il moncone ACL. <ol><li> Somministrare anestesia generale e antibiotici pre-operatorie come da protocollo dell&#39;ente per il paziente. </li><li> Applicare il laccio emostatico e gonfiare 100 mg di sopra della pressione arteriosa sistolica. </li><li> Collocare il paziente in posizione supina. Effettuare una incisione antero-laterale orizzontale con il ginocchio in 30-45 ° di flessione per un portale 5 mm e inserire il trocar artroscopica e la macchina fotografica nella borsa sovrarotuleo a 30 °. </li><li> Eseguire una artroscopia diagnostica di routine. </li><li> Inserisci una tacca e debride sinovia membranosa sul strappato ACL. </li><li> Utilizzare un rasoio 4,5 millimetri e ablator per identificare il ceppo ACL. </li><li> Utilizzare un ornitorinco dritto amaro per raccogliere spe multiplacimens dei restanti ceppo ACL. </li><li> Mantenere il campione in soluzione salina in un contenitore sterile. </li><li> Inviare i campioni alla patologia per la decodifica e la consegna finale alla struttura di laboratorio. </li><li> Recuperare paziente ed eseguire cure post-operatorie come da protocollo dell&#39;ente. </li></ol> 2. Digestione tessuti e isolamento HACL <ol><li> Trasferire il tessuto umano ACL ricevuto da patologia a una piastra di Petri con soluzione salina sterile / PBS (tampone fosfato salino). </li><li> Tritare il tessuto con le forbici sterili in 1-2 mm 3 pezzi e lavare il tessuto tritato con soluzione fisiologica almeno 3 volte. </li><li> Digerire il tessuto tritato con 0,4% collagenasi in DMEM/F-12 (50/50, 1x) medium supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina per 4-6 ore a 37 ° C. </li><li> Centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 minuti e poi risospendere le cellule in medium. </li><li> Lavare le cellule con il mezzo per 2-3 volte e poi seed / cultura in T-25 palloni per 2-3 giorni. </li></ol> 3. Espansione cellulare, congelamento e di scongelamento <ol><li> Utilizzare un microscopio ottico per visualizzare le cellule in coltura per 2-3 giorni in un pallone T-25. </li><li> Mantenere le cellule a 37 ° C in DMEM/F-12 (50/50, 1x) medie supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S). Nota: Cambiare i media quando le cellule mostrano l&#39;aderenza e la morfologia standard. Utilizzare un microscopio ottico per osservare le cellule. </li><li> Lavare le cellule confluenti con PBS al giorno 7 (~ 1,3 x 10 6 cellule / boccetta). Aggiungere tripsina (0,5 g / L) e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. Aggiungere supporti per cellule sospese per neutralizzare la tripsina. Dividere il composto media-cellulare tra tre T-25 palloni. </li><li> Lavare le cellule confluenti con PBS, aggiungere tripsina (0,5 g / L), e risospendere in congelamento terreno contenente DMSO, FBS e il mezzo completo (DMEM/F-12 Piano + 10% FBS + 1% P / S) nella rapporto 01:02:07. </li><li> Negoziole fiale criogeniche a -80 ° C se verranno utilizzati le cellule entro un mese, e in azoto liquido se saranno conservati cellule per periodi più lunghi. </li><li> Scongelare le provette in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per il riutilizzo. Nota: in genere le cellule 90-95% sopravvivono. </li></ol> 4. Fabbricazione di Tissue Engineered 2-D Poly lattico-co-glicolico acido (plaga) Scaffold <ol><li> Sciogliere 1 g di plaga in 12 ml di diclorometano in 20 ml di scintillazione flaconcino e agitare la soluzione per 8 ore a velocità costante (800 rpm). Nota: Descrizione dettagliata in Gupta et al 15. </li><li> Trasferire la soluzione disciolta in un piatto di vetro Petri foderata con carta di protezione fluorurato. </li><li> Porre la capsula Petri sotto una cappa di aspirazione per 30 min. Lasciare la piastra di Petri a -20 ° C per una notte e poi a temperatura ambiente. Porre le capsule di Petri in liofilizzatore per garantire la completa evaporazione del solvente per ottenere film sottili di polimero. </li><li> Posizionare il fi polimeroLMS in un essiccatore per 24 ore. </li><li> Tagliare le pellicole polimeriche in 12 mm di diametro dischi circolari e memorizzarli in un essiccatore fino a quando necessario. </li></ol> 5. Scanning Electron Microscopy (SEM) <ol><li> Lavare le cellule (50.000 cellule / disk) seminati sul TCPS controllo e il scaffold plaga con PBS 7 giorni successivi semina. </li><li> Utilizzare 1,5% glutaraldeide in tampone 0,1 M cacodilato per fissare le cellule e il 2,5% OsO 4 in 0.1 M tampone cacodilato per la post-fissazione. </li><li> Lavare le cellule fissate con 0.1 M tampone cacodilato. Essiccare le cellule fissate mediante disidratazione seriale etanolo (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) per 15 minuti ciascuno, e in seguito secco in Esametildisilazane (HMDS) durante la notte. </li><li> Ventilare la camera di SEM sistema di rivestimento a polverizzazione con valvola a pulsante e sollevare la piastra superiore. </li><li> Posizionare i campioni essiccati in camera. Abbassare la piastra superiore. </li><li> Accendere la manopola di controllo per pompare per iniziare l&#39;evacuazione della camera. </li><li> Valvola di fuga aperta argon. Aspettiper il vuoto scenda a 0,05 mbar. </li><li> Cappotto campioni essiccati con uno strato sottile (0,13 nm) di oro / palladio. </li><li> Riportare la valvola perdita argon alla sua posizione chiusa. </li><li> Accendere la manopola off. </li><li> Ventilare la camera con valvola tasto e sollevare la piastra superiore. </li><li> Rimuovere i campioni e conservarli in un essiccatore per 24 ore. </li><li> Osservare i campioni al microscopio elettronico a scansione. </li></ol> 6. Immunofluorescenza <ol><li> Lavare le cellule (50.000 cellule / disk) seminati sul TCPS controllo e il scaffold plaga con PBS 7 giorni successivi semina. </li><li> Fissare le cellule con 70% di etanolo (freddo) per 10 min. </li><li> Incubare le cellule fissate a temperatura ambiente con 1% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS con 0,05% Triton X-100 per 20 min. </li><li> Immergere i campioni in 1% Tween a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Aggiungi monoclonale anti-β-actina anticorpi (1:400) e incubare le cellule overnight a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con il 0,05% di Tween. Aggiungere anticorpo secondario (capra anti-topo F (ab &#39;) 2 frammento di IgG coniugato con una sonda a fluorescenza, 1:400) alle cellule e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con PBS. Colorare le cellule con colorazione nucleare e montare con l&#39;80% di glicerina. </li><li> Osservare le cellule al microscopio confocale. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

L&#39;obiettivo primario di questo studio impalcatura hACL/2D stato quello di utilizzare le cellule ottenute in una patch per aumentare la riparazione primaria di lacrime ACL parziali. Gestione incruento di lacrime ACL parziali possono includere un breve periodo di immobilizzazione, tonificante, un programma di riabilitazione progressiva e regolari valutazioni di follow-up 13,16,17. Tuttavia, molti studi dimostrano che il trattamento conservativo negli atleti è stata associata con scarsi risultati e falliment...

Il legamento crociato anteriore (LCA) è un legamento intra-articolare comunemente feriti del ginocchio. Circa 200.000 (ACL) lesioni sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti. Oltre il 75% dei pazienti con lesioni ACL optare per la chirurgia ricostruttiva ortopedica 1,2,3,4. L&#39;intervento chirurgico è spesso indicato a causa di un potenziale di guarigione per sé mediocre 3. Ricostruzione del LCA in genere viene eseguita per mezzo di un innesto di osso autologo o allogenico tendine. Autologo e allogenico rappresentano il gold standard per la ricostruzione come si vantano tassi di successo elevati, e la riparazione sutura primaria, l&#39;altra opzione di trattamento, ha mostrato tassi di fallimento fino al 94% 5,6,7. Rotture parziali della ACL rappresentano il 10% al 28% di tutte le lacrime ACL 8. In uno studio prospettico, Noyes et al. Stima che il 50% dei pazienti con rotture parziali che interessano più della metà del LCA progredito per completare ACL insufficienza dopo la non-trattamento chirurgico 9. Altri studi riportano persistente instabilità e la funzione diminuiti con meno del 30% dei pazienti in grado di tornare alle loro pre-infortunio livello di attività 9,10,11,12,13. Le opzioni di trattamento sono limitate e comprendono le modalità conservative, ritiro termico di rimanere ACL, o ricostruzione del LCA. Recentemente, c&#39;è stato un crescente interesse per la riparazione primaria aumentata. Queste tecniche utilizzano farmaci biologici per migliorare la riparazione di sutura primaria 14. Recenti ricerche hanno tentato di raccogliere mesenchimali come HACL derivato cellule staminali per aggirare le limitazioni innesto, 31,32 ma la validità e l&#39;efficacia di queste cellule è ancora sconosciuta. La fonte cellulare ideale per applicazioni di ingegneria tissutale sembra essere non mesechymal HACL derivato cellule di fibroblasti. La ricerca attuale si concentra sull&#39;identificazione un materiale di matrice adatto e fonte di cellule per il scaffold ingegnerizzati. Si tratta di una procedura standard per un ACL strappato da scartare come surifiuti rgical durante l&#39;intervento chirurgico di ricostruzione, tuttavia, questo legamento danneggiato può essere una fonte di qualità per l&#39;acquisizione di cellule necessarie per sviluppare e valorizzare un tessuto ideale ingegnerizzato sostituzione ACL. Il nostro laboratorio ha sviluppato un protocollo per l&#39;espansione in vitro di queste cellule derivate HACL raccolte. Utilizzando una matrice 2D di ingegneria infuso con celle HACL derivate, abbiamo progettato una patch che potrebbe potenzialmente aumentare la riparazione ACL parziale e rafforzare legamenti strappati.

<table><tbody><tr><td>piastra di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-103C</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Gibco</td><td>17018-029</td><td>Conservare a 4 &#176; C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Cellgro</td><td>10-092-CV</td><td>Negozio a 4 &#176;C. Caldo in 37 &#176; C bagnomaria prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>Negozio a -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>Negozio a 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga - 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>T-25 palloni</td><td>BD Falcon</td><td>3013</td><td></td></tr><tr><td>Miscela Tripsina-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161E</td><td>Conservare a 4 &#176;C. Caldo in 37 &#176; C bagnomaria prima dell'uso.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Liquido combustibile. Può causare irritazione alla pelle, agli occhi e alle vie respiratorie.</td></tr><tr><td>Fiale criogeniche</td><td>Corning</td><td>430489</td><td></td></tr><tr><td>PLAGA</td><td>Purac Biomaterials</td><td>Purasorb PLG8523</td><td>Store a -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Dischi TCPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36423-0010</td><td>Possibile rischio di cancro. Conservare in un luogo fresco e asciutto.</td></tr><tr><td>Bytac paper</td><td>Saint gobin performance plastics</td><td>1420652</td><td></td></tr><tr><td>fiala di scintillazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-21G</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino albumina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>Negozio a 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-beta;-actina nel topo (1&#176; Ab)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5441</td><td>Negozio a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>anticorpo capra-anti-topo (2&#176; Ab)</td><td>Cell Signaling</td><td>4408</td><td>Conservare a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Hoechst tintura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14530</td><td>Negozio a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2547-1</td><td>Tossico per inalazione e se ingerito. Provoca ustioni da tutte le vie di esposizione.</td></tr><tr><td>Esametildisilazano</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC43085-1000</td><td>Liquido e vapore infiammabili. Provoca ustioni da tutte le vie di esposizione.</td></tr><tr><td>Forbici sterili</td><td>McKesson</td><td>25-716</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Olympus</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Thermo scientific</td><td>2845</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>VX-200</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in vetro</td><td>fisher Scientific</td><td>S31473</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P1225</td><td>Acu-Punch è stato utilizzato per tagliare dischi da 12 mm Tampone</td></tr><tr><td>di cacodilato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>97068</td><td>Liquido infiammabile, cancerogeno e irritante.</td></tr><tr><td>Tetraossido di osmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td>Altamente tossico</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Nocivo se ingerito</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td>Tenere lontano da fonti di calore, scintille, fiamme e altre forme di accensione.</td></tr><tr><td>Anestesia generale/regionale</td><td>Farmaci Amphastar 1</td><td></td><td>% lidocaina, 0,25% bupivacaina, agenti anestetici per induzione e mantenimento</td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>Hospira</td><td>0409-0805-01</td><td>Ancef 1 g i.v.</td></tr><tr><td>Trocar per artroscopia</td><td>Smith e Nephew</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telecamera per artroscopia</td><td>Smith e Nephew</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinza artroscopica e rasoio amaro</td><td>Arthrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 4,5 mm</td> Viti <td>ad interferenza Arthrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viti</td> in <td>acciaio inox</td><td>Arthrex</td><td></td></tr><tr><td>Sputter Coater</td><td>Polaron</td><td>E5400</td><td></td></tr></tbody></table>

recupero chirurgico, isolamento e<em&gt; in vitro</em&gt; ampliamento anteriore umana crociati cells legamento di derivazione per applicazioni di ingegneria tissutale

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Lesioni al LCA è un problema comunemente riscontrato nei soggetti attivi. Anche le lacrime parziali di questa intra-articolare del legamento del ginocchio portare a carenze biomeccanici che compromettono la funzione e la stabilità. Le opzioni correnti per il trattamento delle lacrime ACL parziali vanno da incruento, gestione conservativa a molteplici opzioni chirurgiche, come ad esempio: modifica termica, riparazione singolo fascio, ricostruzione completa, e la ricostruzione della parte danneggiata del legamento nativo. Pochi studi, se del caso, hanno dimostrato un metodo unico per la gestione sia costantemente superiore, e in molti casi i pazienti continuano a dimostrare persistente instabilità e di altre comorbidità. L&#39;obiettivo di questo studio è quello di individuare una fonte cellulare potrebbe ricorrere allo sviluppo di una patch tessutale che potrebbe essere implementata nella riparazione di un ACL parzialmente strappata. Un nuovo protocollo è stato sviluppato per l&#39;espansione di cellule derivate da patienti sottoposti a ricostruzione del LCA. Per isolare le cellule, tessuti HACL macinate ottenute durante la ricostruzione del LCA è stato digerito in una soluzione di collagenasi. Espansione è stata effettuata utilizzando mezzo DMEM/F12 supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S). Le cellule sono state poi conservati a -80 ° C o in azoto liquido in un mezzo costituito da congelamento DMSO, FBS e il mezzo di espansione. Dopo lo scongelamento, le cellule derivate HACL sono state poi seminate su un ponteggio ingegneria tessutale, plaga (acido lattico-co-glicolico Poly) e il controllo del tessuto della cultura polistirene (TCPS). Dopo 7 giorni, SEM è stata eseguita per confrontare adesione cellulare alla plaga contro il TCPS controllo. Morfologia cellulare è stata valutata mediante immunofluorescenza. SEM (Scanning Electron Microscope) microscopio hanno dimostrato che le cellule crescevano e rispettati su entrambe le superfici plaga e TCP ed erano confluenti su tutta la superficie di giorno 7. Immunofluorescenza mostrava normale, morfologiche non-ha sottolineatoAL modelli su entrambe le superfici. Questa tecnica è promettente per applicazioni nella rigenerazione e ricostruzione del LCA.

Il modello di lavoro per il recupero chirurgico, la digestione del tessuto e l&#39;isolamento della persona umana legamento crociato anteriore (HACL) cellule derivate è mostrato in Figura 1. Le cellule migrate dai espianti e aderito alle T-25 palloni. Queste cellule sono state coltivate per 3 giorni e poi sono stati visualizzati sotto un microscopio ottico (Figura 2). Un monostrato confluente stato ottenuto giorno 7. La presenza di cellule vitali, sani ha indicato l&#39;operazione riusc...

Per le future applicazioni come una patch per riparare rotture parziali del legamento crociato anteriore (LCA), le cellule derivate ACL umane sono state isolate da tessuti ottenuti durante le procedure ricostruttive, espanse in vitro e coltivati ​​in ingegneria tessutale ponteggi. Adesione cellulare e la morfologia è stata poi eseguita per confermare biocompatibilità sulla superficie patibolo.

Recupero chirurgico, Isolamento e<em&gt; In vitro</em&gt; Ampliamento anteriore umana crociati Cells Legamento di derivazione per applicazioni di ingegneria tissutale

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un legamento crociato anteriore ingegnerizzato o una toppa per legamento crociato anteriore (ACL) per una coppia di legamenti crociati anteriori parzialmente rotti. Questo risultato si ottiene innanzitutto prelevando il tessuto umano del legamento crociato anteriore dal paziente e conservandolo in soluzione salina. Il campione di ACL ottenuto viene tritato e digerito con collagenasi per ottenere cellule derivate dall'ACL.Le cellule isolate vengono quindi coltivate ed espanse. Il passaggio successivo consiste nella fabbricazione di un impalcatura bidimensionale in acido polilattico-co-glicolico. Come passaggio finale, le cellule vengono quindi seminate su questo film polimerico.Infine, la microscopia elettronica a scansione e la microscopia a fluorescenza mediante anticorpi marcati vengono utilizzate per dimostrare la biocompatibilità sulla superficie del scaffold. Oggi siamo qui per illustrare la nostra tecnica di sviluppo di una toppa per lesioni parziali del legamento crociato anteriore. L'importanza di questo approccio risiede nel fatto che i legamenti crociati anteriori non si rigenerano spontaneamente.Questa è una nuova tecnica innovativa che abbiamo sviluppato per favorire la guarigione del legamento crociato anteriore (ACL). Per iniziare, trasferire il tessuto umano del legamento crociato anteriore ricevuto dal reparto di anatomia patologica in una piastra di Petri contenente soluzione salina sterile e soluzione salina tamponata al fosfato, o PBS, e tritare il tessuto con forbici sterili in pezzi di uno-due millimetri cubi. Lavare il tessuto tritato con soluzione salina almeno tre volte. Digestire il tessuto con collaghenasi 0,4% in mezzo nutriente modificato Eagle (ECCOs) completo e integrato.Incubare le cellule nel mezzo F 12 per quattro-sei ore. Centrifugare le cellule a 37 gradi Celsius a 1000 cheese per cinque minuti. Sospendere le cellule nel mezzo prima di lavarle con il mezzo per due-tre volte, quindi seminare nei flaconi T 25 e coltivare per due-tre giorni.Utilizzare un microscopio ottico per visualizzare le cellule coltivate per due o tre giorni in un flacone T 25. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius nel mezzo DMEM supplementato. Cambiare il mezzo quando le cellule mostrano aderenza e morfologia standard, come osservato al microscopio ottico al giorno sette.Lavare le cellule confluenti con PBS, aggiungere la tripsina e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere mezzo alle cellule sospese per neutralizzare la tripsina prima di dividere la miscela di cellule e mezzo tra tre fiaschi T 25. Lavare le cellule confluenti con PBS e aggiungere la tripsina prima di risospendere le cellule in mezzo di congelamento contenente DMSO, siero bovino fetale e mezzo completo in un rapporto di uno a due a sette.Conservare le provette criogeniche a meno 80 gradi Celsius. Se le cellule verranno utilizzate entro un mese o in azoto liquido. Se le cellule dovranno essere conservate per periodi più lunghi, sciogliere un grammo di acido polilattico-co-glicolico o P-L-A-G-A in 12 millilitri di diclorometano in una provetta per scintillazione da 20 millilitri e vortexare la soluzione per otto ore a una velocità costante di 800 giri al minuto.Trasferire la soluzione disciolta in una capsula di Petri di vetro rivestita con carta protettiva fluorurata. Successivamente, posizionare la capsula di Petri sotto una cappa a vuoto per 30 minuti prima di lasciarla a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Lasciare la piastra a temperatura ambiente per garantire l'evaporazione del solvente residuo ed ottenere film sottili del polimero.Successivamente, posizionare i film polimerici in un essiccatore per 24 ore. Tagliare i film polimerici in dischi circolari di 12 millimetri di diametro e conservarli in un essiccatore fino al momento dell'uso. Dopo aver seminato le cellule sui substrati di controllo di coltura tessutale, polistirene o TCPS e su quello di P-L-A-G-A, a 50.000 cellule per disco.Lavare le impalcature con PBS sette giorni dopo la semina. Fissare le cellule in glutaraldeide al 1,5% in tampone caco 0,1 M per tutta la notte. Successivamente, aggiungere tetroxido di osmio al 2,5% in tampone caco 0,1 M per la post-fissazione per un'ora.Dopo aver lavato le cellule fissate con tampone caco diluente 0,1 molare, asciugare le cellule fissate mediante disidratazione in etanolo seriale per 15 minuti ciascuna. Asciugare ulteriormente le cellule in esametildisilazano durante la notte. Aprire la camera del sistema di sputter coating per SEM mediante la valvola a pulsante e sollevare la piastra superiore.Posizionare i campioni essiccati nella camera e abbassare la piastra superiore. Ruotare la manopola di controllo della pompa per iniziare a evacuare la camera. Aprire la valvola di sfiato dell'argon e attendere che il vuoto scenda a 0,05 millibar.Rivestire i campioni essiccati con uno strato sottile di oro-palladio utilizzando una macchina per rivestimento. Quindi riportare la valvola di scarico dell'argon alla posizione chiusa. Ruotare la manopola di controllo su off per sottoporre la camera a sfiato tramite la valvola a pulsante e sollevare la piastra superiore.Rimuovere i campioni e conservarli in un essiccatore per 24 ore. Infine, osservare i campioni al microscopio elettronico a scansione per la colorazione immunofluorescente. Iniziare inoltre lavando le cellule aderenti su superfici controllate di TCPS e su scaffold di P-L-A-G-A con PBS sette giorni dopo il semina.Quindi fissare le cellule utilizzando etanolo freddo al 70% per 10 minuti. Incubare le cellule fissate a temperatura ambiente con albumina sierica bovina all'1% in PBS contenente Triton X-100 allo 0,05% per 20 minuti. Successivamente, immergere i campioni in tween all'1% a temperatura ambiente per 20 minuti.Aggiungere l'anticorpo monoclonale murino anti-beta-actina e incubare le cellule tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le cellule con tween al 0,05%. Quindi aggiungere l'anticorpo secondario alle cellule e incubare per un'ora a temperatura ambiente.Dopo aver lavato le cellule con PBS, colorare le cellule con un colorante nucleare e montarle utilizzando glicerolo al 80%. Infine, osservare le cellule al microscopio confocale. Le cellule derivate dal legamento crociato anteriore umano sono state coltivate e visualizzate al microscopio ottico.Le cellule a forma di fuso o allungate sono state osservate crescere sulla superficie delle provette T 25 dopo tre giorni di coltura, e un monostrato confluenziale è stato ottenuto entro il settimo giorno. La presenza di cellule vitali sane ha indicato il recupero e la coltura avvenuti con successo, nonché l'adesione cellulare alla superficie dei supporti in acido polilattico-co-glicolico e il controllo della coltura tissutale. L'adesione e la proliferazione qualitativa delle cellule derivate dal legamento crociato anteriore umano su polistirene è stata determinata mediante MEB ed è qui visualizzabile su ciascuna superficie polimerica.È stata inoltre osservata la confluenza cellulare. L'analisi della morfologia e dell'adesione cellulare è stata determinata mediante colorazione immunofluorescente. La colorazione verde dell'actina beta dimostra che le cellule derivate dal legamento crociato anteriore umano, sia su P-L-A-G-A che su TCPS, presentano un aspetto normale e non stressato.Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come progettare una toppa ingegnerizzata per riparare lesioni parziali del legamento crociato anteriore (ACL) utilizzando metodi di ingegneria tissutale con cellule ACL derivate da tessuto umano, nonché di come studiare la compatibilità tissutale mediante immunofluorescenza e colorazione specifica per questa tecnica. Grazie mille.

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Recupero chirurgico, Isolamento e In vitro Ampliamento anteriore umana crociati Cells Legamento di derivazione per applicazioni di ingegneria tissutale (Video) | JoVE Journal

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