Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule progenitrici della cresta neurale a partire da cellule staminali pluripotenti umane, mediante un protocollo definito, riproducibile e rapido. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per lo studio in vitro di malattie correlate alla cresta neurale oppure per la differenziazione ulteriore in cellule figlie. Questo risultato si ottiene innanzitutto seminando un'alta densità di cellule staminali pluripotenti umane in un monostrato su matrigel.

Il secondo passaggio consiste nel differenziare le cellule in cellule neuroepiteliali utilizzando una sequenza definita e una combinazione di molecole di piccole dimensioni che influenzano vie di segnalazione chiave. Successivamente, le cellule neuroepiteliali vengono ripiastrellate e ulteriormente differenziate in cellule progenitrici della cresta neurale. L'ultimo passaggio consiste nell'isolare le cellule della cresta neurale mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza.

In definitiva, l'immunofluorescenza e saggi funzionali, come la capacità delle cellule di migrare, vengono utilizzati per dimostrare che sono state generate cellule della cresta neurale appropriate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti per l'ottenimento di cellule della cresta neurale da cellule staminali pluripotenti umane è la sua brevità. Dura soltanto 18 giorni.

È più riproducibile grazie all'assenza di cellule nutritizie MS cinque. È facile da scalare e presenta un'elevata riproducibilità tra linee di cellule staminali pluripotenti umane. Le implicazioni di questa tecnica si estendono a studi sui meccanismi delle malattie umane correlate alla linea neurogenica e mostrano un potenziale per migliorare la modellizzazione in vitro e lo screening farmacologico di queste malattie.

Prima di iniziare questo protocollo, assicurarsi che le colonie di cellule staminali pluripotenti umane siano abbastanza grandi da essere visibili ad occhio nudo e presentino ancora margini ben definiti con poche cellule differenziate ai loro bordi. Quando le cellule staminali pluripotenti umane sono pronte per essere suddivise, aspirare il mezzo, lavare una volta con cinque millilitri di PBS 1X e aggiungere quattro millilitri di tripsina 0,05% in EDTA alle cellule. Successivamente, agitare energicamente la piastra in modo orizzontale per due minuti finché al microscopio non si osserva che i fibroblasti embrionali di topo si staccano dalla piastra sotto forma di cellule singole.

Le colonie di HPSC rimarranno attaccate alla piastra sotto forma di colonie, quindi aspirare immediatamente e completamente la tripsina e lasciare la piastra a temperatura ambiente per due-quattro minuti. Aggiungere due millilitri di mezzo HES alla piastra e utilizzare una pipetta P1000 per staccare le cellule. Se le cellule non si distaccano facilmente, incubare la piastra per altri due-tre minuti.

A temperatura ambiente, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri contenente otto millilitri di mezzo HES, integrato con 10 micromolari di Y 2 7 6 3 2 diidrocloruro. Successivamente, aspirare il matrigel da una piastra da 10 centimetri precedentemente trattata e seminare le cellule in un rapporto uno a uno o uno a due sulla piastra trattata con matrigel. Incubare le cellule tutta la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% di anidride carbonica.

Alimentare le cellule ogni giorno con mezzo HES fino a quando non sono pronte per la differenziazione. Iniziare quindi la differenziazione neurale quando le cellule hanno raggiunto una confluenza del 90% al 100%. Questo è il giorno zero.

Alimentare le cellule ogni giorno dal giorno zero al giorno tre con 10 millilitri di mezzo di differenziamento KSR contenente 0,1 micromolare LDN 193189 e 10 micromolare SB 431542. Successivamente, al giorno quattro e cinque, alimentare le cellule con 10 millilitri di mezzo contenente il 75% di mezzo di differenziamento KSR e il 25% di mezzo di differenziamento And two, 0,1 micromolare LDN 193189 e 10 micromolare SB 431542. Al giorno sei e sette, alimentare le cellule con mezzo aggiustato per contenere il 50% di mezzo di differenziamento KSR e il 50% di mezzo di differenziamento And two, oltre a essere integrato con 0,1 micromolare LDN 193189 e 10 micromolare SB 431542.

Per il giorno otto e nove, nutrire le cellule con il 25% di KSR differenziativo, mezzo e il 75% e due, mezzo differenziativo, entrambi contenenti 0,1 micromolare LDN 1 9 3 1 8, 9 e 10 micromolari SB 4 3 5 2. Poi al giorno nove e dieci, preparare le piastre di coltura con poli-L-ornitina, laminina uno e fibronectina come descritto nel protocollo del testo, che verranno utilizzate per il reinnesto delle cellule. Al giorno 11, nutrire le cellule con mezzo differenziativo N due, integrato con 0,1 micromolare L DN 1 9 3, 109 e 10 micromolari SB 4 31 5 42. Al giorno 10, al giorno 11, aspirare la soluzione di laminina uno e fibronectina dalle piastre di coltura precedentemente preparate e lasciarle asciugare a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare per 20-30 minuti.

Successivamente, rimuovere il mezzo dalle cellule in differenziamento e lavare le cellule una volta con un XPBS. Quindi aggiungere otto millilitri di acuate a ogni piastra da 10 centimetri e incubare le piastre per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, utilizzare un cell lifter per staccare le cellule, quindi risospendere le cellule nella soluzione di Accutane.

Con una pipetta da cinque millilitri, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di uno XPBS al tubo e centrifugare le cellule per cinque minuti a 115 G. Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di uno XPBS. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron per garantire una sospensione di cellule singole.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare nuovamente le cellule per cinque minuti a 115 G e risospendere le cellule a una concentrazione di 100.000-150.000 cellule per 10 microlitri di mezzo di differenziamento N2 supplementato. Utilizzare una pipetta ripetitrice per distribuire gocce da 10 microlitri della sospensione cellulare su piastre da coltura da 15 centimetri precedentemente trattate con poli-L-ornitina.

Laminina uno e fibronectina. Lasciare le gocce a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Quindi aggiungere con molta attenzione 30 millilitri del mezzo di differenziazione N due supplementato alla piastra, senza disturbare le gocce.

Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius in un'incubatrice con 5% di anidride carbonica. Al giorno 12, aggiungere con attenzione alle cellule 20 millilitri di mezzo di differenziamento N2 contenente 200 micromolare di acido ascorbico, 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello, 100 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti otto e 20 nanogrammi per millilitro di sonic hedgehog per ogni piastra da 15 centimetri.

Quindi, dal giorno 14 al giorno 17, coltivare le cellule ogni due o tre giorni con il mezzo di differenziamento N2 contenente soltanto 200 micromolar di acido ascorbico, 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e 100 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti otto. Preparare le piastre con poli-L-ornitina, laminina-1 e fibronectina al giorno 16 e 17 per essere utilizzate per il reimpiego delle cellule della cresta neurale.

Dopo l'analisi al fax al giorno 18, una volta che le cellule sono state separate mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza, contare le cellule della cresta neurale e quindi centrifugarle a 115 G per cinque minuti. Ri-sospendere il pellet cellulare nel mezzo di differenziamento N due integrato con 10 nanogrammi per millilitro.

FGF 2 20 nanogrammi per millilitro di EGF e 10 micromolari di Y 27632 diidrocloruro a una concentrazione di 30.000 cellule per 10 microlitri. Asciugare completamente le piastre di coltura precedentemente preparate con poli-L-ornitina, laminina 1 e fibronectina. Quindi seminare circa da 50 a 70 gocce di sospensione cellulare per piastra da 10 centimetri.

Incubare le cellule a temperatura ambiente per 15-20 minuti in 20 millilitri di N₂. Mezzo di differenziamento integrato con 10 nanogrammi per millilitro di FGF2, 20 nanogrammi per millilitro di EGF e 10 micromolari di Y-27632 diidrocloruro, aggiungendo a ogni piastra da 10 centimetri senza disturbare le gocce.

Quindi incubare le cellule tutta la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, mantenere e passaggiare le cellule della cresta neurale, secondo il protocollo testuale allegato; le cellule della cresta neurale sono state derivate da cellule staminali pluripotenti umane in 18 giorni, utilizzando questo nuovo protocollo di differenziazione in vitro senza l'uso di cellule di supporto.

L'analisi FACS al giorno 18 ha identificato cellule positive sia per HNK-1 che per p75, confermando la presenza di cellule della cresta neurale. In entrambi i protocolli di differenziazione, indipendente da cellule nutrici e dipendente da cellule nutrici, le cellule della cresta neurale hanno attraversato una fase a rosetta neurale. Inoltre, le cellule ordinate per citofluorimetria presentano morfologia identica ed esprimono i marcatori della cresta neurale, HNK-1 e p75; un confronto dell'espressione genica globale di cellule della cresta neurale derivate da questi due protocolli di differenziazione ha rivelato che entrambi i gruppi di cellule si raggruppano strettamente insieme.

L'analisi della capacità migratoria delle cellule della cresta neurale ottenute mediante il protocollo senza feeder ha mostrato che le cellule hanno migrato con successo nella ferita dopo 48 ore. Queste cellule possiedono inoltre il potenziale di differenziarsi in cellule del sistema nervoso autonomo, come confermato dalla positività alla colorazione per mash one e touch one dopo ulteriori quattro giorni di differenziamento. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come neuralizzare cellule staminali pluripotenti umane e ottenere in vitro cellule progenitrici della cresta neurale.