L'impianto di Vena cava inferiore Interposizione Graft in modello murino

Per migliorare la nostra conoscenza della formazione neotissue cellulare e molecolare, un modello murino della TEVG è stata sviluppata di recente. Gli innesti sono stati impiantati come infrarenali innesti vena cava interposizione di C57BL / 6 topi. Questo modello raggiunge risultati simili a quelli ottenuti nella nostra ricerca clinica, ma nel corso di un time-course di gran lunga ridotto.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare i meccanismi cellulari e molecolari della formazione del neotessuto e dello sviluppo della stenosi negli innesti vascolari di ingegneria tissutale. I primi scaffold tubolari biodegradabili sono assemblati rivestendo una rete di feltro non tessuto di acido poliglicolico con un copolimero di lattone epsilon cap e L lattide. I prossimi passi sono la raccolta del midollo osseo e l'isolamento delle cellule mononucleate mediante centrifugazione in gradiente di densità.

Quindi circa 1 milione di cellule vengono seminate sull'impalcatura e incubate durante la notte. Il passaggio finale consiste nell'impiantare l'impalcatura seminata come innesto di interposizione della vena cava inferiore. In definitiva, i risultati possono mostrare l'infiltrazione cellulare e la deposizione di matrice extracellulare nell'innesto vascolare ingegnerizzato attraverso l'immunoistochimica.

Le implicazioni di questa tecnica sono capire meglio cosa causa la formazione di stenosi e innesti vascolari di ingegneria tissutale, e quindi utilizzare queste informazioni per progettare un migliore innesto vascolare di ingegneria tissutale. Dal nostro studio clinico, abbiamo appreso che quasi un quarto dei pazienti che hanno ricevuto il condotto di ingegneria tissutale ha sviluppato un restringimento. Il nostro obiettivo è eliminare questo problema.

Sebbene questo metodo possa essere applicato alla cardiopatia congenita, può anche essere applicato all'intervento chirurgico di bypass del colon o al condotto per la caratteristica venosa alterata. In generale, gli individui nuovi a questo metodo hanno avuto difficoltà a causa delle tecniche di microchirurgia richieste durante l'osmosi venosa. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo cercando un modo migliore per caratterizzare la nuova formazione di tessuto e modi per prevenire lo sviluppo di stenosi negli innesti vascolari di ingegneria tissutale utilizzati nel nostro studio clinico sull'uomo.

Per prima cosa inizia a mescolare il lattone epsilon cap e il copolimero L Lactide. Questo richiede dai 60 ai 90 minuti per dissolversi completamente. Nel frattempo, prendete un foglio di acido poliglicolico dal congelatore e tagliatene diverse sezioni di cinque per otto millimetri.

Quindi, tagliare il filtro da un puntale per pipetta da 10 microlitri e inserire un ago da 19 gauge nella sua estremità distale. Usando una pinza, avvolgi un pezzo di feltro di acido poliglicolico attorno all'ago. Quindi, utilizzando un ago smussato calibro 18, spingere con cautela il feltro nell'estremità distale della punta della pipetta attorno all'ago calibro 19.

Quando la soluzione di copolimero è pronta, caricare 40 microlitri nella parte superiore del puntale della pipetta per saturare il feltro di acido poliglicolico con la soluzione. Spingere fuori le bolle d'aria con un pipettatore fino a rimuovere tutte le bolle d'aria. Trasferire tutti gli innesti preparati in una provetta da 50 millilitri con le teste dell'ago rivolte verso il basso e metterli a meno 80 gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi liofilizzare gli innesti sotto vuoto per 24 ore. Con il coperchio delle provette aperto il giorno successivo, isolare gli innesti dagli aghi. Tagliare entrambe le estremità dell'innesto per una sezione pulita di quattro o cinque millimetri.

Quindi infilare quegli innesti attorno ai loro aghi in modo che mantengano la loro forma. Conservare l'innesto in un essiccato e la sera prima sono seduti con le cellule. Conservali sotto la luce UV in una cappa di biosicurezza di un topo soppresso.

Raccogli tutti i femori e la tibia in un piatto con 10 millilitri di RPMI, taglia entrambe le estremità di ciascun osso. E in un secondo piatto, sciacquare il midollo iniettando RPMI da un ago calibro 25 attraverso tutte le ossa. Utilizzare un totale di tre millilitri di giri/min.

Raccolgo tutto il midollo osseo in RPMI in un unico tubo da 15 millilitri e risciacquo il piatto con altri due millilitri di RPMI per ottenere un volume totale di cinque millilitri. Contare le celle di questa raccolta. Quindi, caricare cinque millilitri di fial in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e riempirla lentamente con cinque millilitri di midollo osseo.

Con RPMI quindi centrifugare il tubo per 30 minuti a 528 G con la pausa e a 24 gradi Celsius. Raccogliere lo strato intermedio dal tubo che contiene le cellule mononucleate. Diluire questo strato uno a uno in PBS.

Centrifugare la soluzione cellulare e risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS. Quindi ripeti la centrifuga. Diluire il pellet cellulare in circa 200 microlitri di RPMI e contare le cellule due volte.

Utilizzare il valore medio per concentrarli a 1 milione di cellule per 10 microlitri di RPMI per l'innesto. Utilizzare una femmina nera di sei o otto settimane C 57. Pesare il topo e applicare il ketoprofene come analgesico pre-anestesia.

Quindi anestetizzarlo con un'iniezione nel quadrante inferiore. Dopo aver confermato l'anestesia con un pizzico di dita, tagliare i peli addominali, lubrificare gli occhi e posizionare il mouse per l'intervento chirurgico su un tampone avvolto con un asciugamano sterile foderato in polietilene. Pulire l'area chirurgica con tre scrub alternati di betadina e alcol.

Quindi drappeggia il topo, lasciando scoperto solo l'addome. Inizia l'intervento con una laparotomia della linea mediana. Praticare un'incisione da sotto lo xifoide alla regione sovrapubica.

Quindi spostare e avvolgere l'intestino con una garza inumidita con soluzione salina. Quindi eseguire una dissezione smussata del tessuto chiaro dall'aorta infrarenale e dalla vena cva. Bloccare i lati distali e i lati prossimali dell'aorta e della vena cva.

Una volta serrati senza mezzi termini, separare i due recipienti. Ora procedi con l'impianto. Ora sezionare la vena cva e, se necessario, legare i rami dell'aorta addominale con un monofilamento da 10 nodi.

Sutura su aghi conici prima del transetto durante l'impianto. Sciacquare frequentemente l'innesto con una soluzione di eparina per prevenire la trombosi. Le prime due suture su entrambi i lati dell'innesto sono le fasi più importanti dell'intero processo.

Quando non sono posizionati con cura, è difficile separare gli strati anteriore e posteriore dell'IVC. Se gli strati non sono chiaramente identificati, c'è una maggiore possibilità di suturarli accidentalmente insieme. Tagliare il materiale dell'innesto in eccesso e fissare l'innesto con punti su entrambe le estremità.

Aggiungere quattro o cinque punti di sutura utilizzando 10 t. Sutura lungo il lato anteriore dell'innesto. Capovolgilo e fai lo stesso lungo la parte posteriore con l'impianto completo.

Rimuovere il morsetto prossimale e controllare l'emorragia con un agente emostatico assorbibile. Quando l'emorragia è completamente terminata, rimuovere il morsetto distale e ripetere il controllo dell'emorragia. Assicurati che il sangue scorra attraverso l'innesto prima che l'animale salga.

Utilizzando sei suture monofilamento di poliacrilammide nero au black. Chiudere la pelle in due strati. Ora inietta mezzo millilitro di soluzione salina per via sottocutanea per prevenire la disidratazione.

Quindi trasferire il mouse in una gabbia di recupero con un cuscinetto caldo Quando è ambulatorio, trasferire il mouse nella sua gabbia domestica e fornire ibuprogene per 48 ore. Un SEM dell'impalcatura mostra che il diametro interno è di circa un millimetro e lo spessore della parete è di circa 0,17 millimetri. La porosità dell'impalcatura era del 78,5% con una dimensione media dei pori di 45 micron.

Subito dopo l'impianto, l'innesto vascolare di ingegneria tissutale è stato osservato al microscopio. Due settimane dopo, è stato visto di nuovo. Ha ancora mantenuto la sua forma.

È chiaro che l'innesto si stava degradando e gradualmente è stato sostituito con nuovo tessuto. Durante le due settimane di semina cellulare, infatti, ha migliorato la pervietà dell'innesto del 25%: l'innesto è stato rimosso per l'analisi istologica. La colorazione H e d ha rivelato tessuto neo in tutta l'impalcatura, una macchia con cuori e massoni.

Trireme ha mostrato elastina negli strati intimali e ha mostrato collagene negli strati mediali. La colorazione CD 31 ha rivelato un rivestimento delle cellule endoteliali nello strato inale. La colorazione alfa SMA ha mostrato che l'innesto era popolato anche da muscolatura liscia confluente.

Anche l'infiltrazione dei macrofagi era evidente, come si vede dalla colorazione F 4 80. Alla fine di questo video, dovresti avere una migliore comprensione di come produrre un innesto vascolare di ingegneria tissutale su piccola scala, inclusi i metodi per la produzione di un'impalcatura biodegradabile su piccola scala per isolare le cellule mononucleate derivate dal midollo osseo e seminarle sull'impalcatura. E infine, dovremmo mostrarvi i metodi per l'utilizzo di tecniche microchirurgiche per impiantare l'innesto vascolare di ingegneria tissutale nel modello speculare.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30-45 minuti. Altri metodi, come l'impianto di innesti con interpretazione aortica, possono essere eseguiti in seguito per studiare lo sviluppo di innesti vascolari di ingegneria tissutale per la chirurgia di bypass coronarico. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di mantenere l'area chirurgica idratata e lavare frequentemente l'innesto per prevenire la trombosi acuta, queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare la formazione del tessuto ungueale e la prevenzione della stenosi nell'innesto vascolare di ingegneria tissutale.