Analisi completa di Trascrizione Dynamics da campioni di cervello seguito Behavioral Experience
26 agosto 2014
Questo manoscritto descrive un protocollo che applica un profilo completo per l'analisi di programmi trascrizionali indotti in specifici nuclei cerebrali di roditori seguendo paradigmi comportamentali. In questo articolo, questo approccio è illustrato nel contesto della profilazione dei geni indotti nel nucleo accumbens (NAc) dei topi in seguito all'esposizione acuta alla cocaina, utilizzando array microfluidici qPCR.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare la dinamica trascrizionale e nuclei cerebrali definiti nei topi in seguito a un'esperienza comportamentale. Questo viene ottenuto abituando innanzitutto gli animali e registrando la loro attività locomotoria dopo l'iniezione di soluzione fisiologica. Una volta abituati, l'attività locomotoria viene registrata dopo una singola dose di cocaina, quindi vengono prelevati campioni dal nucleo accumbens e utilizzati per l'isolamento dell'RNA e la preparazione del cDNA.
Successivamente viene effettuata un'analisi di QPCR al fine di studiare l'espressione genica indotta dal comportamento. Alla fine, si ottengono risultati che mostrano la dinamica trascrizionale successiva all'esperienza con la cocaina. Il protocollo sarà dimostrato dal Dottor Hatu, responsabile del laboratorio, da Dum Muer, studente laureando del laboratorio, e da Duran, studente universitario del laboratorio. Per tre giorni consecutivi, ogni topo viene abituato alle procedure di manipolazione e iniezione; i topi vengono organizzati in gabbie prima di iniziare l'esperimento, in modo che non debbano essere trasferiti tra gabbie in seguito e non rimangano mai in isolamento per un periodo prolungato di tempo.
Mezz'ora prima dell'inizio del test, tutte le gabbie sperimentali devono essere trasferite nella stanza comportamentale per consentire agli animali di ambientarsi. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di 250 microlitri di soluzione salina; immediatamente dopo l'iniezione, posizionare il topo in una camera comportamentale per monitorare l'attività locomotoria per 15 minuti. Il topo può essere posizionato nella camera comportamentale per 20 minuti.
Un'attività monitorata dal minuto due al minuto 17. Ripetere questi passaggi alla stessa ora della giornata per i due giorni successivi. Al quarto giorno, somministrare un'iniezione singola di cocaina o soluzione salina, a seconda del gruppo, e posizionare immediatamente il topo nella camera per monitorare l'attività motoria locale per 20 minuti in punti temporali selezionati dopo l'esposizione alla cocaina, quindi estrarre il cervello e immergerlo in una soluzione di liquido cefalorachidiano freddo per uno o due minuti per raffreddarlo e indurirlo.
Dopo aver rimosso il cervelletto ed essiccato il liquido in eccesso, incollare il cervello sulla piattaforma di un vibroslice con la parte rostrale rivolta verso l'alto. Riempire la camera con A CSF fredda con ghiaccio e tagliare sezioni di 200 micron fino a quando il nucleo accumbens viene chiaramente identificato. Prestare particolare attenzione alla forma del corpo calloso, alla posizione e alla forma della commessura anteriore e ai ventricoli durante il taglio.
Una volta identificata la regione corretta, tagliare due sezioni di 400 micron da cui verrà dissezionato il nucleo accumbens al microscopio stereoscopico. Utilizzare una lama sottile per dissezionare il nucleo accumbens dalle sezioni. Quattro passaggi rapidi della lama nella zona corretta dovrebbero isolare immediatamente il tessuto appropriato.
Posizionare il tessuto isolato in 900 microlitri di reagente di lisi e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione dell'RNA; iniziare scongelando le provette a 37 gradi Celsius ed eseguire l'omogeneizzazione. Utilizzando un ago da 25 gauge, i primi cicli potrebbero risultare difficili e richiedere di spingere il tessuto contro la parete della provetta per ridurlo in piccoli frammenti. Per garantire un'adeguata omogeneizzazione, trasferire il lisato su una colonna mini spin shredder kaya ed effettuare una centrifugazione.
Trasferire il lisato in un nuovo tubo da microcentrifuga ed estrarre l'RNA seguendo le istruzioni del produttore. Dopo la purificazione dell'RNA, si esegue la trascrizione inversa in CDNA e l'amplificazione preliminare specifica per il bersaglio dei campioni mediante primer diretti contro il gruppo di geni scelto per l'analisi. Queste procedure sono descritte nella versione testuale del protocollo.
Chip microfluidici commerciali per l'analisi completa di QPCR sono disponibili in formato 48 per 48, che consente l'analisi di 48 campioni con 48 set di sonde, oppure in formato 96 per 96, in cui vengono analizzati 96 campioni con 96 sonde. Nella maggior parte dei casi, la scelta del chip dipende principalmente dal numero di campioni da analizzare.
Preparare innanzitutto la miscela campione in base al chip scelto per l'esperimento. Prestare attenzione durante la pipettatura del reagente di caricamento del campione con colorante 20 XDNA. Agitare le soluzioni della miscela campione per un minimo di 20 secondi e centrifugare per almeno 30 secondi.
Le reazioni preparate possono essere conservate per brevi periodi a quattro gradi Celsius fino a quando il chip non è pronto per il caricamento. Successivamente, preparare il mix del saggio, agitare accuratamente il mix del campione e centrifugare per far sedimentare tutti i componenti. Come mostrato in precedenza, il chip IFC per array dinamico presenta ingressi per campioni e saggi, nonché ingressi specificati per il fluido della linea di controllo utilizzato per pressurizzare le camere microfluidiche.
Per prima cosa, iniettare il fluido della linea di controllo in ciascun accumulatore sul chip. Successivamente, preparare il chip posizionandolo nel controller IFC ed eseguendo lo script appropriato. Al termine dello script, rimuovere il chip preparato dal controller IFC e pipettare cinque microlitri di ogni saggio.
Mescolare sulla chip. Aggiungere cinque microlitri di ciascuna miscela di campione nei rispettivi ingressi e reinserire la chip nel controller IFC utilizzando il software del controller IFC. Eseguire lo script per caricare i campioni e i saggi sulla chip.
Al termine dello script di caricamento, rimuovere il chip caricato dal controller IFC. Successivamente, posizionare il chip sul termociclatore e creare una nuova esecuzione del chip che includa un'analisi della curva di denaturazione. Mediante il software del termociclatore, verificare che le camere di reazione siano riconosciute correttamente e permettere al protocollo di completarsi.
Un aumento dell'attività locomotoria è stato evidente dopo una singola iniezione acuta di cocaina. In questa sezione coronale, linee bianche spesse indicavano la posizione dei tagli effettuati per definire i confini del nucleo accumbens. Durante la dissezione, le curve di amplificazione di primer diretti contro CFOs e phos B dimostrano che le coppie di primer amplificano il trascritto bersaglio con un'efficienza di circa 100%.
In ogni ciclo, i risultati mostrano che l'espressione di CFO e di phos B indotta dalla cocaina nel nucleo accumbens era massima una e due ore dopo l'esposizione. Successivamente a questa procedura, altri metodi come il sequenziamento di nuova generazione possono essere eseguiti al fine di identificare trascritti nuovi e non ancora caratterizzati.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive un protocollo per analizzare programmi trascrizionali in nuclei cerebrali specifici di roditori a seguito di paradigmi comportamentali. L'approccio viene illustrato mediante il profilo dei geni indotti nel nucleo accumbens (NAc) di topi dopo un'esposizione acuta alla cocaina.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi del comportamento
- Profilazione dell'espressione genica
Sfondo
- La dinamica trascrizionale è fondamentale per comprendere le risposte cerebrali al comportamento.
- Il nucleo accumbens è una regione chiave coinvolta nella ricompensa e nelle dipendenze.
- L'esposizione alla cocaina altera l'espressione genica nel cervello.
- Gli array microfluidici di qPCR permettono un profilo genico dettagliato.
Scopo dello studio
- Studiare i cambiamenti trascrizionali nel nucleo accumbens in seguito all'esposizione alla cocaina.
- Stabilire un protocollo per l'isolamento dell'RNA e l'analisi dell'espressione genica.
- Comprendere l'impatto comportamentale sull'espressione genica nei roditori.
Metodi Utilizzati
- Abituazione dei topi al manipolamento e all'iniezione di soluzione fisiologica.
- Registrazione dell'attività locomotoria dopo la somministrazione di cocaina.
- Prelievo di campioni del nucleo accumbens per l'isolamento dell'RNA.
- Analisi di QPCR per valutare le variazioni nell'espressione genica.
Risultati principali
- Sono state osservate dinamiche trascrizionali in seguito all'esposizione alla cocaina.
- Sono stati identificati geni specifici indotti nel nucleo accumbens (NAc).
- Il protocollo ha dimostrato un efficace profilo dell'espressione genica.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della base molecolare della dipendenza.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un protocollo solido per analizzare l'espressione genica in risposta a stimoli comportamentali.
- I risultati arricchiscono la conoscenza delle risposte trascrizionali nella ricerca sulle dipendenze.
- Questo approccio può essere applicato ad altri paradigmi comportamentali nelle neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Management
Questo protocollo consente ai team di ricerca e sviluppo della biotecnologia farmaceutica di valutare quantitativamente la dinamica trascrizionale in regioni cerebrali definite a seguito di perturbazioni comportamentali o farmacologiche, supportando la validazione di bersagli nella scoperta di farmaci neuropsichiatrici. Fornendo letture riproducibili ed quantitative dell'espressione genica a partire da campioni tissutali limitati, aumenta la fiducia predittiva negli studi meccanicistici in fase iniziale e orienta le decisioni di avanzamento o interruzione per terapie mirate al sistema nervoso centrale. L'approccio è particolarmente utile per ridurre i rischi associati alle ipotesi riguardanti l'addiction, le vie della ricompensa e i fenotipi comportamentali prima di investire nell'ottimizzazione del composto leader.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei programmi trascrizionali nel nucleo accumbens per validare la rilevanza funzionale dei geni implicati nelle risposte comportamentali indotte dalla cocaina.
- Valore operativo: Permette test robusti di ipotesi mirate mediante qPCR microfluidica per quantificare variazioni dell'espressione genica con elevata sensibilità, partendo da quantità limitate di tessuto cerebrale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo profili trascrizionali di base a seguito di una sfida farmacologica acuta.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso protocolli standardizzati di isolamento dell'RNA, trascrizione inversa e analisi di qPCR in microfluidica applicabili a numerosi campioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce letture trascrizionali rilevanti per la malattia in un modello ben consolidato di risposta a psicostimolanti, supportando l'allineamento dei biomarcatori e la riduzione del rischio meccanicistico.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo dati quantitativi di espressione genica multiplex adatti alla conferma su piattaforme diverse.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, sostenendo la validazione dell'obiettivo guidata da ipotesi e lo sviluppo di saggi prima degli sforzi di identificazione del composto leader nei programmi di scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale.
- Biologia della Scoperta: Consente l'analisi meccanicistica della dinamica trascrizionale successiva a un'esperienza comportamentale, favorendo la chiarificazione dei percorsi e la riduzione del rischio dei bersagli.
- Screening: Genera output quantitativi e multiplex che supportano la prontezza e la riproducibilità del saggio per campagne di screening di composti.
- Analisi: Fornisce misurazioni di espressione genica normalizzate ottenute da array microfluidici di qPCR, abilitando il confronto statistico tra diverse condizioni sperimentali e punti temporali.
- Ricerca Translazionale: Collega le risposte comportamentali acute a firme molecolari nei circuiti della ricompensa, sostenendo la validità traslazionale nei modelli di dipendenza.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di profilazione trascrizionale applicabile a diversi paradigmi comportamentali e sfide farmacologiche nella ricerca neuroscientifica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi collegando fenotipi comportamentali a risposte trascrizionali definite in regioni cerebrali chiave.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità dell'analisi dell'espressione genica attraverso protocolli standardizzati di qPCR in microfluidica adatti all'elaborazione di più campioni.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei rischi associati agli obiettivi del sistema nervoso centrale grazie a informazioni meccanicistiche prima dell'onerosa ottimizzazione del composto leader.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli corretta per il rischio fornendo evidenze quantitative dell'attivazione del percorso a seguito di una sfida farmacologica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di neuroscienze, inclusi test comportamentali, dissezione del cervello e manipolazione dell'RNA.
- Richiede l'accesso a piattaforme di qPCR microfluidiche e strumentazione associata per il profilo genico ad alto rendimento.
- Necessita di protocolli standardizzati per la raccolta dei campioni, l'isolamento dell'RNA e la sintesi del cDNA per garantire coerenza tra esperimenti.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il protocollo a diverse regioni cerebrali, specie o paradigmi comportamentali diversi dalle risposte del nucleo accumbens indotte dalla cocaina.
- I limiti pratici includono i vincoli nella resa del tessuto proveniente da nuclei cerebrali piccoli e la necessità di una accurata normalizzazione per tenere conto della variabilità tra campioni.
