Name: Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Impara l'aspirazione del midollo osseo femorale nei topi vivi per studi longitudinali ematologici. Questo metodo non letale consente campionamenti seriali e analisi citometriche ripetute nel tempo.

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O.A.-W. è supportato da un NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), da un U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research (W81XWH-12-1-0041), dal Josie Roberston Investigator Program, e da un Damon Runyon Clinical Investigator Award con il supporto della Evan's Foundation.

Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono state condotte in conformità con le Linee guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUCs) al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. 1. Aspirazione del midollo osseo (BM) Cellule del femore <ol><li> Anestetizzare il mouse che subirà femorale aspirazione del midollo osseo con isoflurano (1-4%), somministrato con un vaporizzatore di precisione. Profondità dell&#39;anestesia deve essere controllata ogni 5-10 minuti durante tutta la procedura osservando che non vi è alcun cambiamento nella frequenza respiratoria associata manipolazione chirurgica e / o l&#39;orecchio, punta e coda pinch. L&#39;anestesia viene indotta con isoflurano e inoltre mantenuto durante tutta la procedura con isoflurano. Una dose pre-procedurale preventivo di buprenorfina alla dose di 0,05-0,1 mg / kg per via sottocutanea ogni 6-12 ore può essere utilizzato per prevenire il dolore associato alla procedura come aggUNCTAD al Carprofene. </li><li> Applicare pomata oftalmica agli occhi del topo dopo induzione di anestesia per evitare l&#39;essiccazione della cornea. </li><li> La pelliccia viene accuratamente ritagliato da una zona di pelle circa il 150% più grande dell&#39;area del sito aspirazione previsto. Pelliccia sciolto viene rimosso con una garza umida. Si prega di tenere il mouse su un tappetino acqua calda circolante o altro cassaforte superficie controllo termostatico per evitare l&#39;ipotermia durante la procedura. </li><li> Disinfettare tutta la gamba contenente il femore, che sarà oggetto di aspirazione con tre serie di scrub alternati (alternati sia con un povidone-iodio (Betadine) o clorexidina (clorexidina) scrub e il 70% di alcool isopropilico o etanolo al 70% imbevuto spugne garza). </li><li> Bagnate un 0,5 ml tubercolina siringa (volume: 0,5 cc; calibro: 27,5 G) con sterile tampone fosfato salino (PBS) prima di aspirare il BM. Riempire la siringa con 200-500 ml di PBS ed espellere immediatamente la PBS. Ripetere questa procedura 2-3 tIME. </li><li> Mantenere la tibia piegato dal femore spingendo la tibia o con il dito anulare o il quinto dito. Verificare che un aereo anestetico adatto è stato raggiunto. La siringa viene tenuto con il pollice e il dito indice. Questo permette ai condili esposto e facilita l&#39;inserimento dell&#39;ago. </li><li> Dopo la bagnatura dei siringa inserire l&#39;ago attraverso il tendine rotuleo modo che l&#39;ago è presentata in modo sicuro tra i due condili del femore. Mantenendo il diafisi vicino alla epifisi del femore con il pollice e l&#39;indice, l&#39;ago viene inserito facilmente nel pozzo del femore. </li><li> Ruotare l&#39;ago verso l&#39;esterno e verso l&#39;alto in modo da essere parallela all&#39;albero del femore. Questa azione facilita il recupero del contenuto di midollo osseo dall&#39;albero femore. </li><li> Girare l&#39;ago in senso orario e antiorario mentre si spinge lentamente nella cavità midollare del femore. Confermare il corretto posizionamento dell&#39;ago spostando delicatamente il syRinge lateralmente. </li><li> Estrarre delicatamente il pistone dell&#39;ago, creando una pressione negativa, mentre si muove l&#39;ago avanti e indietro all&#39;interno della cavità BM. Nota: Il volume di BM aspirato sarà di circa 5 ml, che in genere corrisponde a 0,4-0,8 x 10 6 cellule mononucleari. Aspirazione successo sarà confermata visivamente dalla comparsa di sangue nel superiore dell&#39;ago nella base della siringa. Se nessun sangue è visto nella siringa è probabile che un piccolo frammento osseo o tessuto viene bloccato nell&#39;ago. Questo può essere rimosso dall&#39;ago spostando lo stantuffo su e giù in PBS (questa è una delle ragioni per cui la siringa deve essere riempito con PBS prima aspirazione del BM). Se il tessuto non poter essere rimosse dalla siringa, utilizzare un nuovo ago e siringa (bagnare nuovamente la siringa con 200-500 ml di PBS). </li><li> Una volta BM viene aspirato con successo dal femore, rimuovere l&#39;ago e la siringa dal femore e il mouse. </li><li> Spostare aspirato BM per un pr provetta per microcentrifugaefilled con 500 microlitri di PBS. Per la maggior parte delle applicazioni, le cellule BM devono poi essere tenuti in ghiaccio fino a ulteriore lavorazione, se possibile. </li><li> A seguito del completamento della procedura, somministrare analgesici con carprofene 5 mg / kg per via sottocutanea. Quindi rimuovere mouse dalla anestesia e mettere su un tappetino riscaldato fino pienamente recuperato. NOTA: Non ci dovrebbero essere complicazioni o disagio vissuto seguendo la procedura di aspirazione, se fatto correttamente. </li><li> Prima di tornare topi per la zona abitativa, verificare che siano in grado di deambulare e raggiungere cibo e acqua. Osservare il mouse per segni di sofferenza o di procedura di post infezione nella prossima 24 ore. I segni includono: emorragia costante, anemia, letargia. Se uno qualsiasi di questi segni sono visti procedura di post, l&#39;animale (s) deve essere eutanasia. Nota: BM aspirazione / campionamento può essere ripetuto ma la procedura di ripetizione deve essere eseguita sul femore opposto per evitare traumi ripetuti alla stessa gamba. Ci sono poche informazioni disponibili in merito alla frequency che l&#39;aspirazione BM può essere eseguita. Femorale aspirazione del midollo osseo è generalmente ripetuta non più spesso di una volta ogni due settimane. </li></ol> 2. Valutazione del contenuto cellulare in cellule Aspirato BM <ol><li> Cellule pellet recuperati da BM di aspirazione e posto in una provetta per microcentrifuga per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C o RT. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di ACK rosso sangue tampone di lisi cellulare (&quot;ammonio-cloruro di potassio&quot; tampone di lisi). </li><li> Incubare le cellule in tampone di lisi dei globuli rossi per 10 min e poi aggiungere 1 ml di PBS e centrifugare la miscela di nuovo a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C o RT. Nota: Il pellet lisato globuli rossi ora consiste di cellule mononucleate BM. Questi possono essere risospese per FACS colorazione, conteggio delle cellule, il trapianto, l&#39;analisi cytospin e / o di ogni altro uso (come sarebbero stati utilizzati cellule midollari raccolte da topi sacrificati). </li></ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Serial BM aspirazione è una procedura di routine fondamentale per indagine clinica dei disturbi ematologici negli esseri umani. La possibilità di eseguire un campionamento seriale analogo di BM in topi per la caratterizzazione della composizione cellulare e costituenti di BM tutta esperimenti lunghi è anche molto importante. Questa procedura è utile per la caratterizzazione di HSPC, senza perdere il mouse ma anche per rilevare la presenza di tipi cellulari aggiuntivi nel BM nei casi in cui il contenuto del sangue perife...

Tutte le cellule del sangue derivano da cellule staminali ematopoietiche (HSC). Le procedure che consentono l'accesso al midollo osseo (BM), la sede della stragrande maggioranza delle HSC nei topi e negli uomini, senza richiedere il sacrificio di animali, forniscono una risorsa per monitorare la fonte dell'emopoiesi in modo seriale. L'obiettivo generale della procedura qui descritta è quello di fornire un protocollo dettagliato per il campionamento di cellule midollari dal femore di topi vivi che fornisca materiale rappresentativo delle cellule che verrebbe recuperato dalla raccolta convenzionale di cellule midollari attraverso il sacrificio dei topi. Il vantaggio di questa procedura rispetto alla raccolta convenzionale di cellule BM è che questa procedura non richiede il sacrificio dei topi e quindi consente lo studio longitudinale del compartimento del midollo osseo dei topi nel tempo. 
Sebbene questa procedura di aspirazione del midollo osseo murino sia stata utilizzata in numerosi studi e descritta in precedenza (vedi Sundberg et al. Per una rassegna storica1), le procedure formali passo-passo che illustrano questa tecnica non sono state pubblicate in precedenza. Questo protocollo consente il campionamento seriale di routine del midollo osseo per scopi quali la valutazione dell'attecchimento nel midollo osseo di cellule introdotte esogenamente nel topo (come verrebbe fatto negli studi sugli xenotrapianti, ad esempio2,3), l'analisi del chimerismo nel midollo spinoso per il confronto con quello del sangue periferico (dove i risultati non sono necessariamente congruenti), il monitoraggio dell'abbondanza di specifici tipi di cellule normalmente arricchite nel midollo come le cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici, e recupero di cellule BM per coltura ex vivo e/o trapianto. Inoltre, la valutazione del contenuto del midollo può essere molto utile nei modelli murini di malattia ematologica poiché l'aspirazione è utile per valutare il carico di malattia ematologica in momenti in cui la malattia potrebbe non essere evidente nel sangue periferico3-5. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per valutare la risposta della malattia ematologica nel midollo ai farmaci somministrati in studi terapeutici. Pertanto, la procedura qui descritta è ideale per i ricercatori che desiderano ottenere l'accesso alle cellule ematopoietiche del midollo osseo dai topi per l'analisi citologica, l'analisi citofluorimetrica, la coltura in vitro e/o gli studi di trapianto in vivo senza richiedere sacrifici o danni ai topi. 
Il protocollo per il campionamento del midollo osseo qui descritto è abbastanza simile alla tecnica utilizzata per l'iniezione intra-femorale di materiale direttamente nella cavità midollare3,6. La differenza fondamentale è che questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per la rimozione delle cellule dal midollo invece di instillare il materiale direttamente nello spazio della cavità del midollo come avviene con l'iniezione intrafemorale.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampone di lisi</td><td>Fatto in casa</td><td></td><td>in 1 L. Regolare il pH 7,2 ~ 7,4 e filtrare sterile con 0,22 &mu; m filtro sottovuoto.</td></tr><tr><td>8,3 g Cloruro di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 g Bicarbonato di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 0,5 M EDTA pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Siringa per tubercolina 27,5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per cellule sterili 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Attane</td><td>NDC:66794-014-25</td><td></td></tr><tr><td>Ago con estremità smussata</td><td>Stemcell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>Ago PrecisionGlide 23 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 3 ml Punta Luer-Lok</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Piastra trattata con coltura non tissutale, 6 pozzetti</td><td>Becton Dickinson</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml tubi&nbsp;</td><td>Colorazione FACS Becton Dickinson</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>12 provette da 5 ml da 75 mm con tappo</td> filtrante <td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>colorazione FACS</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100222</tr><tr><td>Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-KIT) PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>122513</tr><tr><td>CD34 APC</td><td>Biolegend</td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16/32 e450</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>Per coltura di metocellulosa</td></tr><tr><td>Carprofene</td><td>Crescent Chemical Azienda</td><td>C11045850</td><td>1 dose (5 mg/kg)&nbsp;</td></tr><tr><td>Citometro a flusso, LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube unguento veterinario (unguento oftalmico sterile per petrolatino)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

femorale aspirazione del midollo osseo in live mice

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Il campionamento seriale della composizione cellulare del midollo osseo (BM) è una procedura di routine fondamentale per l'ematologia clinica. Questo protocollo descrive una dettagliata procedura tecnica passo-passo per una procedura analoga in topi vivi che consente la caratterizzazione seriale delle cellule presenti nel midollo osseo. Questa procedura facilita gli studi volti a rilevare la presenza di cellule somministrate esogenamente all'interno del midollo osseo dei topi, come ad esempio negli studi sugli xenotrapianti. Inoltre, questa procedura consente il recupero e la caratterizzazione di cellule arricchite nel midollo osseo come le cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici (HSPC) senza sacrificare i topi. Dato che la composizione cellulare del sangue periferico non riflette necessariamente le proporzioni e i tipi di cellule staminali e progenitrici presenti nel midollo, le procedure che forniscono l'accesso a questo compartimento senza richiedere l'interruzione dei topi sono molto utili. L'uso dell'aspirazione del midollo osseo femorale è illustrato qui per l'analisi citologica delle cellule del midollo, la caratterizzazione citofluorimetrica del compartimento staminale/progenitore ematopoietico e la coltura di HSPC selezionate ottenute mediante aspirazione del midollo osseo femorale rispetto al prelievo convenzionale del midollo.

Femorale BM aspirazione di un topo C57/B6 vivo è stato utilizzato per ottenere cellule mononucleate BM seguono convenzionale raccolto BM del mouse stesso dopo il sacrificio. Cellule mononucleate BM ottenuti con i due metodi sono stati poi analizzati mediante (1) analisi citologica delle cellule BM, (2) determinare la frequenza relativa di cellule staminali / progenitrici ematopoietiche (HSPCs), e (3) ex vivo di cultura HSPCs ordinati. Nel secondo esperimento, lignaggio negativo SCA1 + c-KIT + (LSK) sono state f...

Questo protocollo descrive una procedura per il campionamento seriale del midollo osseo femorale (BM) senza richiedere il sacrificio di topi. Questa procedura facilita gli studi longitudinali della composizione del midollo osseo dei topi nel tempo e fornisce un accesso seriale alle cellule all'interno del midollo osseo per studi ex vivo e di trapianto.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

L'obiettivo generale di questa procedura è aspirare in modo sicuro il contenuto di cellule ematopoietiche dal midollo femorale di un topo vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto riempiendo una siringa da tubercolina con PBS. Nel secondo passaggio, la zampa del topo viene posizionata con attenzione all'angolo ottimale per il prelievo del midollo osseo.I globuli ematici vengono quindi aspirati dallo spazio midollare del femore e i globuli rossi vengono depleti. In definitiva, il successo dell'aspirazione del contenuto midollare può essere verificato mediante analisi citometriche e citologiche. A dimostrare la procedura sarà il giovane Rock Chung, un tecnico molto talentuoso del nostro laboratorio.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il prelievo convenzionale del midollo osseo, è che essa consente il recupero di una parte delle cellule ematopoietiche del midollo osseo lasciando l'animale in vita per ulteriori osservazioni e analisi seriali. F, dopo aver confermato la sedazione mediante pinzatura del dito del piede, applicare un unguento oftalmico sugli occhi del topo anestetizzato per prevenire l'essiccazione della cornea e rasare la zampa per esporre la pelle. La preparazione chirurgica sterile della pelle viene quindi eseguita strofinando la zona con disinfettante a base di clorexidina, seguito da una pulizia con alcol.Questo processo viene ripetuto tre volte e per ogni animale viene utilizzata una siringa sterile nuova e ancora sigillata con ago. Verificare che sia stato raggiunto un adeguato piano anestetico. Successivamente, inumidire una siringa da 0,5 millilitri per tubercolina con PBS sterile, quindi aspirare ed espellere immediatamente da 200 a 500 millilitri di soluzione salina da due a tre volte.Quindi utilizzare uno dei due ultimi dita di una mano per piegare delicatamente la tibia lontano dal femore, facilitando l'esposizione dello spazio condilare del femore e l'inserimento dell'ago. Inserire ora l'ago attraverso il tendine rotuleo in modo che si inserisca saldamente tra i due condili del femore. Utilizzare il pollice e l'indice dell'altra mano per tenere la diafisi vicino all'epifisi del femore, consentendo così un facile inserimento dell'ago nel canale medullare dell'osso.Se nel siringa non si vede sangue, è probabile che un piccolo frammento osseo o tessutale sia rimasto bloccato nell'ago. Questo può essere rimosso muovendo lo stantuffo su e giù in PBS. Se il tessuto non può essere dislodato dalla siringa, utilizzare un nuovo ago e una nuova siringa.Di nuovo, inumidire la siringa con 200-500 microlitri di PBS. Quindi ruotare l'ago in senso orario e antiorario mentre lo si spinge contro lo spazio condilare in modo che risulti parallelo al diafisi del femore. Per facilitare il recupero del contenuto midollare dalla diafisi del femore.Ruotare l'ago in senso orario e antiorario mentre lo si inserisce lentamente nella cavità midollare del femore. Confermare la corretta posizione dell'ago muovendo delicatamente la siringa lateralmente. Quindi tirare delicatamente indietro lo stantuffo della siringa, creando una pressione negativa mentre si muove l'ago avanti e indietro all'interno della cavità del midollo osseo.L'aspirazione riuscita sarà confermata dalla comparsa di sangue nella parte superiore dell'ago, alla base della siringa. Una volta aspirato con successo il midollo osseo dal femore, rimuovere l'ago dall'osso e trasferire il midollo osseo aspirato in una microprovetta precedentemente riempita con 500 microlitri di PBS su ghiaccio. Dopo aver somministrato l'analgesico, lasciare che il topo si riprenda sotto una lampada a calore prima di riportarlo nell'area di alloggio.Assicurarsi che siano in grado di deambulare e raggiungere cibo e acqua. Quindi reinserire il topo nella gabbia e osservare l'animale per segni di malessere o infezione nei 24 ore successive alla procedura. Nel frattempo, centrifugare le cellule del midollo osseo, aspirare con attenzione il PBS e risospendere il pellet.In 500 microlitri di tampone per la lisi dei globuli rossi dopo 10 minuti, lavare le cellule in un millilitro di PBS. Il pellet contiene midollo osseo di cellule mononucleate che possono essere utilizzate per l'analisi sperimentale. Queste prime figure illustrano come tipi e proporzioni simili di cellule totali e di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche possano essere osservati mediante analisi morfologica e citofluorimetria, utilizzando sia l'aspirato midollare femorale sia il prelievo convenzionale di midollo osseo.Qui viene mostrata la percentuale di popolazioni cellulari negative per il lineage, positive per SKA1, positive per C-kit e progenitrici mieloidi come frequenza rispetto al totale delle cellule vitali, ottenuta da tre aspirati indipendenti e da prelievi convenzionali di midollo. Questi dati rivelano una riduzione delle popolazioni progenitrici negative per il lineage, positive per SKA1, positive per C-kit e mieloidi nel midollo osseo ottenuto mediante aspirazione femorale, rispetto al prelievo convenzionale di midollo. Tale differenza non è risultata statisticamente significativa per la popolazione.Tuttavia, il sorting di cellule negative per la linea e positive per ska uno e positive per cki, seguito da coltura ex vivo in metilcellulosa, porta a un numero simile di colonie e tipi cellulari ottenuti mediante aspirato midollare femorale. Come nel prelievo convenzionale di midollo osseo, i tipi di colonie osservati e enumerati in entrambe le colture includono unità formanti colonie di granulociti, eritrociti, monociti e megacariociti, unità formanti colonie di granulociti e monociti e unità formanti burst eritroidi One master. Questa tecnica può essere eseguita in 10 minuti per topo se effettuata correttamente seguendo questa procedura.Altri metodi, come l'iniezione intrafemorale di midollo osseo, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quale sia l'effetto dello xenotrapianto di cellule ematopoietiche umane in topi immunocompromessi.

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Ricerca

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Medicina

I modelli animali sono spesso utilizzati per studiare metastasi alle ossa. In questo protocollo si descrivono due metodi comuni di inoculo del tumore per gli studi di metastasi ossee e descrivere brevemente alcune delle analisi utilizzati per monitorare e quantificare questi modelli.

Modelli di metastasi ossee

Questo video descrive un protocollo dettagliato per isolare il midollo osseo intero fresco dagli arti posteriori del topo per studiare i difetti dell'intero midollo osseo per i pazienti con malattie del sangue come la leucemia.

Raccolta del midollo osseo dall'arto posteriore del topo

I monociti sono regolatori chiave dell'immunità innata e svolgono un ruolo critico nel rinnovamento del sistema fagocitario mononucleare periferico e in caso di infiammazione. Questo manoscritto descrive la procedura di imaging in tempo reale del midollo osseo calvaria di topo per studiare il meccanismo di mobilizzazione dei monociti.

Monitoraggio midollo osseo di topo monociti<em&gt; In Vivo</em

Viene presentata una strategia per analizzare quantitativamente i dati istologici nel midollo osseo. La microscopia confocale di cellule marcate in fluorescenza in sezioni di tessuto produce immagini bidimensionali, che vengono analizzate automaticamente. Le analisi di co-localizzazione di diversi tipi di cellule vengono confrontate con i dati provenienti da immagini simulate, fornendo informazioni quantitative sulle interazioni cellulari.

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Il protocollo descrive un nuovo modello di camera a finestra del femore murino che può essere utilizzato per tracciare il movimento delle cellule nel midollo osseo femorale in vivo. La microscopia a fluorescenza multifotone intravitale viene utilizzata per visualizzare tre componenti del midollo osseo femorale (vascolarizzazione, matrice di collagene e neutrofili) nel tempo.

Femore finestra del modello Camera per<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

Il modello murino di frattura femorale chiusa è una potente piattaforma per studiare la frattura che guarisce e nuove strategie terapeutiche per accelerare la rigenerazione dell'osso. L'obiettivo del presente protocollo chirurgico è quello di generare fratture femorali chiuse unilaterale nei topi utilizzando un asta intramidollare in acciaio per stabilizzare il femore.

La generazione delle fratture chiuse femorale in topi: un modello per studiare la guarigione ossea

Qui, presentiamo un protocollo per elaborare il midollo osseo fresco (BM) isolato dal topo o dall'uomo per l'analisi di citometria di massa ad alta dimensione (Cytometria da Time-Of-Flight, CyTOF) delle cellule di filo neutrofilo.

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

Descriviamo tre metodi di trapianto di midollo osseo (BMT): BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione schermata e metodo BMT senza precondi condizionamento (BMT adottivo) per lo studio dell'ematopoiesi clonale nei modelli di topo.

Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

Questo protocollo descrive l'iniezione intrafemorale di alcune cellule staminali ematopoietiche o leucemiche, comprese le cellule geneticamente modificate, in modelli murini di xenotrapianto, che consentiranno non solo il trapianto rapido e sicuro di cellule, ma anche analisi seriali del midollo osseo.

Le iniezioni intrafemorali semplificate con topi vivi consentono un'analisi continua del midollo osseo

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Impara l'aspirazione del midollo osseo femorale nei topi vivi per studi longitudinali ematologici. Questo metodo non letale consente campionamenti seriali e analisi citometriche ripetute nel tempo.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

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