SIVQ-LCM protocollo per lo strumento ArcturusXT

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare l'analisi di immagini spazialmente invarianti, la quantizzazione vettoriale o SIVQ in combinazione con la MICRODISSEZIONE a cattura laser o LCM per identificare le caratteristiche tissutali di interesse ed eseguire rapidamente la microdissezione diretta. Ciò si ottiene acquisendo prima le immagini del tessuto bersaglio per SIVQ. Viene quindi eseguita l'analisi SIVQ e l'annotazione SIVQ viene importata nel dispositivo di microdissezione per l'elaborazione.

Infine, le cellule di interesse possono essere isolate mediante S-I-V-Q-L-C-M per l'analisi molecolare a valle. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che S-I-V-Q-L-C-M semplifica il processo di selezione e microdissezione di grandi aree target che altrimenti sarebbero impegnative e dispendiose in termini di tempo con le tradizionali tecniche di microdissezione a cattura laser. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Avi Rosenberg, un ricercatore clinico nel nostro laboratorio, per visualizzare i campioni di tessuto di interesse.

Per prima cosa, caricare i vetrini sul tavolino motorizzato dello strumento di microdissezione e avviare il relativo software. Quindi selezionare le caselle di controllo appropriate per designare le posizioni delle diapositive caricate e assicurarsi che i file di immagine acquisiti vengano salvati in formato JPEG. Regolare la luminosità e la messa a fuoco dell'immagine sullo schermo per ottimizzare la qualità dell'immagine.

Quindi, utilizzando la cassetta degli attrezzi di ispezione, ruotare il diffusore e impostare una luminosità della lampada di 60 e un guadagno della fotocamera di due 20. Nella finestra di panoramica, fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare, ricordare le impostazioni e salvare. Acquisisci un'immagine panoramica in miniatura del vetrino per fornire una tabella di marcia per il processo di dissezione.

Regola un ingrandimento e trova l'area di interesse. Quindi acquisisci un'immagine dell'area per l'analisi dell'algoritmo delle immagini acquisite. Inizia trasferendo le immagini nella cartella SIVQ.

Quindi aprire SIVQ e caricare l'immagine acquisita di interesse. Naviga nell'area di interesse e regola le dimensioni delle finestre di visualizzazione del riquadro di visualizzazione cinque e sei senza regolare l'ingrandimento dell'immagine. Quindi selezionare la dimensione del vettore dell'anello e il numero di anelli da utilizzare per l'analisi.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla funzione dell'immagine predicata da acquisire nella finestra della finestra della finestra sei, selezionare la mappa termica, quindi fare clic su Scansione su X per analizzare l'immagine. Quindi utilizzare la parte superiore delle due barre di scorrimento orizzontali per regolare la specificità vettoriale complessiva. Utilizzare la barra inferiore per aumentare la sensibilità dopo l'esecuzione della pelle.

Per aumentare l'area classificata come corrispondenza, deseleziona la casella della radio della mappa di calore per assicurarti che la mappa di calore SIVQ venga modificata in un colore rosso uniforme e aumentare la dimensione della vernice. Salva l'immagine facendo clic sul pulsante Salva immagine. Quindi converti l'output BMP in un formato di file JPEG.

Quindi utilizzare un editor esadecimale per riscrivere le coordinate posizionali trovate tra l'inizio dell'indicatore dell'immagine e il primo indicatore della tabella di quantizzazione definito nell'intestazione del file JPEG post-analisi dall'immagine dello strumento di dissezione originale prima di iniziare la micro dissezione. Posizionare la MICRODISSEZIONE di acquisizione laser o il cappuccio LCM al centro della regione di interesse in cui sono state acquisite le immagini per l'analisi SIVQ. Successivamente, dopo aver calibrato i laser UV e infrarossi, ottimizzare i parametri tra cui la durata della potenza, le posizioni del laser e la velocità di taglio UV.

Quindi apri il software di selezione automatica e importa l'immagine analizzata. Crea un nuovo file di analisi per addestrare il software di selezione automatizzata a riconoscere l'annotazione SIVQ. Ora seleziona le aree di sfondo contrassegnate dai quadrati blu dell'immagine analizzata SIVQ.

Quindi selezionare le regioni di interesse o R OIS contrassegnate dai cerchi rossi e fare clic su impara per generare il file di formazione. Copia le aree selezionate nell'immagine dal vivo. Per iniziare la microdissezione, selezionare la cassetta degli attrezzi per la microdissezione e scegliere i pulsanti appropriati per l'acquisizione a infrarossi o il taglio UV.

Al termine della dissezione, spostare il cappuccio LCM nella stazione di controllo qualità e acquisire un'immagine del campione sezionato. Infine, se i campioni desiderati sono stati sezionati con successo, fare clic sul pulsante della fase attuale e rimuovere il cappuccio LCM per avviare la procedura di estrazione molecolare per l'analisi a valle. In questo esperimento rappresentativo, una sezione di tessuto mammario umano incorporata in formalina fissata con paraffina è stata immunocolorante per citocheratina AE uno, AE tre utilizzando un protocollo standard di immunoistochimica.

Poiché questo tessuto non può essere fatto scivolare per la microdissezione, le cellule colorate immunoistochimicamente possono essere difficili da apprezzare visivamente. Pertanto, per fornire una migliore corrispondenza dell'indice e un'immagine migliore, gli xileni sono stati aggiunti alla sezione del tessuto per creare uno pseudo vetrino coprioggetti. È stata quindi acquisita un'immagine JPEG dell'area scivolata della pseudo copertina e importata in SIVQ per l'analisi dell'algoritmo.

L'utente ha selezionato una caratteristica dell'immagine predicata osservata come una macchia DAB marrone scuro ed è stato avviato l'algoritmo SIVQ per l'analisi dell'immagine. La mappa di calore SIVQ è stata quindi convertita in una vernice rossa riconosciuta dal software di selezione automatizzata e gli xileni sono stati lasciati evaporare. La mappa di calore SIVQ è stata quindi importata nel software di selezione automatizzata.

Infine, le cellule evidenziate sono state sezionate con il laser a infrarossi. Il tappo LCM è stato quindi spostato nella stazione di controllo qualità dello strumento di microdissezione e ispezionato visivamente per valutare il successo della dissezione. Anche il tessuto rimanente è stato ispezionato e la mappa di calore SIVQ è stata reimportata.

Per confermare ulteriormente l'efficienza della microdissezione, una volta padroneggiata, la S-I-V-Q-L-C-M può essere eseguita in pochi minuti per vetrino, fornendo rapidamente un input arricchito per una varietà di tecniche analitiche a valle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come implementare S-I-V-Q-L-C-M nel tuo flusso di lavoro di microdissezione.